一种调控水稻镉积累的基因PK1及其蛋白和应用

一种调控水稻镉积累的基因pk1及其蛋白和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术和环境领域，具有涉及一种调控水稻镉积累基因pk1及其蛋白和应用。


背景技术：

2.镉是生物毒性最强的重金属之一，其经植物根系吸收后不仅可对植物造成很强的毒害进而严重威胁生态环境，而且可以通过食物链富集后危害人类的健康。镉在我国的地质背景值很低，但是随着工业活动的加剧，氮肥的过度使用以及土壤酸化导致镉污染和迁移性提高。由于我国人均耕地面积相对较少，迫使镉污染土壤仍用来种植粮食作物，导致镉大米事件多发，严重危害人类健康。目前镉污染主要采用物理修复，化学修复的方法。遗憾的是，这些方法均不能有效的去除镉污染。
3.目前无论国际还是国内，有关植物吸收调控重金属的研究尤其是分子机理方面的研究仍相对有限，取得的结果相对不够系统，主要集中在一些转运蛋白和基因突变的研究。这些基因的突变势必会影响植物对其它必须元素的利用，从而抑制植物的生长并降低其产量。因此找到植物必须矿物质营养转运和重金属解偶联的基因，是应对重金属污染的一种较好的策略。但目前的理论基础远不能满足生产实践需求。因此，本领域还需深入研究植物中镉积累机制，为培育具有降低土壤镉的种质提供基因资源。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种调控水稻镉积累基因pk1及其蛋白和应用。
5.为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
6.一种调控水稻镉积累的基因pk1，其核苷酸序列如seq id no：1所示。
7.一种调控水稻镉积累的基因pk1编码得到的蛋白，其氨基酸序列如seq id no：2所示。
8.基于一个总的发明构思，本发明还提供一种上述的调控水稻镉积累的基因pk1或蛋白在培育镉污染修复农作物中的应用。
9.上述的应用，优选的，所述镉污染修复农作物的作物种类包括水稻、烟草、玉米和小麦中的任意一种或几种。
10.优选的，其应用的方法包括如下步骤：将所述基因pk1克隆至目标载体中，然后通过热击法转入农杆菌中，通过组织培养的方法转化至农作物中进行过表达，得到纯合突变体，即为镉污染修复农作物。
11.更优选的，将所述基因pk1克隆至目标载体中时采用的靶点sgr-pk1包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seq id no：3所示，所述反向引物的核苷酸序列如seq id no：4所示。
12.基于一个总的发明构思，本发明还提供一种调控水稻镉积累的基因pk1或如上述
的蛋白在修复土壤镉污染中的应用，其应用的方法包括如下步骤：将所述基因pk1克隆至目标载体中，然后通过热击法转入农杆菌中，通过组织培养的方法转化至农作物中进行过表达，得到纯合突变体农作物，将其种植于镉污染土壤的大田，连续种植多年后即能实现土壤镉污染的修复。
13.基于一个总的发明构思，本发明还提供一种调控水稻镉积累的基因pk1或如上述的蛋白在水稻产量调控、氮素利用或根系构型遗传改良中的应用，其应用的方法包括如下步骤：将所述基因pk1克隆至目标载体中，然后通过热击法转入农杆菌中，通过组织培养的方法转化至水稻中进行过表达，得到水稻纯合突变体。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
15.1、本发明采用的水稻pk1基因及其编码蛋白，可以利用稻草特异进行土壤镉的富集去除，而对土壤中其它营养元素的含量没有显著影响，克服了现有技术镉吸收转运与其它必须元素紧密偶联的特点，达到修复土壤镉而不损失土壤肥效的目标。
16.2、本发明的应用方法，通过基因编辑技术，创制了水稻中一个类受体蛋白激酶pk1的突变体，发现pk1主要在叶片表达，在叶鞘受到镉诱导表达，亚细胞定位于细胞膜；其突变体原生质体镉含量显著增加，并发现其突变体地上部和木质部伤流液镉含量显著增加，收获时期突变体稻草和籽粒中的镉含量显著增加，而对其它必须营养元素的积累没有显著影响，这为通过生物技术的手段培育镉修复潜力的农作物提供了优异的基因资源。
17.3、本发明的应用方法，通过基因编辑的手段，获得了一批可能特异对水稻重金属镉积累存在显著差异的突变体，找到植物调控重金属和必须矿物质营养元素吸收转运解偶联的基因，利用植物修复技术来对重金属污染土壤进行修复是一种较好的策略，这样达到特异修复重金属而不损失土壤肥效。
附图说明
18.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1是水稻pk1基因编辑突变体实验结果。
20.图2是pk1基因在镉处理前(a)和镉处理后(b)的表达模式结果。
21.图3是pk1基因的亚细胞定位结果。
22.图4是水稻苗期pk1突变体地上部(a)和木质部伤流液(b)镉含量结果。
23.图5是水稻苗期pk1突变体原生质体镉含量结果。
24.图6是水稻成熟时期pk1突变体稻草(a)和籽粒(b)镉积累量结果。
25.图7是水稻4周水培苗时期pk1突变体和野生型的实物图(a)、株高(b)和主根长(c)结果。
26.图8是水稻4周水培苗时期pk1突变体和野生型的全氮素含量(a)和氮素生理效率(b)结果。
27.图9是水稻成熟时期pk1突变体和野生型的单株产量结果。
具体实施方式
28.为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
29.除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
30.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
31.实施例1：
32.一种调控水稻镉积累基因pk1，被发现于水稻中，基因号为os12g0632900，其cds核苷酸序列如seq id no：1所示，由该基因pk1编码得到的蛋白(一个水稻类受体蛋白激酶)的氨基酸序列如seq id no：2所示。
33.1、pk1的突变体pk1的构建
34.为了研究pk1在水稻中的作用，我们利用基因编辑技术得到了3个纯合的突变体10250-12，10250-15，10250-17(图1)。基因编辑的靶点sgr-pk1的正向引物为ggtggtggcggaggcggcat(其核苷酸序列如seq id no：3所示)，反向引物序列为atgccgcctccgccaccacc(其核苷酸序列如seq id no：4所示)，这对引物体外互补形成双链克隆至中间载体上，然后通过酶切的方法克隆至目标载体p1300(获自university of california，san diego，us)中，得到含有pk1基因靶序列的目标载体。目标载体通过热击转入农杆菌中，通过组织培养的方法转化至水稻zh11进行过表达，组织培养由武汉伯远生物有限公司完成。拿到转基因株系后，提取叶片dna，利用测序引物m-f(其核苷酸序列如seq id no：5所示)和m-r(其核苷酸序列如seq id no：6所示)通过pcr的方法扩增靶序列附近的dna片段，最终通过测序的方法获得纯合突变体。
35.2、pk1基因的表达模式
36.基因的表达部位决定了其功能的发挥，为了研究pk1基因的时空特异性，我们选取了3周水培苗期(根、叶鞘、叶片)和大田开花时期(叶片、旗叶、叶鞘、旗叶鞘、节、节间、小穗)不同组织，采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司试剂盒提取rna，并反转录成cdna，通过pk1特异引物rt-pk1-f(其核苷酸序列如seq id no：7所示)和rt-pk1-r(其核苷酸序列如seq id no：8所示)，内参基因actin特异引物rt-actin-f(其核苷酸序列如seq id no：9所示)和rt-actin-r(其核苷酸序列如seq id no：10所示)，qrt-pcr检测发现pk1主要在水稻的叶片组织表达(图2a)。水稻水培3周后，用0,10μm cd处理3天，检测pk1在根、叶鞘和叶片中受cd诱导表达变化，发现pk1基因在叶鞘组织受到cd的强烈诱导表达(图2b)。说明该基因参与了cd逆境响应。
37.3、pk1基因的亚细胞定位于细胞膜
38.为了克隆pk1的全长cds序列，我们设计合成了2对引物：pk1-1f(其核苷酸序列如seq id no：11所示)、pk1-1r(其核苷酸序列如seq id no：12所示)、pk1-2f(其核苷酸序列如seq id no：13所示)、pk1-2r(其核苷酸序列如seq id no：14所示)，以zh11的cdna为模板，采用高保真聚合酶，pcr扩增目标片段，电泳回收目标片段切，与载体pbwa(v)hs-glosgfp进行连接。将10ul连接产物转化大肠杆菌感受态，转化涂(卡纳霉素)抗性平皿，37
℃培养12小时，进行菌斑pcr鉴定。目标条带为3031bp左右的片段。取1-3个阳性条带对应的菌液，取100ul送样测序，其余400ul菌液接种到含有5-10ml(卡纳霉素)抗性lb中，试管摇菌，待测序结果出来后，对应测序正确的取一管提取质粒(质粒命名为：pbwa(v)hs-pk1-glosgfp)。得到pbwa(v)hs-pk1-glosgfp载体热击转入农杆菌中，注射烟草叶片表皮细胞瞬时表达pk1蛋白，避光24小时，72小时后通过激光共聚焦显微镜观察烟草叶片表皮细胞绿色荧光，得到pk1的亚细胞定位结果为细胞膜(图3)。
39.4、水稻苗期pk1突变体地上部和木质部伤流液镉含量显著增加
40.水稻水培3周后，用10μm cd处理7天，检测发现类受体蛋白激酶rlk1突变体地上部和木质部伤流液重金属cd积累量显著增加(图4)。
41.1)植物的地上部分材料用milli-q水冲洗后直接收取；
42.2)80℃烘箱中，24-48h；
43.3)烘干的植物材料，称取10-20mg，置入14mlfalcon tm管中；
44.4)加入1ml硝酸(mos级)，轻轻晃动，使所有材料被浸泡，过夜；
45.5)99℃，煮30分钟，根据材料的实际情况，可反复煮2-3次；
46.6)冷却至室温，补充milli-q水至14ml，混匀，密封，待测；
47.7)电感耦合等离子质谱(icp-ms，elan drc-e，perkin-elmer)测定样品金属元素含量。
48.木质部伤流液收集方法：用锋利的刀片在根茎交界处以上1cm左右将植株切断。为了减少破损细胞质的污染，从第二滴开始收集伤流液，每5株植物收集在一起作为一个重复，收集30-40min左右。在整个收集过程中，培养箱中的湿度保持在100％。将木质部上流液用5％hno3(mos级)稀释到2ml，并用icp测量其中cd含量。
49.结果如图4所示，相比于野生型，水稻pk1突变体10250地上部和木质部伤流液镉积累量显著增加。数值为三次重复实验的平均值
±
标准差，p值为显著性差异统计检验student’st-test分析*p《0.05，**p《0.01。
50.5、水稻pk1突变体原生质体镉含量显著增加
51.为了探究地上部cd积累的具体部位，水稻水培3周后，用10μm cd处理7天，取材分离原生质体，发现pk1突变体的原生质体中cd含量显著增加(图5)。原生质体提取的方法参照文献(zhang,y.,su,j.,duan,s.,ao,y.,dai,j.,liu,j.,wang,p.,li,y.,liu,b.,feng,d.,wang,j.,&wang,h.(2011).ahighly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-relatedprocesses.plant methods,7(1),30)进行，镉含量定量到原生质体总蛋白量上。数值为三次重复实验的平均值
±
标准差，p值为显著性差异统计检验student’s t-test分析*p《0.05，**p《0.01。
52.6、水稻成熟时期pk1突变体稻草和籽粒镉积累量增加
53.水稻生长至cd污染大田至种子成熟，我们检测了水稻成熟时期zh11和pk1突变体籽粒和秸秆中的cd含量，发现pk1突变体中稻草和籽粒中cd含量显著高于对照(图6)。这可能为培育地上部具有cd修复潜力的水稻种质提供了基因资源。cd的检测定方法同上述第4点。数值为三次重复实验的平均值
±
标准差，p值为显著性差异统计检验student’s t-test分析*p《0.05，**p《0.01。
54.实施例2：
55.一种利用调控水稻镉积累的基因pk1或其编码蛋白在修复土壤镉污染中的应用，即一种修复土壤镉污染的方法，包括如下步骤：
56.采用实施例1的方法培育镉污染修复水稻(即实施例1的水稻pk1纯合突变体)，种植于土壤镉含量为0.5μg/g干重的污染稻田，成熟后利用适合南方丘陵地区镉污染稻田秸秆、根茬高量离田及收割一体化农机具进行收割，经过连续2年的种植，土壤镉含量下降了30％，稻田土壤镉含量变为0.35μg/g干重，说明pk1突变体材料具有很好的修复效果。
57.实施例3：
58.一种利用调控水稻镉积累的基因pk1或其编码蛋白在水稻产量调控、氮素利用或根系构型遗传改良中的应用，包括如下步骤：
59.采用实施例1的方法培育水稻pk1纯合突变体。经过研究发现，在水稻不同生长时期，pk1对水稻生长发育，单株产量和氮素利用效率也有显著影响。比如4周水培苗时期，相比于野生型zh11，pk1突变体的根系构型发生显著改变，株高和主根长显著降低(图7)；全氮含量增加，但氮素生理利用效率降低(图8)。成熟时期单株产量显著低于野生型zh11(图9)。这些结果表明pk1为水稻产量调控，氮素利用，和根系构型遗传改良提供了优异基因资源。具有重大的应用前景。数值为三次重复实验的平均值
±
标准差，p值为显著性差异统计检验student’s t-test分析*p《0.05。
60.综上所述，本发明公开了一种调控水稻镉积累的基因pk1，其核苷酸序列如seq id no：1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no：2所示的第1至977位。并公开了由这个基因得到的突变体在水稻苗期地上部、原生质体和木质部伤流液、成熟时期稻草和籽粒中的镉含量均高于对照，说明本发明的基因pk1或其编码蛋白可用于培育具有修复镉污染潜力的农作物，为通过生物技术的手段培育具有修复镉污染潜力的农作物提供了优异的基因资源。进一步的，将这些具有修复镉污染潜力的农作物种植后可用于修复土壤镉污染，修复效果良好。