与黄瓜C9香气（E,Z）-2,6-壬二烯-1-醇相关的InDel分子标记及应用

与黄瓜c9香气(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇相关的indel分子标记及应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种与黄瓜c9香气(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇相关的indel分子标记及应用。


背景技术：

2.黄瓜，为葫芦科甜瓜属植物，是世界范围内广泛种植的一种蔬菜。独特的芳香气味是黄瓜的重要特色，是黄瓜品质的一个重要组成部分，也是广受消费者欢迎的重要保证。
3.已经有研究表明c6和c9醛类和相应的醇类等挥发性化合物是构成黄瓜风味的主体香气成分。其中c6醛和其相应的醇大多具有青草香味和绿色植物的气息，而c9醛和其相应的醇多具有黄瓜、甜瓜等瓜香味或花香味。这两类物质含量及其比例对黄瓜果实风味有重要的影响。研究表明c6、c9醛类香气物质的产生是以植物体内游离的脂肪酸(即亚麻酸和亚油酸)为主要底物，经过脂氧合酶(lox)催化进行加氧反应，产生的氢过氧化物(hpos)，然后通过脂氢过氧化物裂解酶(hpl)途径转化成醛或醇，从而形成宜人的清香气味。c6醛类香气的特征效应化合物有hexanal、2-hexenal、1-hexanol和(z)-3-hexen-1-ol等，c9醛类香气的特征效应化合物为(z,z)-3,6-nonadienal、(e)-2-nonenal、(z)-3-nonen-1-ol、(z)-6-nonen-1-ol等。
4.目前黄瓜果实品质的改良受到越来越多黄瓜育种工作者的重视。如何改良果实香气形成消费者喜爱的果实风味，以满足人们不断增长的对果实品质的需求，是当前果实品质改良的热点问题。
5.分子标记辅助育种是利用分子标记与决定目标性状基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记来快速、准确的选择具有目性状的品种。利用分子标记进行辅助育种，极大的缩短了育种年限，提高了育种的效率，加快了育种进程。但是目前没有关于黄瓜果实香气分子标记的报道，因此开发与黄瓜果实香气紧密连锁的分子标记对于果实品质的改良意义重大。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明涉及一种与黄瓜c9香气(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇相关的indel分子标记及应用，该标记与控制黄瓜c9化合物的cslox基因(csav3_2g005360)紧密连锁，通过该标记检测黄瓜基因组dna与indel分子标记的关联进行果实醛类香气(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇含量高低的分子标记辅助选择，这对黄瓜高品质育种和种质资源的鉴定具有重要意义。
7.为解决现有技术存在的问题，本发明的技术方案是：与黄瓜c9香气(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇相关的indel分子标记及应用，其特征在于：筛选候选qtl区间内脂氧合酶代谢途径上的关键基因，进而确定与(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇含量相关的候选基因。
8.所述的候选基因是基于重测序数据对筛选到的关键基因进行序列分析，将双亲间
基因组序列呈现明显变异的csav3_2g005360基因作为候选基因。
9.所述的indel分子标记是根据csav3_2g005360基因在双亲中一个亲本的基因组序列插入一段dna序列进行开发的。
10.所述的分子标记用于对c9香气化合物(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇含量高低鉴定的应用。
11.与现有技术相比，本发明的优点如下：
12.1、本发明c9香气化合物(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇indel分子标记位于csav3_2g005360基因内含子区，用于检测核苷酸序列的8bp片段插入的变异多态性。
13.2、本发明的黄瓜果实c9香气化合物(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇indel分子标记能够准确鉴定黄瓜果实c9香气化合物的含量，鉴定效率在q16
×
q24构成的f6重组自交系群体中鉴定效率为80％，为进一步加快分子标记在香气品质育种领域的应用提供了理论依据和技术基础。
14.3、本发明的鉴定方法简单方便，效率高。
附图说明
15.图1为2019年黄瓜果实(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇含量的qtl作图结果。
16.图2为2020年黄瓜果实(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇含量的qtl作图结果。
17.图3为csav3_2g005360基因在亲本中的基因组序列变异分析。
18.图4为在csav3_2g005360基因第五内含子8bp插入的位点示意图。
19.图5为indel分子标记在重组自交系(ril)群体中的基因型和(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇含量的测定。
20.图6为indel分子标记在自然群体中的基因型及和(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇含量的测定。
具体实施方式
21.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
22.本发明旨在基于q16
×
q24杂交组合的重组自交系群体(ril)分离群体开发一个与黄瓜c9香气(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇相关的indel分子标记，其采用的方法步骤为：
23.步骤1：对129个f6代来自于q16
×
q24杂交组合的重组自交系群体进行简化基因组测序，利用基因组测序获的snp标记构建高密度遗传图谱，并通过醛类香气的测定获得香气表型数据；
24.步骤2：基于构建的高密度遗传图谱对大部分c9化合物进行qtl定位，筛选lod值大于等于3.0的qtl位点；
25.步骤3：筛选qtl区间内脂氧合酶代谢途径上的关键基因，进而确定主要qtl位点的候选基因。
26.步骤4：对亲本进行深度为20
×
的重测序，根据重测序结果筛选lod值大于等于3.0的qtl位点对应的区间，分析候选脂氧合酶基因csav3_2g005360在两个亲本之间的序列，明
确候选基因在两个亲本间的变异情况；
27.步骤5：确定候选基因在两个亲本之间的变异，根据变异的插入位点设计indel标记，在ril群体中验证indel标记的基因分型与c9化合物(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇含量高低的对应关系；
28.步骤6：在自然群体中验证indel标记的基因分型与c9化合物(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇含量高低的对应关系。
29.以下是与黄瓜c9香气(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇相关的indel分子标记及应用开发的具体步骤：
30.1.实验操作
31.1.1dna提取：从129个f6代重组自交系群体和两个亲本的嫩叶中提取基因组dna，用于进行基因组重测序，使用ctab法提取植株总dna，ctab的配制方法：20g ctab、81.9g nacl、7.46g edta-na2·
2h2o、0.8g nacl、12.14g tris碱和2g pvp，溶解定容至1l。采取1g左右植物组织鲜样于灭菌的2ml离心管里，放入液氮中冷冻并研磨，提取后采用nanodrop微量紫外分光光度计测定浓度。
32.1.2遗传图谱构建：对129个f6代重组自交系群体dna进行基因组重测序，通过对测序得到的snp标记进行筛选，共得到1301个高质量的snp标记。基于复合区间作图法构建了基于gbs(genotyping-by-sequencing)的snp高密度遗传图谱。
33.1.3果实c9化合物测定：对重组自交系植株约14节位开花当日的雌花挂牌并进行标记，在果实花后12d，对生长无病虫害果形端正的果实取样，每个株系取果实5个，放进冰盒快速运回实验室，放入-80℃冰箱保存。将果实在液氮下研磨为粉末，混匀分3份保存。
34.利用isq&trace isq gc-ms联用仪将其中一份进行果实香气含量的测定。在10ml萃取瓶中加入5g左右研磨均匀的黄瓜果实样品、1.5g nacl及10μl辛醛溶液(100μl/ml，内标)，放入转子后，立即用锡箔纸密封好，置于磁力搅拌器上55℃搅拌15min之后，使用75μm carboxen/pdms手动萃取头55℃萃取30min，萃取结束后使用gc-ms进行香气含量测定。初始柱温为40℃，持续2.5min，然后以6℃/min的速度增加到230℃。进气道温度为220℃，载气为1cm
·
s-1的氮气。
35.1.4c9化合物含量的定量分析
36.测定后，通过与离子谱库对比，并采用基线积峰的峰面积归一法结合内标法对香气进行定性定量分析，计算公式如下：
37.香气各成分的含量(μg/g)＝[各成分的峰面积/(内标的峰面积
×
样品质量(g))]
×
内标质量浓度(μg/μl)
×
内标体积(μl)
[0038]
1.5qtl定位分析：使用软件包r/qtl(http://www.rqtl.org/)中的复合区间作图法(composite interval mapping，cim)对采集到的香气数据进行qtl定位分析。
[0039]
1.6亲本重测序及变异性分析：对两个亲本进行深度测序(20
×
)，根据测序结果，分析qtl区间内候选基因的变异情况，两个亲本候选基因有明显的序列变异时，该基因被初步确定为调控c9化合物合成的候选基因。提取亲本和ril群体的基因组dna，对候选基因进行基因组dna的pcr扩增并测序。
[0040]
1.7indel分子标记的开发：根据候选基因的基因组序列内含子插入或者突变进行引物设计。本发明专利中针对候选基因的8bp的插入突变，开发了一个indel分子标记，标记
的上下游引物为：
[0041]
indel-f:5'-tct ttt ctt gtt tct cgt tcg tgt-3'
[0042]
indel-r:5'-tta gtg tcc aat gtg ctt tta ggt g-3'。
[0043]
1.8indel分子标记的pcr扩增和在群体中的验证：以提取的dna为模板，利用设计的indel引物进行pcr扩增，pcr反应总体系为10μl，包括模板dna 1μl、10ng/μl引物(上游+下游)1μl、dd h2o 3μl、2
×
taq pcr master mix 5μl；pcr反应程序：94℃变性3min；94℃变性30sec、50℃退火30sec、72℃延伸30sec，28个循环；72℃延伸5min；16℃保存。使用了9％的聚丙烯酰胺凝胶对indel标记进行鉴定，验证indel分子标记分型与c9化合物含量的相关性。
[0044]
2、实验结果与分析
[0045]
利用测量的2019年秋季和2020年春季黄瓜果实中(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇香气数据进行qtl定位分析，在第2染色体上检测到lod值较高的qtl位点(参见图1、图2)。基于亲本基因组序列重测序信息对qtl区间内和c9化合物合成相关的基因序列变异进行分析，发现脂氧合酶代谢路径上的cslox基因(csav3_2g005360)在两个亲本的基因组序列存在明显变异(参见图3)，因此把csav3_2g005360基因作为候选基因。csav3_2g005360基因在亲本q24的dna序列第五内含子存在8bp的插入变异(参见图4)，根据这个插入变异位点，设计了相应的indel分子标记。
[0046]
利用设计的indel分子标记，对ril群体中15个(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇香气含量高和15个香气含量低的个体进行基因分型。其中，15个高香气个体的基因型与q16的基因型完全一致，15个低香气个体的基因型有8个与q24的基因型一致，4个为杂合基因型(参见图5)。为了进一步验证indel标记的分型与香气含量的关系，挑选9个黄瓜自交品种作为自然群体进行基因分型以及香气含量测定。这9个黄瓜品种有5个与q16的基因型一致，有4个与q24的基因型一致。表明csav3_2g005360内含子中的indel变异在自然群体中是广泛存在的(参见图6)。
[0047]
以上结果表明本发明indel分子标记可以区分黄瓜果实中(e,z)-2,6-壬二烯-1-醇香气含量的高低。
[0048]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围。上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的基本原理和主要特征，本领域技术人员阅读本技术后依然可对申请的具体实施方式进行各种变化和修改，但这些变化和修改都包括在本发明的专利保护范围内。