一种全人源抗PD-L1抗体及其应用的制作方法

一种全人源抗pd-l1抗体及其应用
技术领域
1.本发明属于抗体药物领域，具体涉及一种全人源抗pd-l1单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.程序性死亡受体配体（pd-l1，也称为cd 274或b7-h1）是程序性死亡受体（pd-1）的配体。pd-l1在多种肿瘤上表达，肿瘤细胞上高表达的pd-l1通过增加t细胞的凋亡从而在肿瘤免疫逃逸中起着重要的作用。针对pd-l1设计特定的单克隆抗体，可阻止pd-1和pd-l1的识别，恢复t细胞正常功能，从而使t细胞有效杀伤肿瘤细胞。
3.鉴于pd-l1在癌症发展和免疫调节中的作用，本领域仍需能够与pd-l1结合并能阻断pd-1与pd-l1结合的抗pd-l1单克隆抗体。


技术实现要素：

4.本发明提供一种特异性结合pd-l1的单克隆抗体及其应用。所述抗pd-l1抗体具有下述性质中的一种或者多种：（1）能够分别与人pd-l1、猴pd-l1、鼠pd-l1结合；（2）能够阻断pd-1蛋白与pd-l1蛋白的结合；（3）能够刺激淋巴细胞分泌细胞因子；（4）和/或具有亲水性、热稳定性、有利于制备和纯化。本发明还提供了所述抗pd-l1单克隆抗体的制备方法和应用。
5.一方面，本发明提供一种特异性结合pd-l1蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含氨基酸序列如seq id no: 20所示的轻链cdr1，氨基酸序列如seq id no: 21所示的轻链cdr2，氨基酸序列如seq id no: 22所示的轻链cdr3，氨基酸序列如seq id no: 1所示的重链cdr1，氨基酸序列如seq id no: 2所示的重链cdr2和氨基酸序列如seq id no: 3所示重链cdr3。
6.在某些实施方式中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含与seq id no: 7所示的氨基酸序列至少95%同一性的重链可变区vh和包含与seq id no: 26所示的氨基酸序列至少95%同一性的轻链可变区vl，且其中vh包含氨基酸序列如seq id no: 1-3所示的重链cdr1-3，且其中vl包含氨基酸序列如seq id no: 20-22所示的轻链cdr1-3。
7.在某些实施方式中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列如seq id no: 7所示的重链可变区vh和氨基酸序列如seq id no: 26所示的轻链可变区vl。
8.在某些实施方式中，所述抗原结合片段包含fab、fab’、f(ab’)2、fv或scfv。
9.在某些实施方式中，所述单克隆抗体为全人源抗体。
10.在某些实施方式中，所述的单克隆抗体还包含人igg1亚型的重链恒定区，和κ亚型的轻链恒定区。
11.在某些实施方式中，所述重链恒定区的氨基酸序列如seq id no: 17所示，和所述轻链恒定区的氨基酸序列如seq id no: 34所示。
12.另一方面，本发明提供一种核酸分子，其编码本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
13.另一方面，本发明提供一种载体，其包含本发明所述的核酸分子。
14.另一方面，本发明提供一种细胞，其导入了本发明所述的核酸分子或转染了本发明所述的载体。
15.另一方面，本发明提供一种制备本发明所述特异性结合pd-l1蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在允许所述单克隆抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养所述细胞，以及回收这样产生的所述抗体或其抗原结合片段。
16.另一方面，本发明提供一种免疫缀合物，其包含与治疗剂偶联的本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
17.在某些实施例中，所述治疗剂为毒素、放射性同位素、免疫调节剂或细胞毒性剂。
18.另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的佐剂。
19.另一方面，本发明涉及所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞、所述的免疫缀合物和/或所述的药物组合物在制备治疗与pd-l1相关的疾病的药物中的用途。
20.本技术的抗pd-l1抗体具有较好的亲和力、结合能力，能够竞争性阻断pd-1和pd-l1的结合作用，且细胞活性实验中证明其具有激活混合淋巴细胞释放il-2的能力，产生了有益的效果。
21.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
22.本发明中，术语“一种”和“所述”通常包括多个指示物。
23.本发明中，术语“约”通常指本领域技术人员容易知道的相应值的普通误差范围，例如，在20%内，更优选在10%内，并且最优选在5%内。
24.本发明中，术语“特异性结合”通常是指可测量且可再现的相互作用。例如抗原和抗体之间的结合，抗体通过其抗原结合域与表位结合，并且该结合需要抗原结合域和表位之间的一些互补性。例如，特异性结合靶物（其可以是表位）的抗体是以比其结合其它靶物更高的亲和力、亲合力、更容易和/或以更长的持续时间结合此靶物的抗体。当抗体相比于其将结合随机的、不相关的表位而言更容易通过其抗原结合域与表位结合时，抗体被称为“特异性结合”该抗原。
25.本发明中，术语“pd-l1”（程序性死亡配体1），也称为分化簇274（cd 274）或b7同源物1（b7-h1）。pd-l1的基本结构包括4个结构域：胞外免疫球蛋白样v型结构域、免疫球蛋白样c 2型结构域、跨膜结构域及c端胞内结构域，其基因位于人染色体的9p24位点。pd-l1可以结合其受体（例如程序性死亡受体1，pd-1），pd-l1与pd-1的结合可以抑制t细胞的增殖，激活下游抑制信号，从而使肿瘤细胞逃逸机体免疫系统的识别和攻击。本发明中，术语“pd-l1”涵盖任何脊椎动物来源的任何天然pd-l1或经修饰的pd-l1，所述任何脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类（例如，人或猴等）和啮齿类（例如，小鼠或大鼠等）。所述术语“pd-l1”涵盖全长的pd-l1、未加工的pd-l1以及由细胞加工所产生的任何形式的pd-l1，其还涵盖天然存在的pd-l1的变体（例如，剪接变体或等位基因变体）。pd-l1序列是本领域已知的，例如可在ncbi gene id：29126下找到关于人pd-l1基因的信息。示例性的全长人pd-l1蛋白的氨基酸序列可在ncbi登录号np_054862或uniprot登录号q9nzq7下找到。
fr2、h-fr3、h-fr4、l-fr1、l-fr2、l-fr3和l-fr4，大部分采用β-折叠构型，通过三个cdr结构环区连接。每条链中的cdr通过fr区紧密靠近在一起，并与来自另一条链的cdr一起形成抗体的抗原结合位点。
31.在本领域中，可以通过多种方法来定义抗体的cdr，例如基于序列可变性的kabat定义规则、基于结构环区域位置的chothia定义规则和基于imgt本体论（imgt-ontology）的概念。本发明中，所述抗pd-l1单克隆抗体的vl和vh的氨基酸序列按chothia编码规则进行编码，所述抗pd-l1单克隆抗体的轻链cdr1-3和重链cdr1-3按chothia定义。
32.本发明中，术语“单克隆抗体”通常是指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即集群中的抗体是相同的，除了可能存在的少量的自然突变。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。
33.在本发明中，术语“全人源抗体”或“人抗体”通常是指抗体所有部分（包括抗体的可变区和恒定区）均由人类来源的基因所编码。全人源抗体可以大大减少异源抗体部分对人体造成的免疫副反应。本领域获得全人源抗体的方法可以有噬菌体展示技术、转基因小鼠技术、核糖体展示技术等。
34.本发明中，术语“分离的”通常是指大体上不含其天然存在的环境中通常伴随或与之相互作用的组分（例如病毒、核酸或蛋白质）。本发明中，术语“分离的核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
35.本发明中，术语“载体”通常是指能够转运与它连接的另一个核酸分子，并在合适的宿主中自我复制的核酸分子。载体包括任何遗传元件，例如质粒、转座子、人工染色体、病毒等，其在与适当的控制元件组合时能够进行自我复制并且将基因序列转移到宿主或宿主之间。所述载体可包括主要用于将dna或rna插入细胞中的载体、主要用于复制dna或rna的载体，以及主要用于dna或rna的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体还可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。
36.本发明中，术语“免疫缀合物”，也称为“抗体-药物缀合物”通常是指抗体或其抗原结合片段与其它治疗剂（例如毒素、细胞毒性剂、免疫治疗剂或放射性同位素等）连接形成的物质，连接可以是共价键或非共价键相互作用。为了形成免疫缀合物，可以采用本领域已知的各种接头。
37.本发明中，术语“细胞毒性剂”通常是指降低或阻断细胞的功能，和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素；化学治疗剂或药物，例如甲氨蝶呤（methotrexate）、阿霉素（adriamycin）、长春新碱（vincristine）、长春碱（vinblastine）、依托泊苷（etoposide）、多柔比星（doxorubicin）、美法仑（melphalan）、丝裂霉素c（mitomycin c）、苯丁酸氮芥（chlorambucil）或道诺霉素；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素。在本发明中，细胞毒性剂可以是美登素类（maytansinoid）、cc-1065或cc-1065类似物、卡奇霉素（calicheamicin）、吡咯并苯并二氮和奈莫柔比星（nemorubicin）衍生物，如同本发明的免疫缀合物，细胞毒性剂是以共价键与目的抗体直接连接或通过可切割的或不可切割的连接子连接。
38.在本发明中，术语“同一性”或“同源性”通常是指将候选序列中核苷酸碱基或氨基酸残基与相应序列进行比较，经序列比对和必要情况下引入间隔以实现整段序列的最大相同百分数并且不把任何保守取代视为序列同一性的一部分后，二者碱基或残基相同的比例。无论n端或c端延伸或插入均不应理解为降低同一性或同源性。对于比对的方法和计算程序均可获得，并为本领域所熟知，例如，可以通过序列分析软件测定序列同一性。
39.本发明中，术语“检测”包括任何手段的检测，包括直接和间接检测。
40.本发明中，术语“k
d”、“k
d”或“kd”可互换使用，通常是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。本发明中使用的“k
d”是解离速率常数（kdis，也称为“解离率（off-rate）（koff）”或“kd”）与结合速率常数（kon，也称为“结合率（kon）”或“ka”）的比值。可使用结合速率常数（kon）、解离速率常数（kdis）和平衡解离常数（kd）表示抗原结合片段（例如抗体）对抗原的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法为本领域熟知的，包括但不限于生物膜干涉技术（bli）、放射免疫法（ria）、平衡透析法、表面等离子共振（spr）、荧光共振能量迁移（fret）、免疫共沉淀（co-ip）以及蛋白质芯片技术。如果在不同的条件（例如盐浓度、ph下测量），则所测得的某种特定蛋白-蛋白相互作用的亲和力可不同。
41.本发明中，术语“亲和力（affinity）”通常是指抗体分子的一条重链与一条轻链所构成的一个抗原结合部位与一个相应抗原表位之间的结合强度，抗原抗体的亲和力取决于二者空间构型互补的程度。
42.本发明中，术语“亲合力（avidity）”通常是指一个完整抗体分子的抗原结合部位与若干相应抗原表位之间的结合强度。
43.本发明中，术语“参比抗体”通常是指与本发明所述单克隆抗体或抗原结合片段竞争结合抗原（例如pd-l1蛋白）的抗体。
44.在本发明中，术语“治疗”通常是指期望改变所治疗个体的天然病程，且可为实现防治或在临床病变过程中进行的临床介入。合乎需要的治疗效果包括但不限于防止疾病发生或复发、减轻症状、减弱疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低疾病进展速率、改善或缓解疾病状态或改善预后。在一些情形中，本发明的抗体或其抗原结合片段（例如，抗pd-l1抗体）可用来延迟疾病发展或减缓疾病进展。
45.本发明中，术语“治疗有效量”通常是指向受试者提供治疗性和/或预防性益处所必需的化合物或组合物的量。在本发明中，术语“施用”通常是指向受试者（例如，患者）给予一定剂量的化合物（例如，本发明的所述的抗pd-l1抗体）或药物组合物（例如，包含本发明所述的抗pd-l1抗体的药物组合物）的方法。施用可通过任何合适的方式进行，包括肠胃外、肺内和鼻内，以及（如果因局部治疗需要）损伤内施用。胃肠外施用包括但不限于肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。
46.在本发明中，术语“pd-l1相关的疾病”通常是指pd-1受体和它的配体pd-l1组成的信号通路异常活化及表达引起的肿瘤、慢性感染及自身免疫疾病等。在本发明中，pd-l1相关的疾病可以包括pd-1或pd-l1高表达的肿瘤，例如非小细胞肺癌、淋巴瘤、肾癌、肝癌、胃癌、大肠癌、乳腺癌等。
47.在本发明中，术语“肿瘤”通常是指所有赘生性细胞生长和增殖（无论恶性还是良性）以及所有癌前和癌性细胞和组织。在本发明中，所述肿瘤可以为细胞和组织的pd-1或pd-l1高表达的肿瘤。肿瘤可包括实体瘤和/或非实体瘤（例如，血液瘤、淋巴瘤）。
48.在本发明中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由
……
组成”的含义。
49.本发明通过噬菌体展示文库与酵母展示文库技术筛选针对pd-l1的全人源抗体，并利用基因工程方法得到完整抗体，从而提供一种新的氨基酸序列的全人源抗pd-l1单克隆抗体。
50.在本发明中，所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段，其能够结合人、猴和小鼠pd-l1蛋白。所述单克隆抗体或其抗原结合片段对pd-l1的结合亲和力可通过本领域已知的任何方法测定，例如，在本发明中采用octet red96e（fort
é
bio）测定抗pd-l1抗体与人pd-l1、猴pd-l1、鼠pd-l1的结合。
51.例如，在octet red96e测定中，所述的抗pd-l1单克隆抗体以约2.6e-08的亲和力kd（m）与人pd-l1结合。
52.例如，在octet red96e测定中，所述的抗pd-l1单克隆抗体以约1.5e-10的亲合力kd（m）与人pd-l1结合。
53.例如，在octet red96e测定中，所述抗pd-l1单克隆抗体以约7.9e-10的亲合力kd（m）与猴pd-l1结合。
54.例如，在octet red96e测定中，所述抗pd-l1单克隆抗体以约5.8e-10的亲合力kd（m）与鼠pd-l1结合。
55.在本发明中，所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段能够与细胞表面pd-l1结合。所述抗pd-l1抗体与细胞表面pd-l1的结合可通过本领域已知的任何方法测定。例如，在本发明中可以通过facs鉴定抗pd-l1抗体与chok 1-hpd-l1的结合，所述抗pd-l1抗体结合细胞表面的pd-l1的ec
50
值约为0.02 μg/ml。
56.在本发明中，所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段能够阻断pd-1蛋白与pd-l1蛋白的结合。所述单克隆抗体或其抗原结合片段阻断pd-1蛋白与pd-l1蛋白的结合可通过本领域已知的任何方法测定。例如，在本发明中可以通过facs鉴定抗pd-l1抗体阻断biotin-pd-1结合chok 1-hpd-l1的功能，所述抗pd-l1抗体阻断pd-1与pd-l1的结合的ic
50
值约为1.02 μg/ml。
57.在本发明中，所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段能够刺激淋巴细胞分泌细胞因子。例如，本发明中所述抗pd-l1抗体可以激活淋巴细胞释放il-2。
58.在本发明中，所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段能够与参比抗体竞争结合pd-l1蛋白，所述参比抗体包括氨基酸序列如seq id no: 20所示的轻链cdr1，氨基酸序列如seq id no: 21所示的轻链cdr2，氨基酸序列如seq id no: 22所示的轻链cdr3，氨基酸序列如seq id no: 1所示的重链cdr1，氨基酸序列如seq id no: 2所示的重链cdr2和氨基酸序列如seq id no: 3所示重链cdr3。
59.在本发明中，所述抗pd-l1抗体或其抗原结合片段能够与参比抗体竞争结合pd-l1蛋白，所述参比抗体包含氨基酸序列如seq id no: 7所示的重链可变区vh和包含氨基酸序列如seq id no: 26所示的轻链可变区vl。
60.在本发明中，所述抗原结合片段包括fab、fab’、f(ab’)2、fv或scfv。
61.在本发明中，所述抗pd-l1抗体为全人源抗体，也就是说本发明所述的抗pd-l1抗体所有部分（包括抗体的可变区和恒定区）均由人类来源的基因所编码。
62.在本发明中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链cdr1，所述轻链cdr1包含seq id no: 20所示的氨基酸序列。
63.在本发明中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链cdr2，所述轻链cdr2包含seq id no: 21所示的氨基酸序列。
64.在本发明中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链cdr3，所述轻链cdr3包含seq id no: 22所示的氨基酸序列。
65.在本发明中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链cdr1、轻链cdr2、轻链cdr3，其中，所述轻链cdr1包含如seq id no: 20所示的氨基酸序列，所述轻链cdr2包含如seq id no: 21所示的氨基酸序列和所述轻链cdr3包含如seq id no: 22所示的氨基酸序列。
66.在本发明中，所述单克隆抗体包含与seq id no: 26所示的氨基酸序列至少90%同一性、至少95%同一性或者相同的轻链可变区vl。
67.例如，在本发明中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含与seq id no: 26所示的氨基酸序列至少95%同一性的轻链可变区vl，且中vl包含氨基酸序列如seq id no: 20-22所示的轻链cdr1-3。
68.例如，在本发明中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链可变区vl，其中，所述vl包含seq id no: 26所示的氨基酸序列。
69.在本发明中，所述单克隆抗体还包含抗体轻链恒定区，所述轻链恒定区为κ型。例如，在本发明中，所述抗体轻链恒定区包含seq id no: 34所示的氨基酸序列。
70.在本发明中，所述单克隆抗体包含抗体轻链lc，所述lc包含seq id no: 35所示的氨基酸序列。
71.在本发明中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链cdr1，所述重链cdr1包含seq id no: 1所示的氨基酸序列。
72.在本发明中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链cdr2，所述重链cdr2包含seq id no: 2所示的氨基酸序列。
73.在本发明中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链cdr3，所述重链cdr3包含seq id no: 3所示的氨基酸序列。
74.在本发明中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链cdr1、重链cdr2和重链cdr3，其中所述重链cdr1包含seq id no: 1所示的氨基酸序列，所述重链cdr2包含seq id no: 2所示的氨基酸序列和所述重链cdr3包含seq id no: 3所示的氨基酸序列。
75.在本发明中，所述单克隆抗体包含与seq id no: 7所示的氨基酸序列至少90%同一性、至少95%同一性或者相同的重链可变区vh。
76.例如，在本发明中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含与seq id no: 7所示的氨基酸序列至少95%同一性的重链可变区vh，且中vh包含氨基酸序列如seq id no: 1-3所示的重链cdr1-3。
77.例如，在本发明中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含重链可变区vh，所述vh包含seq id no: 7所示的氨基酸序列。
78.在本发明中，所述单克隆抗体还包含抗体重链恒定区，所述抗体重链恒定区源自人igg恒定区。
79.例如，在本发明中，所述抗体重链恒定区源自人igg1恒定区，且所述人igg1恒定区进一步包含氨基酸突变，例如包含n297a突变（即第297位的天冬酰胺突变为丙氨酸）。例如，在本发明中，所述抗体重链恒定区包含seq id no: 17所示的氨基酸序列。
80.在本发明中，所述单克隆抗体包含抗体重链hc，所述hc包含seq id no: 18所示的氨基酸序列。
81.在本发明中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含轻链cdr1、轻链cdr2、轻链cdr3、重链cdr1、重链cdr2和重链cdr3，其中，所述轻链cdr1包含seq id no: 20所示的氨基酸序列，所述轻链cdr2包含seq id no: 21所示的氨基酸序列和所述轻链cdr3包含seq id no: 22所示的氨基酸序列，所述重链cdr1包含seq id no: 1所示的氨基酸序列，所述重链cdr2包含seq id no: 2所示的氨基酸序列和所述重链cdr3包含seq id no: 3所示的氨基酸序列。
82.在本发明中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含与seq id no: 7所示的氨基酸序列至少90%同一性的重链可变区vh和包含与seq id no: 26所示的氨基酸序列至少90%同一性的轻链可变区vl。
83.例如，在本发明中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含与seq id no: 7所示的氨基酸序列至少95 %同一性的重链可变区vh和包含与seq id no: 26所示的氨基酸序列至少95 %同一性的轻链可变区vl。
84.例如，在本发明中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含与seq id no: 7所示的氨基酸序列至少95%同一性的重链可变区vh和包含与seq id no: 26所示的氨基酸序列至少95%同一性的轻链可变区vl，且其中vh包含氨基酸序列如seq id no: 1-3所示的重链cdr1-3，且其中vl包含氨基酸序列如seq id no: 20-22所示的轻链cdr1-3。
85.例如，在本发明中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含抗体轻链可变区vl和抗体重链可变区vh，其中，所述vl包含seq id no: 26所示的氨基酸序列，所述vh包含seq id no: 7所示的氨基酸序列。
86.在本发明中，所述单克隆抗体包含抗体轻链lc和抗体重链hc，其中，所述lc包含seq id no: 35所示的氨基酸序列，所述hc包含seq id no: 18所示的氨基酸序列。
87.另一方面，本发明提供一种核酸分子，其编码本发明所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。例如，所述核酸分子可以编码完整的所述单克隆抗体，也可以编码所述单克隆抗体的一部分（例如，hcdr1-3、lcdr1-3、vh、vl、hc和lc中的一种或多种）。
88.本发明中，所述的核酸分子可以为分离的，例如，其可以通过以下方法产生或合成的：（i）在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应（pcr）扩增产生的，（ii）通过克隆重组产生的，（iii）纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者（iv）通过化学方法合成的。在某些实施方式中，所述分离的核酸是通过重组dna技术制备的核酸分子。
89.另一方面，本发明提供一种载体，其包含本发明所述的核酸分子。每种载体中可包含一种或多种所述核酸分子。进一步地，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。例如，所述载体为表达载体。
90.另一方面，本发明提供一种细胞，其导入了本发明所述的核酸分子或转染了本发明所述的载体。在某些实施方式中，所述细胞中可包含一个或一种本发明所述的核酸分子
或载体。在某些实施方式中，所述细胞中可包含多个（例如，2个或以上）或多种（例如，2种或以上）本发明所述的核酸分子或载体。所述细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。例如，动物细胞可以包括：cho-s、cho-k1和/或hek-293细胞。
91.另一方面，本发明提供了制备所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在允许所述单克隆抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养所述的细胞，并回收这样产生的抗体或其抗原结合片段。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间培养细胞，并回收细胞表达的抗体或其抗原结合片段，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
92.本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的dna分子序列可以用常规技术，比如设计引物进行pcr扩增或基因组文库筛选等方法获得。进一步地，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
93.一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列，通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的细胞中分离得到有关序列。
94.此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。然后可将该核酸分子引入本领域已知的各种现有的dna分子（例如，载体）和细胞中。
95.本发明还涉及包含上述的核酸分子以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
96.本发明中所述的转化宿主细胞的步骤可用本领域熟知的技术进行。获得的转化子可用常规方法培养，转化子表达本发明的核酸分子所编码的抗体或其抗原结合片段。通常，在适合本发明的抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养转化所得的细胞，然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白a-sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的分离纯化手段得到本发明的抗体或其抗原结合片段。所得的抗体或其抗原结合片段可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用流式细胞分选技术（facs）、放射性免疫测定（ria）或酶联免疫吸附测定（elisa）来测定。
97.另一方面，本发明提供了一种免疫缀合物，其由本发明所述的抗pd-l1单克隆抗体与治疗剂偶联形成。在一些实施方式中，所述的细胞毒性剂包括但不限于毒素、放射性同位素、免疫调节剂或细胞毒性剂。
98.在另一方面，本发明还提供一种药物组合物，包括本发明所述的抗pd-l1单克隆抗体以及药学上可接受的佐剂，所述药学上可接受的佐剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒性。例如，所述药学上可接受的佐剂包括但并不限于：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。
99.本发明中的药物组合物还可含有多于一种活性化合物，通常为不会不利地影响彼此的具有互补活性的物质。此类药物组合物的类型和有效量取决于其中存在的抗体的含量和类型，以及受试者的临床参数。
100.本发明所述的药物组合物以符合医疗实践的方式配制、给药和施用。例如，所述的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过
常规方法进行制备。此外，本发明所述的药物组合物还可与其他治疗剂一起使用。
101.在另一方面，本发明还提供了所述抗pd-l1单克隆抗体，和/或所述核酸分子，和/或所述载体，和/或所述细胞，和/或所述免疫缀合物，和/或所述药物组合物用于制备治疗与pd-l1相关的疾病的药物中的用途。在某些实施方式中，所述与pd-l1相关的疾病包括pd-1或pd-l1高表达的肿瘤。例如，在本发明中，所述与pd-l1相关的疾病包括但不限于乳腺癌、肺癌、胃癌、肠癌、食管癌、卵巢癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、神经胶质瘤、黑色素瘤。
102.另一方面中，本发明提供了一种抑制pd-1蛋白与pd-l1蛋白结合的方法，其包括施用本发明所述的抗pd-l1单克隆抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，所述方法可以是离体或体外方法。在某些实施方式中，所述方法可以是非治疗目的的方法。在某些实施方式中，所述方法可包括使生物样品与本发明所述的抗pd-l1单克隆抗体或其抗原结合片段在容许的条件下接触，检测在所述的抗pd-l1单克隆抗体或其抗原结合片段与pd-l1之间是否形成复合物，和检测pd-1与pd-l1之间是否形成复合物。
103.在另一方面，本发明提供了一种刺激淋巴细胞分泌细胞因子的方法，其包括施用所述的抗pd-l1单克隆抗体或其抗原结合片段，所述方法可以是离体或体外方法，或所述方法可以是非治疗目的的方法。例如，本发明所述的抗pd-l1单克隆抗体或其抗原结合片段可以激活淋巴细胞释细胞因子il-2。
104.另一方面，本发明提供了一种用于检测pd-l1蛋白的存在和/或含量的方法，其包括施用本发明所述的抗pd-l1单克隆抗体或其抗原结合片段，所述方法可以是离体或体外方法，所述方法可以是非治疗目的的方法。
附图说明
105.为了更清楚地描述本技术发明所涉及的特点和优势，下面对附图作简要说明如下：图1显示酵母展示文库构建方法示意图；图2显示候选抗体与hpd-l1的结合；图3显示候选抗体阻断pd-1与hpd-l1的结合；图4显示候选抗体激活混合淋巴细胞释放il-2。
具体实施方式
106.本发明的其他特征和优点通过下面的实施例将是显而易见的，该实施例不应理解为是限制性的。如本领域技术人员将认识到的，本发明的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本发明的精神和范围。
107.实施例1 酵母展示文库的构建与筛选选用自建的全人源天然抗体噬菌体文库，针对生物素标记的人pd-l1（简称biotin hpd-l1，acro，货号：pd1-h82e5）及生物素标记的鼠pd-l1（简称biotin mpd-l1，sino，货号：50010-m08h-b）进行四轮淘选，获得针对人、鼠pd-l1阳性富集的噬菌体质粒。
108.如图1所示的酵母展示构建方法，以噬菌体四轮淘选后质粒为模板，设计引物进行聚合酶链式反应（pcr）扩增单链抗体基因（scfv），pcr扩增的scfv基因片段回收后与酵母展示质粒共转入酿酒酵母菌株eby100（购自atcc），通过酿酒酵母的同源重组使scfv基因插入
至酵母展示质粒中，进而实现在酵母细胞壁表面展示单链抗体。酵母展示单链抗体库命名为jyydl022，文库jyydl022电转后在100 ml的sd-trp培养基（clontech，货号：630308），30℃、225转/分钟培养过夜；取1.0
×
108细胞重悬于20 ml ypgp液体培养基（2%半乳糖，2%蛋白胨，1%酵母提取物，0.54% na2hpo4，0.86% nah2po4·
h2o），20℃、225转/分钟培养24小时，置于4℃冰箱待用。
109.文库诱导后菌液，测定菌液的od
600
，按1 od为1.0
×
107细胞数计算，取4.0
×
107细胞进行第一轮流式分选：1）用1 ml 1
×
pbsa（1
×
pbs+1% bsa）洗涤一次，3000转/分钟离心3分钟（以下离心均为此条件）弃上清；与1 ml含100 nm biotin hpd-l1和鼠抗v5（invitrogen，货号：2156578，按1:3000稀释）的1
×
pbsa，室温孵育30分钟，加入1 ml 1
×
pbsa，离心弃上清；2）加入500 μl含荧光抗体的1
×
pbsa streptavidin-pe（简称sa-pe，ebioscience，货号：12-4317-8），按1:200稀释；羊抗鼠-647（invitrogen，货号：a21235），按1:400稀释，避光冰上孵育20分钟；3）加入1 ml 1
×
pbsa，离心弃上清，加入2 ml 1
×
pbsa重悬细胞，收集荧光信号647信号强且pe信号弱的细胞群进行流式分选。分选后细胞命名为jyydl022 s01-r1，经过再次培养、诱导后，置于4℃冰箱待用。
110.取2.0
×
107个jyydl022 s01-r1诱导后细胞进行第二轮流式分选，具体如下：1）加入1 ml 1
×
pbsa，离心弃上清；与1 ml含50 nm biotin mpd-l1和鼠抗v5冰上孵育30 min，加入1 ml 1
×
pbsa，离心弃上清；2）同第一轮筛选方案，加入500 μl含荧光抗体的1
×
pbsa，避光冰上孵育20分钟；3）加入1 ml 1
×
pbsa，离心弃上清，加入2 ml 1
×
pbsa重悬细胞，收集荧光信号647信号强且pe信号弱的细胞群进行流式分选。分选后细胞涂布于sd-trp固体培养基（clontech，货号：630309），30℃静置培养3天。
111.实施例2 单克隆酵母菌落测序与流式染色鉴定jyydl022第二轮筛选产物，涂布于sd-trp平板，30 ℃静置培养3天生长出酵母单克隆菌落。挑取92个单克隆进行测序分析，最终获得12个独一的单链抗体序列。对相应的酵母单克隆菌落进行流式染色分析，各取1
×
106个细胞按表1方案进行染色评估：方案1评估各克隆与biotin hpd-l1结合水平，pe平均荧光信号强度（mfi）值越高代表结合能力越强；方案2评估各克隆与食蟹猴pd-l1（cyno pd-l1）结合水平，apc的mfi值越高代表结合能力越强；方案3评估各克隆与biotin mpd-l1结合水平，pe的mfi值越高代表结合能力越强；方案4评估各克隆与无关抗原的非特异性结合水平，pe的mfi值越低说明非特异性越弱；方案5评估各克隆与阿特珠单抗（atezolizumab）对照抗体（内部制备）的竞争信号，apc的mfi值越低说明竞争性越强。染色结果如表2所示。
112.表1 单克隆酵母菌落流式染色鉴定方案
根据各克隆的染色结果，排除与人、猴、鼠不结合和有非特异性结合的克隆，最终选取克隆y18a2、y18e4、y18d5、y18a5、y18h2、y18c5的序列进行抗体表达。
113.表2 jyydl022文库二轮筛选后酵母单克隆菌落流式染色分析结果实施例3 候选抗体的表达上述得到的抗pd-l1抗体的轻链、重链可变区氨基酸序列按chothia编码规则进行编码及划分cdr区，抗pd-l1抗体的序列信息如表3和表4所示。
114.表3 抗pd-l1抗体的cdr序列信息表4 抗pd-l1抗体可变区序列信息
将上述克隆的重链可变区vh序列与igg1 fc n297a融合，进行密码子优化，基因合成后装入表达载体pcdna 3.4（life technologies），轻链可变区vk序列与kappa的恒定区cl融合构建质粒。抗体轻、重质粒转入expicho细胞（thermo fisher scientific，a29133），根据供应商expicho表达系统方法进行抗体瞬转表达，过程如下：在培养总体积25 ml培养基中，36.5℃，8%二氧化碳浓度下培养expicho细胞到密度6
×
106/ml，使用expifectamine转染试剂化转各10 μg抗体轻重链表达质粒到细胞；转染一天后，各取150 μl和4 ml expicho增强剂和expicho辅料添加到培养细胞中，继续培养至9天，4℃，3500转离心取上清。混合ammag
tm protein a磁珠（genscript，l00695）和抗体表达上清，室温孵育2小时，pbs洗涤两次弃上清，加入适量洗脱缓冲液protein g or a sefinose
tm elution buffer（sangon，c600481），充分混匀后置于试管架上静止孵育5分钟，孵育期间重悬磁珠2-3次，重复洗脱2次，洗脱后，立即加入适量中和液1 m tris-hcl，ph 7.5（sangon，b548124）中和备用，结果如表5所示，利用上述方法能够表达出抗pd-l1抗体。
115.表5 候选抗体表达、纯化数据实施例4 候选抗体与人、猴、鼠pd-l1的结合测定采用octet red96e（fort
é
bio）测定候选抗体分别与人pd-l1、猴pd-l1、鼠pd-l1的结合，抗原及抗体均用1
×
pbst（1
×
pbs：生工，b548117-0500；0.02%吐温20：sigma，p1379）稀释。
116.用ahc传感器（fort
é
bio，货号：18-0015）测定抗体与人pd-l1 his（acro，货号：pd 1-h5229）的亲和力（affinity），人pd-l1使用浓度为50 nm；用ch1传感器（fort
é
bio，货号：18-0015）测定抗体与猴pd-l1-fc（acro，货号：pd1-c5253）的亲合力（avidity），猴pd-l1使用浓度为30 nm，抗体使用浓度均为33.3 nm。
117.首先，将候选抗体样品按200
ꢀµ
l/孔加入96孔板（greiner bio-one，655209），设置软件参数，温度30℃，收集标准动力学信号的频率为5.0 hz；用1
×
pbst预湿传感器10分钟，然后上机检测。每个循环均包含以下步骤：1）浸入缓冲液60 s；2）检测抗原是否与传感器有非特异性结合；3）10 mm ph 1.7的甘氨酸溶液再生；4）浸入缓冲液60 s；5）抗体固化在传感器上，时间为20 s；6）传感器浸入缓冲液180 s；7）抗原与抗体结合，时间180 s；8）抗原抗体的解离，时间10分钟；9）传感器再生。
118.同理，使用sa传感器（fort
é
bio，货号：18-0009）测定抗体分别与biotin hpd-l1、biotin mpd-l1的亲合力（avidity），人和鼠pd-l1使用浓度均为38.5 nm，具体每个循环均包含以下步骤：1）浸入缓冲液60 s；2）检测抗体是否与传感器有非特异性结合；3）换新的传
感器浸入缓冲液60 s；4）抗原固化在传感器上，时间为60 s；5）传感器浸入缓冲液180 s；6）抗原与抗体结合，时间180 s；7）抗原抗体的解离，时间10分钟。
119.最后，采用fort
é
bio的data analysis 12.0软件，对抗原-抗体以1:1的结合方式，测定结合速率（k
on
）和解离速率（k
off
），以此计算抗体的平衡解离常数（kd），结果如表6。
120.表6 候选抗体与人、猴、鼠pd-l1结合、解离测定实施例5 候选抗体与细胞表面pd-l1的结合由实施例4可知，ab1910t5与抗原无特异性结合，后续实验中作为阴性对照使用。采用facs鉴定ab1910t2、ab1910t5与chok1-h pd-l1（genscript m00543）的结合，候选抗体及atezolizumab稀释至50 μg/ml作为初始浓度，后依次3倍稀释12个梯度。收集chok1-hpd-l1细胞：2000转离心5分钟，5e6细胞/板，用预冷的facs buffer（1
×
pbs+2% fbs）重悬，按5e4/孔铺于96孔u型板中，室温封闭15分钟，封闭结束后，2000转离心5分钟，弃上清，将稀释好的候选抗体及atezolizumab依次加入，100 μl/孔，4℃孵育1小时；离心弃上清，用facs buffer洗2次。每孔加入100 μl按1:1000稀释的羊抗人偶联alexa fluo 488（thermo fisher，货号：a11013），4℃孵育1小时；离心弃上清，用facs buffer洗2次，用30 μl重悬细胞，上机流式细胞仪检测（intellycite plus）。
121.结果如图2所示，本技术抗pd-l1抗体ab1910t2表现出与细胞表面抗原pd-l1的结合活性，ec
50
值为0.02 μg/ml；atezolizumab结合活性ec
50
值为0.03 μg/ml，说明ab1910t2的结合活性良好。
122.实施例6 候选抗体阻断chok1-h pd-l1与biotin pd-1结合能力采用facs鉴定ab1910t2、ab1910t5阻断biotin-pd-1结合chok1-h pd-l1的功能。候选抗体配制成100 μg/ml作为初始浓度，3倍稀释，共稀释12个梯度待用；离心收集chok1-hpd-l1细胞，按5e4细胞/孔铺于96孔板中，室温封闭15分钟；取biotin pd-1 mfc（acro，货号：pd 1-h82f1）配制成2 μg/ml待用；封闭结束后，离心弃上清，将稀释的候选抗体与biotin pd-1 mfc稀释液1:1混匀，4℃孵育1小时；离心弃上清，用facs buffer洗2次；每孔加入100 μl按1:1000稀释的羊抗人偶联alexa fluo 488，4℃孵育1小时；离心弃上清，用facs buffer洗2次，用30 μl重悬细胞，上机流式细胞仪检测（intellycite plus）。
123.结果如图3所示，本技术抗pd-l1抗体ab1910t2能够阻断细胞表面抗原pd-l1与pd-1的结合，ic
50
值为1.02 μg/ml；atezolizumab阻断活性ic
50
值为0.99 μg/ml，说明ab1910t2阻断pd-l1与pd-1结合的活性良好。
124.实施例7 抗pd-l1抗体体外功能评估选取ab1910t2、ab1910t5及atezolizumab测定抗pd-l1抗体激活混合淋巴细胞释放il-2的能力，具体如下：使用细胞培养基（1640 +2% fbs）复苏人树突状dc细胞，调整dc细胞密度至1
×
10
5-1
×
10
7 cells/ml，然后加入终浓度为50 μg/ml丝裂霉素c，37℃避光处理30分钟后加入10 ml培养基终止，400 g离心10分钟，随后用10 ml培养基清洗一遍。梯度稀
释抗pd-l1抗体：抗体最高终浓度为2.5
ꢀµ
g/ml（配制浓度为10
ꢀµ
g/ml），10倍梯度稀释（5个浓度点+1个0浓度点），然后相应细胞培养板（康宁，货号：3599）中加入50 μl配制好的抗pd-l1抗体。收集人外周血淋巴细胞pbmc和丝裂霉素c处理好的dc细胞，调整dc细胞密度至2
×
10
5 cells/ml，随后将细胞加入培养板中，每孔50 μl，即dc细胞数为1
×
10
4 cells/孔；调整pbmc细胞密度至2
×
10
6 cells/ml，随后将细胞加入培养板中，每孔100 μl，即pbmc细胞数为2
×
10
5 cells/孔。将细胞培养板置于37℃、5%二氧化碳细胞培养箱孵育3天，3天后，300 g离心5分钟，收集上清用human il-2 elisa试剂盒（novus，货号：val110）检测il-2含量，检测方法严格按照试剂盒说明书进行，数据用graphpad prism软件进行处理。
125.结果如图4所示，本技术抗pd-l1抗体ab1910t2能够刺激淋巴细胞分泌细胞因子，且ab1910t2表现出与atezolizumab相似的活性。
126.实施例8 抗pd-l1抗体理化性质评估候选抗体ab1910t2的表达量、亲和力、体外功能较为理想，对其继续进行理化成药性评估，具体如下：8.1 sec-hplc纯度分析（1）将样品浓度调整至1 mg/ml，混匀，12000 rpm离心5 min，取上清转至样品瓶，放入hplc样品盘。设置色谱条件如表7所示：表7 sec-hplc色谱条件（2）色谱柱采用流动相（200 mm磷酸盐缓冲液，ph 6.8）平衡后，进样分析，用色谱软件进行数据分析，峰面积归一化法计算各个峰的峰面积百分比，百分比越高说明抗体纯度越高。
127.8.2 hic-hplc分析（1）将样品浓度调整至1 mg/ml，离心取上清待测。设置色谱条件如表8所示：表8 hic-hplc色谱条件
（2）用流动相a（50 mm磷酸盐缓冲液/1 m硫酸铵，ph 7.0）和流动相b（50 mm磷酸盐缓冲液，ph 7.0）进行梯度洗脱，记录主峰保留时间，出峰时间短则抗体亲水性强。
128.8.3 熔解温度（tm）值分析将样品浓度调整至1 mg/ml，然后按照protein thermal shift
™ꢀ
starter kit说明书，取供试品溶液13
ꢀµ
l加入至pcr管内，加入5
ꢀµ
l protein thermal shift
tm buffer，加入2
ꢀµ
l10
×
染色液，使反应体积为20
ꢀµ
l，混匀后，12000 rpm离心5 min以去除气泡。将检测样品置于pcr仪内，进行样品分析，记录样品的tm值，tm值越高表示抗体的热稳定性越好。
129.根据表9可知，候选抗体ab1910t2的纯度、热稳定性、亲水性等理化指标较为理想。
130.表9 候选抗体理化性质分析结果综合实施例4-7可知，全人源候选抗体ab1910t2具有特异性结合人、猴、鼠pd-l1的能力，体外细胞水平与人pd-l1的结合及阻断能力较好，同时在表达量、理化性质等方面均符合内部成药性标准，可作为候选分子继续开发。
131.虽然以上仅描述了本发明的具体实施方式范例，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出更多变更或修改，但这些变更或修改均落入本发明的保护范围。