一种超小聚多巴胺纳米粒子及其制备方法和应用

1.本发明涉及纳米材料技术领域，具体涉及一种超小聚多巴胺纳米粒子及其制备方法和应用。


背景技术：

2.衰老是指细胞在不发生细胞死亡和细胞分裂停止的情况下，细胞生长受到不可逆的抑制。老年痴呆症、糖尿病、动脉粥样硬化、甚至癌症等各种慢性疾病都与衰老或生物老化有关，会引起系统性的变化，给社会带来沉重的医学和经济负担。除了自然衰老外，衰老还发生在对损伤刺激的反应中，如dna损伤、致癌应激、端粒缩短和功能障碍。新的证据表明氧化应激与衰老有关。衰老的自由基理论认为，衰老相关的功能损失是由活性氧和氮物种(rons)引起的细胞氧化损伤积累造成的，即活性氧和氮的活性自由基和非自由基衍生物，如超氧阴离子自由基(
·o2-)、过氧化氢(h2o2)、羟基自由基(
·
oh)、一氧化氮自由基(
·
no)、过氧化亚硝酸盐(oono-)在细胞代谢或环境刺激过程中不断产生。氧化应激是一种以与rons相关的氧化剂与抗氧化剂不平衡为特征的现象，作为衰老的根本原因之一，受到了人们的广泛关注。无论是内源性还是外源性的，rons均可诱导蛋白质、脂类、碳水化合物和核酸等大部分生物大分子的氧化修饰，进而改变其稳定性和功能。因此，迫切需要制定一种有效的策略来消除rons，最终延缓老化过程。
3.在生物体的生命过程中，已经进化出一系列包含过氧化氢酶(cat)和超氧化物歧化酶(sod)的高效酶，它们能够清除rons，保护组织或器官免受rons介导的损伤。然而，天然酶是一类生物分子(如蛋白质和rna)，通常对非生理或不利的环境(如温度和ph值)敏感，使其难以定量生产。为了应对这些挑战，科学家们已经开发了一些人工酶，称为纳米酶，模仿天然酶的活动，这引起了广泛的兴趣，因为容易生成，成本低，多功能和高稳定性。其中，常见的无机纳米酶如ceo2、pt、v2o5、2d碳化物和氮化物(mxenes)等具有清除rons能力的纳米酶已被广泛研究，并有可能应用于各种疾病，包括肝脏缺血-再灌注损伤、神经退行性疾病(如阿尔茨海默氏病、帕金森病。急性肾损伤等。然而，根据数据，在生物系统(细胞、组织、器官等)中具有不可忽视的毒性问题，限制了无机纳米酶进一步临床转化。与无机纳米酶相比，有机聚合物基纳米酶具有良好的生物相容性和化学柔韧性。然而，据我们所知，有机聚合物基纳米酶在抗衰老方面的应用还很少报道。因此，迫切需要开发一种低毒性的有机聚合物纳米酶用来抵抗衰老。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提出一种超小聚多巴胺纳米粒子及其制备方法和应用，聚多巴胺(聚多巴胺)作为黑色素的主要成分，广泛分布于体内，在生物安全性方面具有显著优势，具有极好的延缓衰老的功效。
5.本发明的技术方案是这样实现的：
6.本发明提供一种超小聚多巴胺纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
7.s1.将盐酸多巴胺溶于水中，加入催化剂，加热搅拌反应，高速离心，洗涤，干燥，得到聚多巴胺黑色固体；
8.s2.将步骤s1制得的聚多巴胺黑色固体溶解于碱溶液中，滴入酸溶液，超声下调节溶液ph值为中性或弱碱性，持续一段时间，得到亮黑色的聚多巴胺水溶液，高速离心，洗涤，干燥，得到超小聚多巴胺纳米粒子。
9.作为本发明的进一步改进，所述水为去离子水，所述催化剂为0.5-1.5mol/l的naoh溶液；所述干燥为冷冻干燥；所述碱溶液为0.05-0.15mol/l的naoh溶液；所述酸溶液为0.05-0.15mol/l的hcl溶液；所述超声输出功率为200-600w，时间为2-60min。
10.进一步地，包括如下步骤：
11.s1.盐酸多巴胺溶于去离子水中。将0.5-1.5mol/l的naoh溶液加入到上述盐酸多巴胺溶液中，加热，剧烈搅拌。反应数小时，加入naoh后溶液颜色变为淡黄色，逐渐变为深棕色。高速离心数十分钟后，用去离子水洗涤3次。将水溶剂经冷冻干燥去除，得到聚多巴胺的黑色固体。
12.s2.在剧烈搅拌下，聚多巴胺纳米颗粒溶解于0.05-0.15mol/l的naoh水溶液中。然后将0.05-0.15mol/l的hcl水溶液快速滴入得到的溶液中，在一定输出功率为的超声作用下调节ph至中性或弱碱性，持续一定时间，得到亮黑色的聚多巴胺水溶液。用离心过滤器(离心过滤装置，mwco＝3kda)高速离心数十分钟后回收超小的聚多巴胺纳米颗粒，用去离子水洗涤数次以去除产生的nacl。采用冷冻干燥法制备超小聚多巴胺纳米粒子。
13.作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述盐酸多巴胺与水的质量比为1-100∶1；所述盐酸多巴胺与naoh的质量比为1-100∶1。
14.作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述加热条件应为50-90℃，反应5-72h。
15.作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述高速离心为13000-16000rpm离心20-40min。
16.作为本发明的进一步改进，步骤s2中所述聚多巴胺黑色固体与naoh的质量比为1∶1-100。
17.作为本发明的进一步改进，步骤s2中所述ph值调节至碱性。
18.作为本发明的进一步改进，步骤s2中所述高速离心为采用离心过滤装置进行处理，mwco＝3kda，所述离心条件为7000-13000rpm离心8-15min。
19.本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的超小聚多巴胺纳米粒子，所述超小聚多巴胺纳米粒子的粒径小于10nm。
20.本发明进一步保护一种上述的超小聚多巴胺纳米粒子在延缓衰老产品中的应用。
21.聚多巴胺(pda)作为黑色素的主要成分，广泛分布于体内，具有良好的生物相容性，在生物安全性方面具有显著优势。由于超小聚多巴胺具有强清除活性氧的能力，从而可作为抗氧化应激类产品用于延缓衰老。
22.迄今为止，本领域尚未开发基于有机聚合物纳米酶用于延缓衰老，而本发明填补类这一空白。
23.以往的报道主要集中在将聚多巴胺作为智能载体应用于生物医学领域，其功能简单，表面修饰可行，能对光、ph值、超声磁场等多种外界刺激做出反应。然而，其清除rons的酶样活性却鲜有报道。
24.本发明具有如下有益效果：
25.本发明通过液相剥离技术，设计并开发了一种有机超小聚多巴胺纳米粒子(，该纳米粒子结合了cat/sod模拟级联活性，具有广谱活性氧清除能力，可催化
·o2-生成h2o2和o2。将h2o2分解为h2o和o2，去除
·
oh。
26.此外，超小聚多巴胺纳米粒子(upda nps)还可以作为活性氮物种(rns)的清除剂，如
·
no和oono-。
27.此外，本发明还验证了upda npss在体内和体外都能消除rons。upda nps能有效保护果蝇和小鼠免受氧化应激介导的衰老。这些结果不仅发现upda nps作为抗衰老纳米药物具有良好的对rons的清除能力和潜在的临床应用前景，也为减缓和治疗衰老提供了一种替代策略。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
29.图1为本发明实施例1制备的超小聚多巴胺纳米粒子的透射电镜(tem)图片；
30.图2为本发明实施例1制备的超小聚多巴胺纳米粒子的原子力显微镜(afm)图片；
31.图3为采用atbs法测定本发明实施例1制备的超小聚多巴胺纳米粒子的抗氧化能力的吸收光谱图；
32.图4为本发明对比例1制备的超小聚多巴胺纳米粒子的图片；
33.图5为本发明对比例2制备的超小聚多巴胺纳米粒子的透射电镜图；
34.图6为本发明对比例3制备的超小聚多巴胺纳米粒子的投射电镜图；
35.图7为本发明测试例1中超小聚多巴胺纳米粒子在小鼠肾脏部位延缓衰老的免疫荧光图；
36.图8为本发明测试例2中超小聚多巴胺纳米粒子处理或不处理dox诱导小鼠肾脏中代表性degs(ager、apod、bdnf、ccn2、lep、tert、ucp1和ucp3)的箱线图。
具体实施方式
37.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
38.实施例1
39.本实施例提供了一种超小聚多巴胺纳米粒子的制备方法，具体步骤如下：
40.180mg盐酸多巴胺溶于90ml去离子水中。将840μl的1mol/l的naoh溶液加入到上述盐酸多巴胺溶液中，60℃，剧烈搅拌。反应12h，加入naoh后溶液颜色变为淡黄色，逐渐变为深棕色。16000rpm离心40min后，用去离子水洗涤3次。将水溶剂经冷冻干燥去除，得到聚多巴胺的黑色固体。在剧烈搅拌下，20mg聚多巴胺纳米颗粒溶解于10ml 0.1mol/l的naoh水溶
液中。然后将0.1mol/l的hcl水溶液快速滴入得到的溶液中，在输出功率为600w的超声作用下调节ph至7.0，持续2min，得到亮黑色的聚多巴胺水溶液。用离心过滤器(离心过滤装置，mwco＝3kda)在8000rpm下离心8min回收超小的聚多巴胺纳米颗粒，用去离子水洗涤数次以去除产生的nacl。采用冷冻干燥法制备超小聚多巴胺纳米粒子。
41.图1为本实施例超小聚多巴胺纳米粒子的扫描电镜(tem)照片。从图1可以看出，超小聚多巴胺纳米粒子的成功制备。
42.图2为本实施例超小聚多巴胺纳米粒子的原子力显微镜(afm)图片。从图2可以看出，超小聚多巴胺纳米粒子分布均匀。
43.图3为本实施例碳化钒纳米片总抗氧化能力的考察(采用的检测方法为abts法)。从图3可以看出，超小聚多巴胺纳米粒子具有优良的抗氧化能力，可高效清除活性氧。
44.实施例2
45.本实施例提供了一种超小聚多巴胺纳米粒子的制备方法，具体步骤如下：
46.50mg盐酸多巴胺溶于30ml去离子水中。将280μl的1mol/l的naoh溶液加入到上述盐酸多巴胺溶液中，65℃，剧烈搅拌。反应5h，加入naoh后溶液颜色变为淡黄色，逐渐变为深棕色。15000rpm离心20min后，用去离子水洗涤3次。将水溶剂经冷冻干燥去除，得到聚多巴胺的黑色固体。在剧烈搅拌下，5mg聚多巴胺纳米颗粒溶解于2.5ml 0.1mol/l的naoh水溶液中。然后将0.1mol/l的hcl水溶液快速滴入得到的溶液中，在输出功率为400w的超声作用下调节ph至7.0，持续30min，得到亮黑色的聚多巴胺水溶液。用离心过滤器(离心过滤装置，mwco＝3kda)在9000rpm下离心5min回收超小的聚多巴胺纳米颗粒，用去离子水洗涤数次以去除产生的nacl。采用冷冻干燥法制备超小聚多巴胺纳米粒子。
47.本实施例制备的超小聚多巴胺纳米粒子的tem照片和afm图片与实施例1基本相同。
48.实施例3
49.本实施例提供了一种超小聚多巴胺纳米粒子的制备方法，具体步骤如下：
50.500mg盐酸多巴胺溶于300ml去离子水中。将2800μl的1mol/l的naoh溶液加入到上述盐酸多巴胺溶液中，65℃，剧烈搅拌。反应24h，加入naoh后溶液颜色变为淡黄色，逐渐变为深棕色。16000rpm离心45min后，用去离子水洗涤3次。将水溶剂经冷冻干燥去除，得到聚多巴胺的黑色固体。在剧烈搅拌下，100mg聚多巴胺纳米颗粒溶解于50ml 0.1mol/l的naoh水溶液中。然后将0.1mol/l的hcl水溶液快速滴入得到的溶液中，在输出功率为500w的超声作用下调节ph至7.0，持续45min，得到亮黑色的聚多巴胺水溶液。用离心过滤器(离心过滤装置，mwco＝3kda)在10000rpm下离心15min回收超小的聚多巴胺纳米颗粒，用去离子水洗涤数次以去除产生的nacl。采用冷冻干燥法制备超小聚多巴胺纳米粒子。
51.本实施例制备的超小聚多巴胺纳米粒子的tem照片和afm图片与实施例1基本相同。
52.对比例1
53.与实施例1相比，调节溶液ph值为6，其他条件均不改变。所制备的超小聚多巴胺纳米粒子在水溶液中分散性较差，且为肉眼可见的沉淀(图4)
54.对比例2
55.与实施例1相比，调节溶液ph值为3，其他条件均不改变。所制备的超小聚多巴胺纳
米粒子尺寸较大超过100nm(图5)，并不满足肾脏代谢条件和生物安全性需求。
56.对比例3
57.与实施例1相比，超声输出功率为100w，其他条件均不改变，所得超小聚多巴胺纳米粒子尺寸较大超过100nm(图6)，并不满足肾脏代谢条件和生物安全性需求。
58.测试例1
59.清除自由基，发挥抗氧化作用延缓衰老的试验：
60.阿霉素(10mg/kg，一周两次)腹腔注射c57bl/6小鼠(购自上海雷根生物科技有限公司)构建衰老小鼠模型。造模成功后，设置模型组和试验组，试验组尾静脉注射实施例1制备的超小聚多巴胺纳米粒子，剂量：浓度为200μg/ml的超小聚多巴胺纳米粒子溶液200μl。模型组注射等量的生理盐水。设置空白对照组，空白对照组没有注射阿霉素，并注射等药物量的生理盐水。实施例1组没有注射阿霉素，并与试验组注射相同的实施例1制备的超小聚多巴胺纳米粒子。24小时后取材，进行if染色，观测各组肾脏衰老相关sasp表达。
61.图7结果显示，注射超小聚多巴胺纳米粒子的治疗组较对照组衰老相关sasp显著向延缓衰老方向调节，表明超小聚多巴胺纳米粒子能够发挥延缓衰老作用，为抗衰提供了新的思路和方向。
62.测试例2
63.之前发现upda nps介导的抗衰老效应与蛋白质相互作用和信号转导相关，进一步的转录组数据度确认upda nps能够调节多个信号通路。其中一个途径是nf-κb信号通路，是sasps的基本刺激因子。在下调的deg中，arger也被称为晚期糖基化终末产物受体(rage)，可以激活nf-κb信号通路，进而导致炎症。另一个下调的基因ccn2通过与nf-κb受体激活因子(rank)结合来增强nf-κb信号通路。
64.upda nps能增强抗衰老基因的表达。apod是一种主要在神经系统中表达的脂质钙素，被认为可以抑制脂质过氧化并对抗大脑中的氧化应激。随着年龄的增长，褐色脂肪组织的生物标记物ucp1的表达和活性都降低了。虽然ucp1缺失会导致线粒体超氧化物的过量产生和血管炎症，但猪体内ucp1敲入蛋白可阻止nlrp3炎症小体的激活并保护动物免受冠状动脉粥样硬化。另一个upda nps上调的解偶联蛋白ucp3是线粒体ros生成的负调控因子，对骨骼肌和心脏的氧化应激有保护作用。端粒酶的催化亚基，是公认的细胞衰老抑制剂。急性给药瘦素(维持能量稳态的关键因素)可以通过抑制超氧化物生成和促进阿尔茨海默病小鼠模型大脑中的细胞增殖来降低氧化应激水平。bdnf是一种对神经元存活和突触传递至关重要的神经营养因子，已被证明可以在神经元培养中维持氧化还原平衡，并通过抑制nf-κb活性逆转衰老小鼠的小胶质细胞激活。值得注意的是，这些抗衰老基因与上述促炎因子一起参与脂质代谢、线粒体功能、能量平衡、端粒稳定性、神经保护和免疫应答等多种细胞生理活动(图8)。因此，upda nps的抗衰老作用可能是多种机制共同作用的结果，值得进一步研究。
65.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。