抗体或其抗原结合片段，其制备方法及医药用途与流程

1.本发明涉及cll-1抗体或其抗原结合片段，进一步地，本发明涉及包含cdr区的cll-1全人源抗体或其抗原结合片段；本发明还涉及包含所述cll-1全人源抗体或其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为cll-1相关疾病诊断剂和治疗药物的用途。


背景技术：

2.急性骨髓性白血病(aml)是一种髓系造血干细胞异常增殖造成的恶性肿瘤，现有临床治疗方案主要为化疗。大部分aml患者在化疗后病情得到缓解，但多数在缓解后出现复发或者死亡。2005年，辉瑞公司研发的针对cd33的单克隆抗体偶联药物mylotary获批，成为第一个治疗aml的生物药物。但在后续研究中，mylotary未取得理想结果，于2010年从美国退市。尽管免疫疗法在许多恶性肿瘤中表现出优良的治疗效果，然而由于髓细胞的异质性和靶抗原的低特异性等原因，aml的研究步伐进展缓慢。目前，针对aml的治疗药物研发更多的集中在具有新颖作用机制的新靶点上。
3.c型凝集素样分子1(cll-1，也被称作clec12a/micl/dcal2)属于c型凝集素家族成员，该家族成员功能多样，诸如细胞粘附、信号传导以及在炎症和免疫应答中的作用。cll-1表达在多数aml的cd34
+
cd38-干细胞上，而正常人的cd34
+
cd38-干细胞不表达。因此，该细胞表面抗原可作为aml诊断的标志物，同时也揭示了其是作为治疗aml的理想靶点。目前，有关cll-1的开发策略主要集中在双特异性抗体以及car-t领域，且多处于早期研发阶段，仅有一款名为mcla-117(cd3/cll-1)的双特异性抗体正在进行i期临床研究。因此，有必要进一步开发具有更高活性、高亲和力和高稳定性的cll-1全人源抗体，以进行相关疾病的治疗研究和应用。
4.噬菌体展示技术近几年越来越多用于抗体发现，利用其技术开发一些治疗性单抗已用于临床治疗，如治疗关节炎等多种自身性免疫疾病的阿达木单抗，治疗系统性红斑狼疮的贝利木单抗，治疗多种肿瘤如非小细胞肺癌，胃癌，结肠癌，头颈癌的单抗如雷莫芦单抗、雷珠单抗、瑞西巴库等。
5.全人源天然噬菌体展示库，是人外周血细胞来源的mrna经逆转录成cdna构建的噬菌体文库，此文库容量丰富，免疫原性低，抗体筛选快速高效。该技术是将外源蛋白的编码基因整合在噬菌体基因组内，通过转录翻译将外源目的蛋白表达于噬菌体衣壳蛋白表面，通过固相-液相逐级降低抗原蛋白的浓度对噬菌体库筛选，挑选出亲和特异性阳性克隆，之后进行dna测序，利用序列特性克隆构建全长抗体，从而缩短了抗体早期发现的时间。根据抗原的来源不同，噬菌体展示库分为天然库和免疫库，又根据每种的展示文库所展示的蛋白不同，又可以分为fab片段、scfv、轻链、重链文库等等。


技术实现要素：

6.本发明利用全人源天然噬菌体展示库筛选出特异性的抗人cll-1的fab片段，再利用人天然fc骨架构建全人源抗人cll-1抗体。
7.本发明提供了一种抗cll-1抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区；其中，所述的重链可变区包含至少1个选自以下序列所示的hcdr1：seq id no:1、seq id no:7、seq id no:13、seq id no:19和seq id no:25；和至少1个选自如以下序列所示的hcdr2：hcdr2：seq id no:2、seq id no:8、seq id no:14、seq id no:20和seq id no:26；以及至少1个选自如以下序列所示的hcdr2：hcdr3：seq id no:3、seq id no:9、seq id no:15、seq id no:21、seq id no:27和seq id no:33，
8.所述的轻链可变区包含至少1个选自以下序列所示的lcdr1：seq id no:4、seq id no:10、seq id no:16、seq id no:22和seq id no:34；和至少1个选自如以下序列所示的lcdr2：seq id no:5、seq id no:11、seq id no:17、seq id no:23和seq id no:35；以及至少1个选自如以下序列所示的lcdr3：seq id no:6、seq id no:12、seq id no:18、seq id no:24、seq id no:30和seq id no:36。
9.本发明还涉及一种优选方案，根据本发明提供的抗cll-1抗体或其抗原结合片段，其中所述的重链可变区包含：
10.分别如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
11.或，分别如seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
12.或，分别如seq id no:13、seq id no:14和seq id no:15所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
13.或，分别如seq id no:19、seq id no:20和seq id no:21所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
14.或，分别如seq id no:25、seq id no:26和seq id no:27所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3；
15.或，分别如seq id no:7、seq id no:8和seq id no:33所示的hcdr1、hcdr2和hcdr3。
16.本发明还涉及一种优选方案，根据本发明提供的抗cll-1抗体或其抗原结合片段，其中所述的轻链可变区包含：
17.分别如seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；
18.或，分别如seq id no:10、seq id no:11和seq id no:12所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；
19.或，分别如seq id no:16、seq id no:17和seq id no:18所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；
20.或，分别如seq id no:22、seq id no:23和seq id no:24所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；
21.或，分别如seq id no:16、seq id no:5和seq id no:30所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3；
22.或，分别如seq id no:34、seq id no:35和seq id no:36所示的lcdr1、lcdr2和lcdr3。
23.本发明还涉及一种优选方案，根据本发明提供的的抗cll-1抗体或其抗原结合片段，其中：
24.所述重链可变区包含如seq id no:1所示的hcdr1、seq id no:2所示的hcdr2和seq id no:3所示的hcdr3，以及所述轻链可变区包含如seq id no:4所示的lcdr1、seq id no:5所示的lcdr2和seq id no:6所示的lcdr3；或，
25.所述重链可变区包含如seq id no:7所示的hcdr1、seq id no:8所示的hcdr2和seq id no:9所示的hcdr3；以及所述的抗体轻链可变区包含如seq id no:10所示的lcdr1、seq id no:11所示的lcdr2和seq id no:12所示的lcdr3；或
26.所述重链可变区包含如seq id no:13所示的hcdr1、seq id no:14所示的hcdr2和seq id no:15所示的hcdr3；以及所述的抗体轻链可变区包含如seq id no:16所示的lcdr1、seq id no:17所示的lcdr2和seq id no:18所示的lcdr3；或
27.所述重链可变区包含如seq id no:19所示的hcdr1、seq id no:20所示的hcdr2和seq id no:21所示的hcdr3；以及所述的抗体轻链可变区包含：seq id no:22所示的lcdr1、seq id no:23所示的lcdr2和seq id no:24所示的lcdr3；或
28.所述重链可变区包含如seq id no:25所示的hcdr1、seq id no:26所示的hcdr2和seq id no:27所示的hcdr3；以及所述的抗体轻链可变区包含如seq id no:16所示的lcdr1、seq id no:5所示的lcdr2和seq id no:30所示的lcdr3；或
29.所述重链可变区包含如seq id no:7所示的hcdr1、seq id no:8所示的hcdr2和seq id no:33所示的hcdr3；以及所述的抗体轻链可变区包含：seq id no:34所示的lcdr1、seq id no:35所示的lcdr2和seq id no:36所示的lcdr3。
30.本发明还涉及一种优选方案，根据本发明提供的抗cll-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗cll-1抗体或其抗原结合片段包含选自以下序列所示的重链可变区，或与以下序列相比具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链可变区：seq id no:37、seq id no:39、seq id no:41、seq id no:43、seq id no:45或seq id no:47，
31.本发明还涉及一种优选方案，根据本发明提供的抗cll-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗cll-1抗体或其抗原结合片段包含选自以下序列所示的轻链可变区，或与以下序列相比具有至少70％，75％，80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链可变区：seq id no:38、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44、seq id no:46或seq id no:48。
32.本发明还涉及一种优选方案，根据本发明提供的抗cll-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗cll-1抗体或其抗原结合片段含：
33.seq id no:37所示的重链可变区和seq id no:38所示的轻链可变区；或，
34.seq id no:39所示的重链可变区和seq id no:40所示的轻链可变区；或，
35.seq id no:41所示的重链可变区和seq id no:42所示的轻链可变区；或，
36.seq id no:43所示的重链可变区和seq id no:44所示的轻链可变区；或，
37.seq id no:45所示的重链可变区和seq id no:46所示的轻链可变区；或，
38.seq id no:47所示的重链可变区和seq id no:48所示的轻链可变区。
39.本发明还涉及一种优选方案，根据本发明提供的抗cll-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗cll-1抗体或其抗原结合片段进一步包含源自人igg1、igg2、igg3或igg4或其变体的重链恒定区；
40.优选地，所述抗cll-1抗体或其抗原结合片段进一步包含源自人igg1或其变体的重链恒定区；
41.更优选地，所述抗cll-1抗体或其抗原结合片段进一步包含如seq id no:28所示的重链恒定区。
42.本发明还涉及一种优选方案，根据本发明提供的抗cll-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗cll-1抗体或其抗原结合片段包含进一步包含源自人抗体κ链、λ链或其变体的轻链恒定区；
43.优选地，所述抗cll-1抗体或其抗原结合片段进一步包含源自人抗体κ链、λ链的轻链恒定区；
44.进一步优选地，所述抗cll-1抗体或其抗原结合片段进一步包含如seq id no:29或seq id no:31所示的轻链恒定区。
45.本发明还涉及一种优选方案，根据本发明提供的抗cll-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗cll-1抗体或其抗原结合片段包含选自如下序列所示的重链，或与以下序列相比具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的重链：seq id no:49、seq id no:51、seq id no:53、seq id no:55、seq id no:57或seq id no:59。
46.本发明还涉及一种优选方案，根据本发明提供的抗cll-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗cll-1抗体或其抗原结合片段包含选自如下序列所示的轻链，或与以下序列相比具有至少80％，85％，90％，95％或99％同一性的轻链：seq id no:50、seq id no:52、seq id no:54、seq id no:56、seq id no:58或seq id no:60。
47.本发明还涉及一种优选方案，根据本发明提供的抗cll-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗cll-1抗体包含：
48.seq id no:49所示的重链和seq id no:50所示的轻链；或
49.seq id no:51所示的重链和seq id no:52所示的轻链；或
50.seq id no:53所示的重链和seq id no:54所示的轻链；或
51.seq id no:55所示的重链和seq id no:56所示的轻链；或
52.seq id no:57所示的重链和seq id no:58所示的轻链；或
53.seq id no:59所示的重链和seq id no:60所示的轻链。
54.本发明还涉及一种优选方案，根据本发明提供的抗cll-1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗cll-1抗体或其抗原结合片段选自全人源抗体或其抗原结合片段。
55.本发明进一步提供一种多核苷酸，其编码上述的抗cll-1抗体或其抗原结合片段。
56.本发明进一步提供一种表达载体，其含有上述的多核苷酸。
57.本发明进一步提供一种宿主细胞，其导入或含有上述的表达载体。
58.在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的宿主细胞，其中所述的宿主细胞选自细菌、酵母菌或哺乳动物细胞；其中，所述细菌优选大肠杆菌、所述酵母菌毕赤酵母、所述哺乳动物细胞优选cho细胞或hek293细胞。
59.本发明进一步提供一种生产抗cll-1全人源抗体或其抗原结合片段的方法，包括步骤：
60.a)培养本发明所述的宿主细胞；
61.b)从培养物中分离抗体或其抗原结合片段；以及，
62.c)对步骤b)中的抗体或其抗原结合片段进行纯化。
63.本发明进一步提供一种药物组合物，其含有本发明的抗cll-1抗体或其抗原结合
片段、以及可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
64.本发明进一步提供一种检测或诊断试剂盒，其含有本发明的抗cll-1抗体或其抗原结合片段，任选地，所述检测或诊断试剂盒还包含一种或多种能检测抗cll-1抗体或其抗原结合片段与cll-1结合的试剂。
65.本发明进一步提供一种检测或诊断试剂盒，其含有本发明的抗cll-1抗体或其抗原结合片段以及可用于检测或诊断的赋形剂、稀释剂或载体。
66.在本发明一个优选的实施方案中，提供了一种本发明抗cll-1抗体或其抗原结合片段，或本发明药物组合物在制备用于治疗或预防cll-1介导的疾病或病症的药物中的用途。
67.在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的抗cll-1抗体或其抗原结合片段，或本发明提供的药物组合物在制备试剂盒中的用途，其中所述试剂盒用于检测、诊断、预后cll-1介导的疾病或病症。
68.在本发明一个优选的实施方案中，根据本发明提供的用途，其中：
69.所述的疾病或病症为骨髓增生性疾病；
70.优选急性骨髓性白血病(aml)、慢性骨髓性白血病(cml)、慢性骨髓单核细胞性白血病(cmml)、骨髓增生异常综合征(mds)、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维变性。
71.在本发明一个优选的实施方案中，提供了一种本发明抗cll-1抗体或其抗原结合片段，或本发明药物组合物，或本发明试剂盒，用于检测、诊断、预后cll-1介导的疾病；所述疾病选自：急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓单核细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维变性。
72.本发明进一步提供一种治疗或预防cll-1介导的疾病的方法，包括步骤：
73.向受试者提供治疗有效量或预防有效量的本发明的抗cll-1抗体或其抗原结合片段；或者向受试者提供治疗有效量或预防有效量的本发明的药物组合物；其中所述cll-1介导的疾病选自：急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓单核细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤和骨髓纤维变性。
74.发明详述
75.一、术语
76.为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
77.本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如j.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
78.本发明所述的术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即igm、igd、igg、iga和ige，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。同一类ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如igg可分为igg1、igg2、igg3、igg4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类ig中每类ig都可以有κ链或λ链。
79.在本发明中，本发明所述的抗体轻链可变区可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
80.在本发明中，本发明所述的抗体重链可变区可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的igg1、igg2、igg 3、igg 4或其变体。
81.抗体重链和轻链靠近n端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(v区)；靠近c端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(c区)。可变区包括3个高变区(hvr)和4个序列相对保守的骨架区(fr)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(cdr)。每条轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)由3个cdr区4个fr区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。轻链的3个cdr区指lcdr1、lcdr2，和lcdr3；重链的3个cdr区指hcdr1、hcdr2和hcdr3。本发明所述的抗体或抗原结合片段的vl区和vh区的cdr氨基酸残基在数量和位置符合已知的kabat或chothia或abm定义规则(http://bioinf.org.uk/abs/)。
82.术语“抗原呈递细胞”或“apc”是在其表面上展示与mhc复合的外来抗原的细胞。t细胞利用t细胞受体(tcr)识别这种复合物。apc的实例包括但不限于树突细胞(dc)、外用血单个核细胞(pbmc)、单核细胞、b淋巴母细胞和单核细胞衍生的树突细胞。
83.术语“抗原呈递”是指apc捕获抗原和使它们能够被t细胞识别的过程，例如作为mhc-i/mhc-ii偶联物的组分。
84.术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、创建或分离的人抗体，所涉及的技术和方法在本领域中是熟知的，诸如：
85.1.从人免疫球蛋白基因的转基因、转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；
86.2.从经转化以表达抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体；
87.3.从重组组合人抗体文库中分离的抗体；以及
88.4.通过将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他dna序列等方法制备、表达、创建或分离的抗体。
89.此类重组人抗体包含可变区和恒定区，这些区域利用特定的由种系基因编码的人种系免疫球蛋白序列，但也包括随后诸如在抗体成熟过程中发生的重排和突变。
90.术语“人抗体”或“全人源抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)。然而，术语“人抗体”或“全人源抗体”不包括这样的抗体，即其中已将衍生自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)种系的cdr序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗体”)。
91.术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个cdr)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗原结合片段实例包括但不限于：fab、fab’、f(ab’)2、fv片段、线性抗体(linear antibody)、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。工程改造的抗体变体综述于holliger和hudson，2005，nat.biotechnol.23：
1126-1136中。
[0092]“fab片段”由一条轻链和一条重链的ch1及可变区组成。fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
[0093]“fab’片段”含有一条轻链和包含vh结构域和ch1结构域以及ch1和ch2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个fab’片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成f(ab’)2分子。
[0094]“f(ab’)2片段”含有两条轻链和两条包含ch1和ch2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，f(ab’)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个fab’片段组成。
[0095]“fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
[0096]
术语“多特异性抗体”按其最广义使用，涵盖具有多表位特异性的抗体。这些多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变区vh和轻链可变区vl的抗体，其中该vh-vl单元具有多表位特异性；具有两个或多个vl和vh区的抗体，每个vh-vl单元与不同的靶点或同一个靶点的不同表位结合；具有两个或更多个单可变区的抗体，每个单可变区与不同的靶点或同一个靶点的不同的表位结合；全长抗体、抗体片段、双抗体(diabodies)、双特异性双抗体和三抗体(triabodies)、己共价或非共价连接在一起的抗体片段等。
[0097]
术语“单链抗体”是由抗体的重链可变区vh和轻链可变区vl通过一段连接肽连接而成的单链重组蛋白，它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片段。
[0098]
术语“结构域抗体片段”是仅含有重链可变区或轻链可变区链的具有免疫学功能的免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或多个vh区与肽接头共价连接以形成二价结构域抗体片段。二价结构域抗体片段的两个vh区可靶向相同或不同抗原。
[0099]
本发明的术语“与cll-1结合”，指能与人cll-1相互作用。
[0100]
本发明的术语“抗原结合位点”指本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
[0101]
术语“表位”是指抗原上与免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可以由相邻的氨基酸、或通过蛋白质的三级折叠而并列的不相邻的氨基酸形成。由相邻的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保持，而通过三级折叠形成的表位通常在变性溶剂处理后丧失。表位通常以独特的空间构象包括至少3-15个氨基酸。确定什么表位由给定的抗体结合的方法在本领域中是熟知的，包括免疫印迹和免疫沉淀检测分析等。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本文所述的技术，例如x射线晶体分析法和二维核磁共振等。
[0102]
本发明所用的术语“特异性结合”、“选择性结合”是指抗体与预定的抗原上的表位结合。通常，当使用人cll-1作为分析物并使用抗体作为配体，在仪器中通过表面等离子体共振(spr)技术测定时，抗体以大约低于10-7
m或甚至更小的平衡解离常数(kd)与预定的抗原结合，并且其与预定抗原结合的亲和力是其与预定抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(如bsa等)结合的亲和力的至少两倍。术语“识别抗原的抗体”在本文中可以与术语“特异性结合的抗体”互换使用。
[0103]
术语“交叉反应”是指本发明的抗体与来自不同物种的cll-1结合的能力。例如，结合人cll-1的本发明的抗体也可以结合另一物种的cll-1。交叉反应性是通过在结合测定
(例如spr和elisa)中检测与纯化抗原的特异性反应性，或与生理表达cll-1的细胞的结合或功能性相互作用来测量。确定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定，例如表面等离子体共振(spr)分析，或流式细胞术。
[0104]
术语“抑制”或“阻断”可互换使用，并涵盖部分和完全抑制/阻断这两者。配体的抑制/阻断优选地降低或改变无抑制或阻断的情况下发生配体结合时出现活性的正常水平或类型。抑制和阻断也旨在包括与抗cll-1抗体接触时，与未与抗cll-1抗体接触的配体相比，任何可测量的配体结合亲和力降低。
[0105]
术语“抑制生长”(例如涉及细胞)旨在包括细胞生长任何可测量的降低。
[0106]
术语“诱导免疫应答”和“增强免疫应答”可互换使用，并指免疫应答对特定抗原的剌激(即，被动或适应性的)。针对诱导cdc或adcc的术语“诱导”是指剌激特定的直接细胞杀伤机制。
[0107]
本发明中所述的“adcc”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，是指表达fc受体的细胞通过识别抗体的fc段直接杀伤被抗体包被的靶细胞。可通过对igg上fc段的修饰，增强或降低或消除抗体的adcc效应功能。所述的修饰指在抗体的重链恒定区进行突变。
[0108]
本发明工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。相应抗体的cdna序列可以克隆并重组至gs表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染cho细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在fc区的高度保守n端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
[0109]“施用”、“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”、“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“施用”、“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
[0110]“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的任一种抗体，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个患都有的目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如student t检验、卡方检验、依据mann和whitney的u检验、kruskal-wallis检验(h检验)、jonckheere-terpstra检验和wilcoxon检验确定，其在
统计学显着数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
[0111]
整个说明书和权利要求书中使用的术语“基本上由
……
组成”或其变形表示包括所有所述元件或元件组，并且任选包括与所述元件类似或不同性质的其它元件，所述其它元件非显着改变指定给药方案、方法或组合物的基本性质或新性质。
[0112]
本发明所述的应用于某个对象的术语“天然存在的”是指这样的事实，即该对象可在自然界中发现。例如存在于可从自然界来源分离得到的生物体(包括病毒)、且未经人工在实验室中有意修饰的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
[0113]“有效量”包含足以改善或预防医字病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显着副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
[0114]“外源性”指要据背景在生物、细胞或人体外产生的物质。
[0115]“内源性”指根据背景在细胞、生物或人体内产生的物质。
[0116]“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个dna分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数
×
100％的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
[0117]
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在dna含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
[0118]“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
[0119]“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述抗体或其抗原结合片段，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
具体实施方式
[0120]
以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
[0121]
实施例1.全人源天然噬菌体展示库抗cll-1抗体fab片段筛选
[0122]
抗cll-1抗体fab片段筛选采用容量为2.25
×
10
10
cfu/ml，具有完整性和多样性的全人源天然噬菌体展示库筛选。首先，对全人源天然噬菌体展示库进行负向富集筛选，用
2％bsa封闭的全人源天然噬菌体展示库与dynabeads共孵育，kingfisher磁珠筛选系统收集磁珠，收集负向筛选后菌液。之后进行正向筛选，以2％bsa溶液封闭生物素化的cll-1-fc(acrobiosystems,cat：cla-h5266)或者his标签抗原(acrobiosystems,cat：cla-h5245)包被的dynabeads，并与负向筛选后的噬菌体库孵育，之后采用固-液相轮流交替淘洗的方式，通过逐渐降低cll-1蛋白浓度，经过3轮淘洗，筛选出阳性克隆，再对阳性克隆进行dna测序，挑选出序列特异性分子进行表达纯化，进一步做亲和验证。
[0123]
3轮淘洗过程中，第1轮筛选以2.5％bsa作为封闭液，分别以，组1：固相的100ug/ml的cll-1-fc抗原，和组2：液相的300nm生物素化cll-1-fc抗原与负向筛选后的全人源天然噬菌体展示库孵育筛选，以胰蛋白酶消化洗脱结合的阳性克隆；第2轮筛选，以2.5％bsa作为封闭液，分别以固相的30ug/ml的cll-1-his抗原，和液相的200nm生物素化cll-1-his抗原与第1轮筛选的组1和组2富集的阳性克隆孵育，清洗后以胰蛋白酶消化洗脱结合的阳性克隆；第3轮筛选，以2.5％bsa作为封闭液，以固相的10ug/ml的cll-1-fc抗原与前两轮筛选的阳性克隆混合物孵育，清洗后以胰蛋白酶消化洗脱结合的阳性克隆。以2ug/ml cll-1fc抗原包被板子，4℃孵育过夜，1x pbst洗涤3次，5％pbs-milk室温封闭1h，pbst洗板3次。将前3轮筛选的阳性克隆混合，用1x pbs以4倍梯度稀释，30ul/孔，室温1h孵育，pbst洗板3次，加入1:8000稀释的二抗anti-m13-hrp，30ul/孔，室温1h孵育，pbst洗板5次，加入30μl tmb室温显色5-10min，之后加入30μl 2m hcl终止反应，酶标仪od450读取数据，共获得109阳性克隆，随后进行dna测序获得37个特异性克隆,并呈现出基因多样性。对37个特异性克隆按前述的elisa方法进行亲和排序，获得6个亲和力较高的fab克隆:fab1，fab2，fab3，fab4，fab5和fab6。
[0124]
抗体可变区氨基酸序列如表1所示：
[0125]
表1.抗体的重链和轻链可变区序列
[0126]
[0127][0128]
注：cdr区由下划线标注。
[0129]
抗体cdr序列如表2所示：
[0130]
表2.抗体的重链和轻链可变区cdr序列
[0131]
[0132][0133]
elisa方法亲和水平结果如表3所示：
[0134]
表3.fab克隆对重组人cll-1-fc蛋白的亲和水平
[0135]
fab克隆ec50(ug/ml)fab10.47fab20.26fab40.90fab50.82fab60.79人抗体同种型对照》5
[0136]
实施例2.fab克隆对表达cll-1细胞水平的亲和评估
[0137]
利用流式细胞术评价fab克隆对cho-k1-hucll-1的亲和水平。将人cll-1基因(gene id:160364)构建于慢病毒载体转染cho-k1宿主细胞挑选出单克隆获得过表达人cll-1细胞株cho-k1-hucll-1。利用accutase(sigma,cat:a6964)消化液处理生长状态良好的cho-k1-hucll-1细胞，以2％fbs(dbps,ph7.4稀释)溶液制备单细胞悬液，调整细胞密度为1x106细胞/ml。于100μl/孔均分至96孔v型底板，以300g，5min，4℃离心，弃上清，于100μl/孔加入以3倍，9个浓度梯度(5ug/ml-7.62x10-4ug/ml)稀释的噬菌体fab克隆上清溶液，4℃孵育1h；以300g，5min，4℃离心，2％fbs洗涤2次，于100μl/孔加入以5μl/106细胞比例稀释好的山羊抗人igg(fab')2，pe标记二抗(abcam,cat:98606)溶液，4℃孵育1h；300g x 5min，4℃离心，洗涤2次，加入70μl 2％fbs溶液重悬细胞，于流式细胞仪(bio-rad，ze5)检测pe通道的平均荧光强度(mfi)。
[0138]
数据处理：
[0139]
以噬菌体fab克隆上清的浓度对数值作为x轴坐标，mfi为纵坐标，利用graphpad prism 8.0log(agonist)vs.response-viable slope(four parameters)公式计算待测抗体对肿瘤细胞亲和的ec
50
，如下表8所示：
[0140]
表4.fab克隆对cho-k1-hu cll-1的亲和水平差异(ec
50
)
[0141]
[0142][0143]
实验结论：
[0144]
以上数据显示，本发明fab克隆对cho-k1-hucll-1具有良好的亲和力。
[0145]
实施例3.抗cll-1全长igg抗体的构建与表达
[0146]
将抗人cll-1蛋白特异性fab片段与人源天然igg1免疫球蛋白fc片段重组构建成全长抗体，轻链为kappa型或lambda型，抗体类型为全人源抗体。
[0147]
或者，将fab克隆的重链可变区和轻链可变区分别与源自人igg1的重链恒定区和人抗体轻链恒定区序列连接。示例性地，抗体重链恒定区氨基酸序列如seq id no：28所示，轻链恒定区氨基酸序列如seq id no：31所示。用6个fab克隆(fab1，fab2，fab3，fab4，fab5和fab6)构建全长igg1抗体，对应的抗体分别为ab1，ab2，ab3，ab4，ab5和ab6。
[0148]
1.质粒构建
[0149]
将从全人源天然噬菌体展示库筛选获得的特异性fab序列的轻链可变区和恒定区即vl/cl以及重链可变区和恒定区即vh/ch1 cdna序列构建在pcdna3.3表达质粒上，与人igg1的fc段融合构建，将重链和轻链的质粒按1：2的比例瞬时转染expicho细胞，诱导表达并得到全人源全长igg1亚型抗体。
[0150]
2.抗体表达纯化
[0151]
采用expicho瞬转表达系统进行抗体表达，培养基为(gibco，a29100-01)，转染试剂盒为(gibco，a29129)。具体方法如下：转染前一天将expicho细胞进行传代，在25ml体系内，将构建好的25μg的质粒与转染试剂混合之后滴加入25ml的expicho细胞中，充分混匀后，于37℃细胞培养箱内表达18-22小时。随后，向上述转染混合物中添加补料培养基并置于32℃细胞培养箱内继续培养。转染后第5天，添加第二次补料，并将细胞置于32℃细胞培养箱内继续培养10-12天。接着，将表达好的细胞混悬液进行高速离心并取上清，所得上清经0.22μm滤膜过滤后，采用proteina/g亲和层析柱亲和法进行纯化。纯化后，用100mm甘氨酸盐(ph＝3.0)洗脱目的蛋白，浓缩，置换，分装，经sds-page鉴定、sec纯度检测、活性鉴定后入库冻存。
[0152]
表5.抗体的重链和轻链序列
[0153]
[0154]
[0155][0156]
注：cdr区由下划线标注。
[0157]
表6.抗体重链和轻链的恒定区及igg1 fc片段序列
[0158][0159][0160]
表7.抗体及其重链、轻链、可变区的序列编号
[0161]
抗体编号hcvrhclcvrlcab1seq id no：37seq id no：49seq id no：38seq id no：50ab2seq id no：39seq id no：51seq id no：40seq id no：52ab3seq id no：41seq id no：53seq id no：42seq id no：54ab4seq id no：43seq id no：55seq id no：44seq id no：56ab5seq id no：45seq id no：57seq id no：46seq id no：58ab6seq id no：47seq id no：59seq id no：48seq id no：60
[0162]
实施例4.抗体对cll-1抗原水平的亲和评估
[0163]
利用间接elisa法，即“抗原-抗体-hrp标记二抗”评价设计抗体对人源cll-1抗原亲和水平的差异。利用ph7.4的dpbs将cll-1，his标签蛋白(acrobiosystems,cat：cla-h5245)稀释为2ug/ml，于100μl/孔加入高亲和力96孔板内(corning,cat:3590)，4℃孵育过夜，次日，甩净cll-1抗原溶液，于200μl/孔加入含有0.05％tween 20pbs ph7.4(pbst)溶液，洗涤3次，于200μl/孔2％bsa(溶解于pbst)，37℃封闭1h，pbst洗涤3次，于100μl/孔加入，按10倍，9个浓度梯度(20ug/ml-0.512x10-3 ug/ml)稀释的待测抗体，0.5％bsa作为阴性对照，37℃封闭1h，pbst洗涤3次；于100μl/孔，加入按1：10000稀释的羊抗人igg，fc-hrp(abcam,cat:ab97225)二抗溶液，37℃封闭1h，pbst洗涤3次；
[0164]
于100μl/孔加入tmb(cst,cat:7004p6)底物，室温反应3min至抗体最高浓度孔溶液的颜色变为深蓝色，于50μl/孔加入终止液(cst，cat:7002p6)，终止反应，于450nm波长读取吸光度值(od)。
[0165]
数据处理：
[0166]
以待测抗体的浓度对数值作为x轴坐标，od450吸光度值为纵坐标，利用graphpad prism 8.0log(agonist)vs.response-viable slope(four parameters)公式计算抗体对抗原亲和力，结果如表8所示：
[0167]
表8.抗体对人cll-1抗原的亲和力
[0168][0169]
实验结论：
[0170]
以上数据显示，本发明抗体对人cll-1抗原具有良好的亲和力。
[0171]
实施例5.抗体对表达cll-1细胞的亲和评估
[0172]
利用流式细胞术评价设计抗体对hek293-hucll-1的亲和水平差异。
[0173]
将人cll-1基因(gene id:160364)构建于慢病毒载体转染hek293宿主细胞挑选出单克隆获得过表达人cll-1细胞株hek293-hucll-1。accutase(sigma,cat:a6964)消化液处理生长状态良好的肿瘤细胞，以2％fbs(dbps,ph7.4稀释)溶液制备单细胞悬液，调整细胞密度为1x106细胞/ml。于100μl/孔均分至96孔v型底板，以300g，5min，4℃离心，弃上清，于100μl/孔加入以10倍，10个浓度梯度(40ug/ml-0.02x10-3 ug/ml)稀释的待测抗体溶液，4℃孵育1h；
[0174]
以300g，5min，4℃离心，2％fbs洗涤2次，于100μl/孔加入以5μl/106细胞比例稀释好的小鼠抗人igg fc，pe标记二抗(biolegend,cat:409304)溶液，4℃孵育1h；300g
×
5min，4℃离心，洗涤2次，加入70μl 2％fbs溶液重悬细胞，于流式细胞仪(bio-rad，ze5)检测pe通道的平均荧光强度(mfi：mean fluorescence intensity)。
[0175]
数据处理：
[0176]
以抗体的浓度对数值作为x轴坐标，mfi为纵坐标，利用graphpad prism 8.0log(agonist)vs.response-viable slope(four parameters)公式计算抗体亲和力，结果如表9所示：
[0177]
表9.抗体对hek293-hu cll-1的亲和水平(ec
50
)
[0178]
抗体最大mfiec
50
(ng/ml)ab14275.0629.47ab25844.5340.20ab44940.1656.26ab55744.0741.38
[0179]
实验结论：
[0180]
以上数据显示，本发明抗人cll-1抗体对hek293-hucll-1具有良好的亲和力。
[0181]
实施例6.抗体内吞活性评估
[0182]
利用流式细胞术评价抗人cll-1抗体在cll-1抗原表达的肿瘤细胞系hl-60、u937以及过表达细胞株hek293-hu cll-1上的抗体内吞活性。利用accutase(sigma,cat:a6964)消化液处理生长状态良好的表达细胞株hek293-hu cll-1，与hl-60、u937悬浮培养细胞同时以300g x 5min，常温离心，弃上清，以2％fbs(dbps,ph7.4稀释)溶液重悬沉淀，制备单细胞悬液，调整细胞密度为1x107细胞/ml。于100μl/孔均分至96孔v型底板，加入终浓度为20μg/ml的待测抗体溶液，混匀，4℃孵育1h；
[0183]
300g x 5min，4℃离心，于100μl/孔加入以5μl/106细胞比例稀释好的小鼠抗人igg fc，pe标记二抗(biolegend,cat:409304)溶液，4℃孵育1h；
[0184]
300g
×
5min，4℃离心，洗涤2次，1ml37℃预温的rpmi-1640(giboco)完全培养基重悬细胞沉淀，分为四等份，分别设为0min组、空白组、30min组、120min组；取出0min及空白组置于冰上，其余放置于37℃培养箱，分别内吞30min、120min，在相应时间点取出对应的组，置于冰上预冷5min，所有处理组离心弃上清(4℃、1500rpm
×
5min)，用facs缓冲液洗涤一次，弃上清；除0min组外所有处理组加入250μl strip缓冲液，室温孵育8min，离心弃上清(4℃，1500rpm
×
5min)，facs缓冲液洗涤两次，去上清，每组样品加入80μl2％fbs重悬细胞，于流式细胞仪(bio-rad，ze5)检测待测样品荧光信号。
[0185]
数据处理：
[0186]
按照此公式计算抗体的内吞效率：抗体内吞百分率(％)＝(处理组mif-空白组mfi)/(0min组mfi-空白组mfi)*100％。采用上述方法检测抗体内吞率如下表10所示：
[0187]
表10.抗cll-1抗体在细胞上的内吞效率(％)
[0188][0189]
实验结论：
[0190]
以上数据显示，本发明抗cll-1抗体在细胞水平具有良好的内吞作用。
[0191]
实施例7.体外adcc效应评估
[0192]
本实验旨在评价候选抗体分子的体外adcc效应。利用时间均相分辨荧光即delfia eutda细胞毒实验试剂盒(perkinelmer,cat log:ad0116)评估。先将靶细胞用batda试剂标记，batda可自由渗透至细胞内，并在乙酰酯酶催化作用下形成无法进出细胞膜的tda，标记的靶细胞和效应细胞共孵育，在抗体的fc端介导的adcc效应下，效应细胞将标记靶细胞裂解释放出tda，tda与检测液中eu3+结合形成螯合物，通过ex/em为340/615即trf通道检测荧光信号，根据荧光信号的强弱进而评价adcc效应。
[0193]
将靶细胞u937(atcc,cat#:tchu159)和效应细胞nk-92mi(nanjing cobioer,cat#:cbp61113)以1000rpm/min，离心5min,洗涤2次，分别调整细胞密度为1x106个/ml和2x106个/ml，之后以每毫升细胞悬浮液中加入5ul batda溶液，于37
°
孵育10min，之后以1000rpm/min，离心5min,洗涤3次，用含有2mm丙磺舒培养基(rpmi-160(gibco,cat#:
22400105)+10％fbs(gibco,cat#:10099141))重悬细胞并计数，调整细胞密度为2x105个/ml，接种细胞悬液至96-孔板(coring,cat#3799)，50ul/孔，加入稀释好的待测抗体100ul/孔。将先前调整好细胞密度的效应细胞nk-92mi也加入板子共孵育，使效靶比为10:1，将板子置于在37℃细胞培养培养箱中放置2-4小时。之后以800rpm/min，离心5min，离心板子，取20ul上清，转移至新96孔板(corning,cat#:3917)，每孔加入200μleuropium solution，在室温下低速震荡孵育30min后读数。
[0194]
计算adcc裂解杀伤效率，计算公式如下：特异裂解效率％＝(实验组信号
–
自然死亡信号)/(最大杀伤信号
–
自然死亡信号)x 100
[0195]
注：
[0196]
实验组信号：标记靶细胞+效应细胞+抗体；自然死亡信号：只有标记的靶细胞
[0197]
最大释放信号：标记靶细胞完全裂解液；背景信号：培养基
[0198]
检测抗体adcc裂解杀伤效率如下表11所示：
[0199]
表11.抗cll-1抗体体外adcc裂解杀伤效率(平均值％)
[0200]
conc.(nm)ab110028.291020.43118.640.111.14
[0201]
实验结果表明，候选分子在体外对肿瘤细胞显示良好的adcc裂解杀伤效果，并呈现良好的量效关系。