一种高强度琼脂糖微球的制备方法与流程

1.本发明涉及蛋白质层析填料的制备技术领域，尤其涉及一种高强度琼脂糖微球的制备方法。


背景技术：

2.天然多糖具有良好的亲水性和生物相容性，其与蛋白不产生非特异性结合，能够维持蛋白的构相，保持蛋白的活性。多糖基质的蛋白纯化填料是目前蛋白质分离纯化工业使用的最主要的填料之一。
3.琼脂糖是由1.3-链接的β-d-吡喃半乳糖和1,4-连接的3.6-脱水-α-l吡喃半乳糖残基交替连接而成的线性复合多糖。在加热时，分子链解离，形成均相的溶液，当温度降低时，形成双螺旋结构，然后聚集成胶束。通过调控琼脂糖溶液的浓度，可得到孔径不同的琼脂糖凝胶微球。琼脂糖微球具有天然的大孔结构，结构稳定，生物相容性好，可再生性强，是目前最主要的多糖类填料，在实验室研发和大规模的工业生产中具有广泛的应用。
4.随着近年国内生物医药行业和体外诊断等行业的快速发展，蛋白纯化填料的市场需求也随着变大。当前生物医药的迅速发展,人们对蛋白类药物的需求量日益增长，同时也对蛋白分离纯化的技术提出了挑战。快速、高效的分离纯化技术是必然的发展需求，其中的层析介质是一个核心技术。其中蛋白纯化是生物药生产的核心环节，决定产品的质量，也决定着整个下游生产成本的高低。目前制备高流速和高耐压的主要思路是通过对琼脂糖微球进行多次交联，提升基球的刚性。其中中国专利cn106432816b中，采用溴丙烯或烯丙基缩水甘油醚对降解的琼脂糖进行改性，再与未降解的琼脂糖混合后进行乳化制备琼脂糖微球，之后再通过溴化反应进一步交联，为了提升强度，后续采用环氧氯丙烷进行交联，制备出高强度微球。美国专利us6602990b1中采用了烯丙基缩水甘油醚对琼脂糖进行改性，然后乳化成球后，再进行多次溴化交联，或采用环氧氯丙烷交联制备高强度微球。
5.但是其琼脂糖微球制备过程复杂，需要多步或重复的交联的过程，不能够满足使用需要，因此提出了一种高强度琼脂糖微球的制备方法用于解决上述问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种高强度琼脂糖微球的制备方法。
7.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
8.一种高强度琼脂糖微球的制备方法，包括以下步骤：
9.s1：在80℃～120℃将琼脂糖溶于水中，得到质量分数为2％～15％的琼脂糖水溶液，作为水相，将水相加入到含乳化剂的油相中，在55℃～80℃搅拌乳化0.5h～2h后，降温至25℃以下固化0.5～2h，得到琼脂糖微球；
10.s2：将上述琼脂糖微球与烯丙基改性剂加入到浓度为0.1mol/l～4mol/l的氢氧化钠溶液中，在30℃～50℃和搅拌速度为150rpm～300rpm下反应8～24h，再使用无水乙醇洗
涤3～5次，得到烯丙基化的琼脂糖微球；
11.s3：将得到的烯丙基化琼脂糖微球与单体和引发剂加入到有机溶剂中，30～50℃反应12～24h，再使用无水乙醇洗涤3次，得到高强度琼脂糖微球。
12.优选的，所述s1中，油相是甲苯、液体石蜡和环己烷中的一种。
13.优选的，所述s1中，乳化剂为span80，乳化剂质量为油相质量的1％～8％。
14.优选的，所述s2中，烯丙基改性剂为3-卤代丙烯、烯丙基缩水甘油醚或甲基丙烯酸缩水甘油醚中的一种。
15.优选的，所述s2中，烯丙基改性剂用量为琼脂糖微球质量的10％～50％。
16.优选的，所述s3中，单体为烯丙基缩水甘油醚、甲基丙烯酸缩水甘油醚、甲基丙烯酸羟乙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇甲基丙烯酸乙酯和二乙烯基苯中的一种或组合，单体用量为琼脂糖微球质量的40％～80％。
17.优选的，所述s3中，有机溶剂为无水乙醇、丙酮、1,4-二氧六环、二甲基亚砜和甲苯中的一种或组合，有机溶剂的质量为琼脂糖微球质量的1～2倍。
18.优选的，所述s3中，引发剂为偶氮二异丁腈、过氧化苯甲酰和过硫酸盐/四甲基乙二胺复合引发剂中的一种，引发剂用量为单体质量的0.5％～5％。
19.本发明的有益效果：
20.(1)本发明提出的一种高强度琼脂糖微球的制备方法，通过烯丙基化修饰改性琼脂糖微球，再经过一步聚合反应制得高强度琼脂糖微球，制备过程简单，无需多步或重复的交联过程；
21.(2)本发明提出的一种高强度琼脂糖微球的制备方法，制备的高强度琼脂糖微球，既保留了天然多糖的骨架结构，保证了微球良好的亲水和生物相容性，同时也形成了碳-碳键，较传统的环氧氯丙烷等形成醚键的结构相比，具有更高的刚性，能较明显地提升琼脂糖微球的强度；
22.(3)本发明提出的一种高强度琼脂糖微球的制备方法，制备琼脂糖微球时，选用不同侧链的单体，可通过在交联的同时，在琼脂糖微球上引入功能基团，如采用甲基丙烯酸或丙烯磺酸钠，可直接制备具有阳离子交换功能的琼脂糖微球，采用甲丙烯酸苯酯可直接制备具有疏水结功能的琼脂糖微球。
附图说明
23.图1为本发明提出的一种高强度琼脂糖微球的制备方法实施例一中4％烯丙基化琼脂糖微球的示意图；
24.图2为本发明提出的一种高强度琼脂糖微球的制备方法实施例三中6％烯丙基化琼脂糖微球的示意图；
25.图3为本发明提出的一种高强度琼脂糖微球的制备方法实施例一中4％高强度琼脂糖微球的示意图；
26.图4为本发明提出的一种高强度琼脂糖微球的制备方法实施例二中10％高强度琼脂糖微球的示意图；
27.图5为本发明提出的一种高强度琼脂糖微球的制备方法实施例三中6％高强度琼脂糖微球的示意图；
28.图6为本发明提出的一种高强度琼脂糖微球的制备方法实施例四中6％高强度琼脂糖微球的示意图；
29.图7为本发明提出的一种高强度琼脂糖微球的制备方法实施例1至实施例4和市售商品的压力-流速曲线对比图；
30.图8为本发明提出的一种高强度琼脂糖微球的制备方法实施例三中高强度琼脂糖微球的电子扫描电镜图片；
31.图9为本发明提出的一种高强度琼脂糖微球的制备方法实施例三中高强度琼脂糖微球表面的电子扫描电镜图片。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
33.实施例一
34.一种高强度琼脂糖微球的制备方法，包括以下步骤：
35.s1：在80℃下将琼脂糖溶于水中，得到琼脂糖质量分数为4％的琼脂糖溶液，将液体石蜡(含1％span80)加热到55℃，得到油相；将上述琼脂糖溶液一次性加入油相中，在55℃和转速为150rpm的条件下搅拌0.5h，在30min内将温度降至20℃以下，继续搅拌2h，清洗后得到琼脂糖微球；
36.s2：将得到的琼脂糖微球100g和50g烯丙基缩水甘油醚、加入到浓度为0.1mol/l的氢氧化钠溶液中，在30℃和150rpm条件下反应8h，用无水乙醇洗涤3次，得到烯丙基化改性的琼脂糖微球。改性琼脂糖微球的烯丙基密度为168μmol/g；
37.s3：将100g烯丙基化改性的琼脂糖微球和80g烯丙基缩水甘油醚、0.5g偶氮二异丁腈加入到100ml无水乙醇中，50℃反应24h，使用无水乙醇洗涤3次后，得到高强度琼脂糖微球，可以制备质量浓度为4％的高流速琼脂糖微球。
38.采用aisvi bx53-hk83型光学显微镜观察烯丙基化琼脂糖微球和高强度琼脂糖微球的形貌，烯丙基化琼脂糖微球表面光滑规整(图1)，高强度琼脂糖微球形状未发生形变。
39.高强度琼脂糖微球匀浆后装入层析柱中(φ2.6cm
×
30cm)，床层稳定后，接入scg-p蛋白纯化系统，采用恒压模式测定在固定压力下能够得到的最大流速，如图7所示，制得的高强度琼脂糖微球的最大流速为843cm/h。
40.实施例二
41.一种高强度琼脂糖微球的制备方法，包括以下步骤：
42.s1：采用高温灭菌锅，在120℃下将琼脂糖溶于水中，得到琼脂糖质量分数为10％的琼脂糖溶液，将液体石蜡(含8％span80)加热到80℃，得到油相；将上述琼脂糖溶液一次性加入油相中，在80℃下和转速为300rpm的条件下搅拌1h，在30min内将温度降至20℃以下，继续搅拌2h，清洗后得到琼脂糖微球；
43.s2：将得到的琼脂糖微球100g和10g烯丙基缩水甘油醚、加入到浓度为4mol/l的氢氧化钠溶液中，在50℃和150rpm条件下反应24h，用无水乙醇洗涤3次，得到烯丙基化改性的琼脂糖微球。改性琼脂糖微球的烯丙基密度为347μmol/g；
44.s3：将所述的100g烯丙基化改性的琼脂糖微球和40g甲基丙烯酸羟乙酯、2g偶氮二
异丁腈加入到100ml二甲基亚砜中，50℃反应24h，使用无水乙醇洗涤3次后，得到高强度琼脂糖微球，可以制备质量浓度为10％的高流速琼脂糖微球。
45.与实施例1相同的测试方法测定高强度琼脂糖微球的流速，0.5mpa最高流速为1067cm/h(图7)。
46.实施例三
47.一种高强度琼脂糖微球的制备方法，包括以下步骤：
48.s1：在100℃下将琼脂糖溶于水中，得到琼脂糖质量分数为6％的琼脂糖溶液，将液体石蜡(含4％span80)加热到60℃，得到油相；将上述琼脂糖溶液一次性加入油相中，在60℃下和转速为250rpm的条件下搅拌1h，在30min内将温度降至20℃以下，继续搅拌2h，清洗后得到琼脂糖微球；
49.s2：将得到的琼脂糖微球100g和50g烯丙基缩水甘油醚、加入到浓度为2mol/l的氢氧化钠溶液中，在40℃和150rpm条件下反应24h，用无水乙醇洗涤3次，得到烯丙基化改性的琼脂糖微球。改性琼脂糖微球的烯丙基密度为425μmol/g。
50.s3：将所述的100g烯丙基化改性的琼脂糖微球和40g烯丙基缩水甘油醚、40g乙二醇二甲基丙烯酸酯、1g偶氮二异丁腈加入到100ml二甲基亚砜中，50℃反应24h，使用无水乙醇洗涤3次后，得到高强度琼脂糖微球，可以制备质量浓度为6％的高流速琼脂糖微球。
51.采用型电子显微镜观察制备的高强度琼脂糖微球，微球表面光滑(图8)，高放大倍数下可以看到微球表面仍保留多孔的结构(图9)。
52.与实施例一相同的测试条件，测得的高强度琼脂糖微球的最大流速为1002cm/h(图7)。
53.实施例四
54.一种高强度琼脂糖微球的制备方法，包括以下步骤：
55.s1：在100℃下将琼脂糖溶于水中，得到琼脂糖质量分数为6％的琼脂糖溶液，将液体石蜡(含4％span80)加热到60℃，得到油相；将上述琼脂糖溶液一次性加入油相中，在60℃下和转速为250rpm的条件下搅拌1h，在30min内将温度降至20℃以下，继续搅拌2h，清洗后得到琼脂糖微球；
56.s2：将得到的琼脂糖微球100g和50g烯丙基缩水甘油醚、加入到浓度为2mol/l的氢氧化钠溶液中，在40℃和150rpm条件下反应24h，用无水乙醇洗涤3次，得到烯丙基化改性的琼脂糖微球。改性琼脂糖微球的烯丙基密度为397μmol/g。
57.s3：将所述的100g烯丙基化改性的琼脂糖微球和60g甲基丙烯酸羟乙酯醚、20g聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、1g过硫酸铵/四甲基乙二胺(0.5g/0.5g)加入到100ml 1，4-二氧六环中，30℃反应24h，使用无水乙醇洗涤3次后，得到高强度琼脂糖微球，可以制备质量浓度为6％的高流速琼脂糖微球。
58.与实施例一相同的测试条件，测得的高强度琼脂糖微球的最大流速为907cm/h(图7)。
59.本发明制备的高强度琼脂糖微球，既保留了天然多糖的骨架结构，保证了微球良好的亲水和生物相容性，同时也形成了碳-碳键，较传统的环氧氯丙烷等形成醚键的结构相比，具有更高的刚性，能较明显地提升琼脂糖微球的强度，制备琼脂糖微球时，选用不同侧链的单体，可通过在交联的同时，在琼脂糖微球上引入功能基团，如采用甲基丙烯酸或丙烯
磺酸钠，可直接制备具有阳离子交换功能的琼脂糖微球，采用甲丙烯酸苯酯可直接制备具有疏水结功能的琼脂糖微球。
60.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
61.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。