CamkB转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法

camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法。


背景技术：

2.心力衰竭(简称心衰)是由各种原因的初始心肌损伤，引起心脏结构和功能的变化，导致心室充盈或射血能力受损的一种复杂的临床综合征，目前认为慢性心力衰竭发生发展的基本机制是心肌病理性重构，心衰的进展包括两个主要关键过程，一个过程是心肌死亡，另一个则是神经内分泌系统过度激活所致的系统反应，主要与肾素-血管紧张素-醛固酮系统和交感神经系统过度兴奋有关，干预这两个关键过程是有效预防和治疗心衰的基础，然而，由于医学伦理的限制，对慢性心力衰竭疾病机制及药效研究需要借助动物模型。
3.能够广泛应用于慢性心力衰竭疾病机制及药效研究的动物模型应该满足下条件：模型能够反映疾病主要的病理机制、症状、体征；模拟临床疾病的实际发病特点程度高；模拟临床疾病的病变程度可控，且具有良好的重复性；动物遗传背景资料完整；制备模型的方法先进，容易开展；实验动物经济，易于饲养，小鼠等哺乳类动物为制备动物模型的最佳选择。
4.在结合以上的说明和现有技术制备模型成本高，制备手段容错率低的缺点，通过以小鼠为载体，使用crisp-cas9体外转录转基因技术以及in-fusioncloning构建同源重组的方式结合，依靠观察，检测术后模型宏观表征、超声心动指标、组织形态学指标的心衰模型的制备方法刻不容缓，于是现在提出 camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法。


技术实现要素：

5.(一)发明目的
6.为解决背景技术中存在的技术问题，本发明提出camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法，本发明通过使用常规的crispr-cas9体外转录技术，实现降低容错率的效果同时，提升转录的效率，减低转录的成本，并且相较于常用的ta克隆、限制性酶切克隆及平滑末端克隆等方法存在连接效率低、需要特定限制性酶切位点以及耗时较长等缺点，本发明中采用的 in-fusion cloning方法能够将任意dna片段克隆到任意线性化载体中，在进行pcr反应后，充分确保了目的基因的高保真性。
7.(二)技术方案
8.本发明提供了camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法，有如下步骤：
9.步骤一：运用crisp-cas9转基因技术，构建camkiiδb基因过表达小鼠；
10.步骤二：再通过终浓度为20mg/ml的他莫昔芬隔天注射，一共注射5次，注射剂量为50mg/kg，诱导camkiiδb基因过表达，1周后小鼠出现射血分数降低的心衰表型。
11.作为本发明一种优选的方案，根据步骤一和步骤二还有如下详细的操作流程：
12.1)查询ncbi获得鼠源camkⅱδbcdna序列，通过体外转录的方式，获得cas9mrna和grna，通过构建同源重组的方式，在rosa26基因位点定点插入cag-lslcamkiiδb-3xha-ires-eyfp表达框，将cas9mrna、grna和donorvector显微注射到c57bl/6j小鼠的受精卵中，经pcr鉴定小鼠尾巴中基因型，获得camkⅱδc条件性过表达小鼠的f0代；
13.2)将f0代小鼠与野生型c57bl/6j小鼠交配获得f1代小鼠，将f1代小鼠和心肌特异性myh6-cre-ert2小鼠交配，经他莫昔芬(tamoxifen)诱导后，在心肌内特异性表达camkⅱδb，以同窝野生小鼠作为阴性对照组，同时f1代鼠与myh6-cre-ert2小鼠交配后，获得心肌特异性camkiiδb过表达小鼠，即f2代鼠，进行基因型鉴定杂合子小鼠，并进行分组，分为正常组和模型组，并将两组小鼠均腹腔注射他莫昔芬，注射5次，剂量为50mg/kg；
14.3)最后超声心动图检测，在他莫昔芬注射1周后，测量超声心动图后取材，利用qpcr测定camkiiδb的mrna表达水平。
15.作为本发明一种优选的方案，同源重组载体(donorvector)包含3.6kb5’同源臂、cag-lslcamkiiδb-3xha-ires-eyfp和3.3kb3’同源臂。
16.作为本发明一种优选的方案，
①
中的体外转录的方式采用crispr/cas9技术。
17.作为本发明一种优选的方案，
②
中构建同源重组的方式为in-fusioncloning的方法。
18.作为本发明一种优选的方案，
⑥
中的f2代鼠标记为camkiiδb条件性过表达小鼠f2代鼠。
19.与现有技术相比，本发明的上述技术方案具有如下有益的技术效果：
20.1、本发明通过使用应用最为广泛的crispr-cas9技术进行体外转录，实现降低容错率的效果，且crispr-cas9是继zfn、talens等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，是现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低、最容易上手的技术之一，为当今最主流的基因编辑系统。
21.2、本发明在构建同源重组的过程中使用in-fusioncloning方法，相较于常用的ta克隆、限制性酶切克隆及平滑末端克隆等方法存在连接效率低、需要特定限制性酶切位点以及耗时较长等缺点，in-fusioncloning方法用一步法将任意dna片段克隆到任意线性化载体中，能够实现0.05-15kbdna片段的克隆，还可以同时克隆两个或多个dna片段，无需亚克隆，且整个过程不附加多余序列，同时进行pcr反应，充分确保了目的基因的高保真性。
22.综上所述，本发明通过使用常规的crispr-cas9体外转录技术，实现提升容错率的效果同时，提升转录的效率，减低转录的成本，并且相较于常用的ta克隆、限制性酶切克隆及平滑末端克隆等方法存在连接效率低、需要特定限制性酶切位点以及耗时较长等缺点，本发明中采用的in-fusioncloning方法能够将任意dna片段克隆到任意线性化载体中，在进行pcr反应后，充分确保了目的基因的高保真性。
附图说明
23.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途
径得到，需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.在本发明中，术语“药学上可接受的”，表示考虑到待治疗的疾病或病症以及相应的施用途径，所指出的材料不具有引起合理谨慎的医师避免将该材料施用于患者的性质。例如，通常要求这种材料基本上是无菌的。
25.在本发明中，术语“治疗”是指在伤害或干预之前、期间和/或之后预防、治愈、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制、制止和/或停止疾病或病症的一种或多种临床症状。
26.在本发明中，术语“患者”或“对象”是指用药物组合物或根据本文所述的方法治疗的动物，包括哺乳动物，例如，鼠、犬、马、牛、猿或人类，特别是人类。
27.本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文，下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.图1为本发明提出的camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法的操作步骤流程示意图。
29.图2为本发明提出的camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法的f1代小鼠5’同源臂pcr鉴定测序比对结果示意图。
30.图3为本发明提出的camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法的测序反应比对结果示意图。
31.图4为本发明提出的camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法的f1代小鼠3’同源臂pcr鉴定测序比对结果示意图。
32.图5为本发明提出的camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法的测序反应比对结果示意图。
33.图6为本发明提出的camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法的目的基因的pcr鉴定方法示意图。
34.图7为本发明提出的camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法的目的基因结果示意图。
35.图8为本发明提出的camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法的目的基因结果示意图。
36.图9为本发明提出的camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法的cre基因的pcr鉴定示意图。
37.图10为本发明提出的camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法的cre基因的pcr鉴定示意图。
38.图11为本发明提出的camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法的cre基因的pcr鉴定示意图。
39.图12为本发明提出的camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法的超声心动图结果示意图。
40.图13为本发明提出的camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法的左心室射血分数结果示意图。
41.图14为本发明提出的camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法的camkiiδb的mrna相对表达量示意图。
42.图15为本发明提出的camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法的模型组诱导前超声心动图-射血分数正常示意图。
43.图16为本发明提出的camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法的模型组诱导后超声心动图-射血分数明显降低示意图。
具体实施方式
44.下文的描述本质上仅是示例性的而并非意图限制本公开、应用及用途。应当理解，在所有这些附图中，相同或相似的附图标记指示相同的或相似的零件及特征。各个附图仅示意性地表示了本公开的实施方式的构思和原理，并不一定示出了本公开各个实施方式的具体尺寸及其比例。在特定的附图中的特定部分可能采用夸张的方式来图示本公开的实施方式的相关细节或结构。
45.实施例：camkb转基因致射血分数降低型心衰模型的搭建方法，查询 ncbi获得鼠源camkⅱδb cdna序列，采用crispr/cas9技术，通过体外转录的方式，获得cas9 mrna和grna，并通过in-fusion cloning的方法构建包含3.6kb 5’同源臂、cag-lslcamkiiδb-3xha-ires-eyfp和3.3kb 3’同源臂的同源重组载体，通过同源重组的方式，在rosa26基因位点定点插入cag-lslcamkiiδb-3xha-ires-eyfp表达框，并将cas9 mrna、 grna和donor vector显微注射到c57bl/6j小鼠的受精卵中，在经过pcr 技术鉴定小鼠尾巴中基因型后，获得camkⅱδc条件性过表达小鼠的f0 代；
46.随后再将f0代小鼠与野生型的c57bl/6j小鼠交配，获得f1代小鼠，接着将f1代小鼠和心肌特异性myh6-cre-ert2小鼠交配，经他莫昔芬 (tamoxifen)诱导后，在心肌内特异性表达camkⅱδb，以同窝野生小鼠作为阴性对照组，f1代鼠与myh6-cre-ert2小鼠交配，获得心肌特异性camkiiδb过表达小鼠，即f2代鼠，进行基因型鉴定杂合子小鼠，在进行分组后，分为正常组：8周龄同窝野生型小鼠(n＝8)，模型组：8周龄杂合子 camkiiδb条件性过表达小鼠(n＝8)，并将两组小鼠均腹腔注射他莫昔芬 (20mg/ml)，隔天注射，注射5次，剂量为50mg/kg，最后超声心动图检测，在他莫昔芬注射1周后，测量超声心动图后取材，利用qpcr测定camkiiδ b的mrna表达水平，得出射血分数降低的心衰模型。
47.具体的，在f1代阳性小鼠pcr鉴定产物测序中，共进行了4个测序反应，测序反应对应的区域，如图2所示，其中，5’为同源臂鉴定，而pcr产物测序共进行了2个测序反应，在图中分别标注为：1、2、3’同源臂鉴定，而pcr 产物测序共进行了2个测序反应，分别标注为：3、4，测序比对结果以3号阳性小鼠为例；
48.具体的，query为目的序列(r26-e(cag-lsl-camkiiδ b-3xha-ires-eyfp-wpre-pa)1recombinated genomic dna sequence)， subject为测序结果，红色下划线碱基为5arm同源臂序列(图2所示)。
49.具体的，query为目的序列(r26-e(cag-lsl-camkiiδb-3xha-ires-eyfp-wpre-pa)1recombinated genomic dna sequence)， subject为测序结果，红色下划线碱基为5arm同
源臂序列，蓝色下划线碱基为 knock-in序列(如图3所示)。
50.具体的，query为目的序列(r26-e(cag-lsl-camkiiδ b-3xha-ires-eyfp-wpre-pa)1recombinated genomic dna sequence)， subject为测序结果，红色下划线碱基为3arm同源臂序列，蓝色下划线碱基为 knock-in序列(如图4所示)。
51.具体的，query为目的序列(r26-e(cag-lsl-camkiiδ b-3xha-ires-eyfp-wpre-pa)1recombinated genomic dna sequence)， subject为测序结果，红色下划线碱基为3arm同源臂序列(图5所示)。
52.具体的，小鼠基因组使用引物对(p1，p2)，(p3，p4)分别扩增：野生型：只有(p1，p2)扩增出994bp条带，(p3，p4)无条带；杂合子：(p1， p2)扩增出994bp条带，(p3，p4)也扩增出小条带872bp；纯合子：(p1， p2)无条带，(p3，p4)可扩增出小条带872bp(如图6所示)。
53.具体的，与对照组诱导后相比，模型组诱导后，ef、fs明显下降，p＜0.05，差异具有统计学意义，证明小鼠出现心力衰竭(如图13所示)。
54.具体的，与对照组诱导后相比，模型组诱导后，camkiiδb基因表达较对照组增加约50倍(如图14所示)。
55.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。