一株米曲霉菌株及其在饲用蛋白开发方面的应用

1.本发明属于发酵粕类饲料及生产低值原料来源的单细胞蛋白应用技术领域，涉及一株米曲霉菌株及其应用。


背景技术：

2.我国蛋白质饲料原料供应不足与传统饲料原料利用率不高、浪费大的矛盾并存。一方面，我国蛋白质饲料自给率不足50%，国外进口的依存度超过80%，“人畜争粮”“受制于人”等情况日益严峻，畜禽养殖业作为我国农业的支柱产业，其转型升级的需求非常迫切；利用生物合成技术将农业废弃物转化为非常规蛋白原料，颠覆传统农业蛋白生产模式。低值原料来源的饲料蛋白在蛋白利用率、营养功能、综合成本等多方面可以与豆粕类饲料蛋白竞争，实现传统农业蛋白替代。
3.另一方面，现有的蛋白饲料资源利用率不高，主要原因是当前产业中蛋白的处理技术低下，造成大量蛋白浪费。粕类是榨油后的副产物，是最重要的饲料蛋白资源。常见的有豆粕，棉粕，花生粕等，含有丰富的蛋白质，氨基酸分布合理，是动物日粮中常用的植物性蛋白质原料。但粕类饲用蛋白资源中粗纤维含量较高，存在木聚糖、纤维素、β-葡聚糖等抗营养因子，干扰日粮营养的消化吸收，降低饲料营养价值，导致饲料蛋白原料利用率下降、动物患病率高等问题。并且粕类饲料蛋白的氨基酸组成不如动物源性蛋白质饲料理想。利用高效利用低值原料的饲用菌株混合发酵粕类是改善粕类蛋白质饲料质量，挖掘植物性蛋白质饲料深层次利用潜能的有效途径。


技术实现要素：

4.本发明采用米曲霉是腐木微生物中分离得到的野生菌株，通过artp诱变方式，提升其降解生物质材料的能力，获得一株米曲霉菌株a02。以不溶性木质素/可溶性木质素为唯一碳源时，米曲霉a02均可以正常生长，说明这株米曲霉菌具有木质素强降解能力；米曲霉a02在液态摇瓶发酵5d，其纤维素酶酶活力可以达到12iu/ml，木聚糖酶活力可以达到210iu/ml。因此，利用本发明的米曲霉发酵粕类蛋白和低值生物质原料生产单细胞蛋白，从饲用蛋白资源
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开源”“节流”两个方面，提升现有蛋白饲料利用率，开发新型饲料蛋白，是缓解我国饲用资源不足的重要途径，因此本发明可产业化应用，具有较好的产业化前景。
5.因此，本发明首先提供米曲霉（aspergillus oryzae）菌株a02，其被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：cgmcc no. 40043，保藏时间为：2022年1月17日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
6.其次，提供所述菌株在木质素降解中的应用，其降解的底物是不溶性木质素或可溶性木质素，具体可以是棉粕、豆粕、花生粕。
7.更进一步地，本发明通过米曲霉a02和黑曲霉60b-3dw混合固态发酵72h后，棉粕、豆粕、花生粕的粗蛋白含量分别提升了11.42%、13.64%、11.69%。通过米曲霉a02和黑曲霉60b-3dw混合固态发酵，棉粕必需氨基酸比例由29.86%提升到36.42%；豆粕必需氨基酸比例
由36.46%提高到40.64%；花生粕必需氨基酸比例由26.73%提高到32.78%，大大提高了粕类饲料的品质和营养价值。以低值原料（甘蔗渣，玉米秸秆，玉米芯）为底物，本发明经过特定的米曲霉a02和黑曲霉60b-3dw混合发酵后，单细胞蛋白中粗蛋白含量均超过29%，氨基酸含量均超过24%。
8.其中，黑曲霉菌株60b-3dw，其分类命名：黑曲霉aspergillus niger，菌株黑曲霉aspergillus niger 60b-3dw被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：cgmcc no.22465（该菌株由中国科学院微生物研究所普通菌种保藏中心提供的黑曲霉3.316诱变得到），保藏时间为：2021年07月05日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
9.相应地，本发明提供一种用于单细胞蛋白生产的混合菌剂，其包括米曲霉a02和黑曲霉60b-3dw。优选地，所述菌株以孢子粉或孢子悬液的形式存在。更优选地，使用时孢子浓度10
6-108个/ml。
10.进而，本发明提供一种生产饲用蛋白的方法，其是以米曲霉a02和黑曲霉60b-3dw混合菌发酵木质素原材料得到单细胞蛋白。优选地，还包括分离饲用蛋白的步骤。具体地，所述木质素原材料是秸秆类原材料，具体是玉米秸秆、玉米芯、甘蔗渣及其混合物。优选地，所述木质素原材料是粕类，更具体的是豆粕，棉粕，花生粕或其混合物。
11.在一个具体实施方式中，是以豆粕、花生粕、棉粕分别按照93:7与麸皮混合做为发酵的底物，米曲霉a02和黑曲霉60b-3dw接种量为5-15%，米曲霉a02和黑曲霉60b-3dw接种比例为1-3：1，优选为2：1，含水量为50%-70%，培养温度为28-32℃，发酵60-90h。
附图说明
12.图1 artp诱变不同时间后米曲霉菌株在筛选平板生长情况。
13.图 2 米曲霉菌株a02在不同培养基上生长情况，其中，a：pda平板 b：可溶性木质素为唯一碳源平板 c：不溶性木质素为唯一碳源平板。
具体实施方式
14.下面通过具体实施例对本发明作进一步的阐述，以便更好的理解本发明，但并不构成对本发明的限制。
15.实施例1：米曲霉菌株a02的获得1、原始菌株的获得2021年05月在河北省唐山市采集腐木微生物中分离获得。
16.分离过程：刮取腐木微生物，放入盛有95 ml无菌水和10粒玻璃珠的三角瓶中，于30℃、180 rpm振荡30 min。取菌悬液1 ml进行10
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10 ‑
7 系列浓度梯度稀释，然后取10 ‑5、10
ꢀ‑6、10 ‑7三个稀释度涂布至以木质素为唯一碳源的培养基平板上，于28℃倒置培养5d。
17.纯化：菌落在以木质素为唯一碳源的培养基平板形成后，选取生长最快的一株菌，挑取单菌落边缘处的菌丝于pda培养基平板上，继续28℃恒温培养。最终获得一株米曲霉纯菌落，将获得菌落4℃保存。
18.对该菌株进行鉴定，其中its测序序列结果如下： gacgctcgtaagatcttccgtaggtg
aacctgcggaaggatcattaccgagtgtagggttcctagcgagcccaacctcccacccgtgtttactgtaccttagttgcttcggcgggcccgccattcatggccgccgggggctctcagccccgggcccgcgcccgccggagacaccacgaactctgtctgatctagtgaagtctgagttgattgtatcgcaatcagttaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataactagtgtgaattgcagaattccgtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgcccatcaagcacggcttgtgtgttgggtcgtcgtcccctctccgggggggacgggccccaaaggcagcggcggcaccgcgtccgatcctcgagcgtatggggctttgtcacccgctctgtaggcccggccggcgcttgccgaacgcaaatcaatctttttccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaaatcttcctgtg。
19.结果显示，该菌的its序列与米曲霉rp-1 菌株相似度达到100%，说明该菌株是米曲霉菌株。
20.2、突变菌株a02的获得对上述获得的米曲霉菌株进行artp诱变及分选：a. 诱变时间确定：采用100
µ
l新鲜的米曲霉孢子悬液，孢子浓度为105,
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诱变不同时间。当诱变设置0s，60 s，90 s，120 s，150 s的诱变时间，分别凃板统计每个诱变时间的致死率，以70%致死率为理想诱变时间(0s情况作为对照)；b. 诱变后菌落孔板法评价：诱变后菌落挑入24孔板内，30℃、130 rpm培养1d，测定其od600判断诱变后菌落生长速度。图1示出了 artp诱变不同时间后米曲霉菌株在筛选平板生长情况。挑选生长速度最快的菌株（编号a02）, 将获得菌落4℃保存。
21.实施例2：米曲霉菌株a02的生长或发酵特性以pda，以及不溶性木质素/可溶性木质素为唯一碳源时，米曲霉a02均可以正常生长（如图2所示），说明该菌株具有木质素强降解能力。
22.发酵培养基：微晶纤维素33g/l，玉米浆干粉17 g/l，kh2po
4 1.60~1.72 g/l，(nh4)2so
4 2.6~3.0 g/l和mgso
4 0.4~0.8 g/l。24℃~28℃，ph4.8~5.2，转速250~300 rpm，培养5d。
23.米曲霉a02在液态摇瓶发酵5d，其纤维素酶酶活力可以达到12.1 iu/ml，木聚糖酶活力可以达到210.5iu/ml；与初始米曲霉野生株相比，米曲霉a02纤维素酶和木聚糖酶活力分别提高17倍和14倍。菌株纤维素酶活力（iu/ml）木聚糖酶活力（iu/ml）米曲霉野生株0.6713.9米曲霉a0212.1210.5
24.实施例3：混合发酵粕类种子培养基：ypd培养基：1%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母粉分别从米曲霉菌株a02和黑曲霉60b-3dw的平板上洗下孢子悬液浓度107个/ml，加入种子培养基，培养温度为26℃~28℃，转速180~200 rpm，培养24h。
25.将豆粕、花生粕、棉粕分别按照93:7与麸皮混合做为发酵的底物，米曲霉a02和黑曲霉60b-3dw接种量为10%（米曲霉a02和黑曲霉60b-3dw接种比例为2：1），含水量为60%，培养温度为30℃，发酵72h。
26.发酵前后的粕类材料分别测定粗蛋白质含量、氨基酸含量。粗蛋白质gb/t 6432-1994《饲料中粗蛋白的测定方法》。氨基酸含量测定采用a200型amino nova氨基酸分析仪参
照中华人民共和国国家标准gb/t 18246-2000《饲料中氨基酸的测定》进行测定。
27.从下表结果显示：通过米曲霉a02和黑曲霉60b-3dw混合固态发酵72h后，棉粕、豆粕、花生粕的粗蛋白含量分别提升了11.42%、13.64%、11.69%。米曲霉a02和黑曲霉60b-3dw混合固态发酵粕类效果明显好于单一菌株发酵粕类，是因为米曲霉菌株a02可以分泌纤维素酶，黑曲霉60b-3dw可以分泌β-葡萄糖苷酶；纤维素酶和β-葡萄糖苷酶有明显协同作用，复配后大幅度提升生物质的降解效率；更多生物质材料降解产生糖，糖被菌体利用生成菌体蛋白，所以混合固态发酵后，粕类粗蛋白含量提升较多。
28.从下表结果显示，通过微生物混合发酵后，可以明显提升粕类饲料的品质。通过饲用菌株混合固态发酵，棉粕必需氨基酸比例由29.86%提升到36.42%; 豆粕必需氨基酸比例由36.46%提高到40.64%； 花生粕必需氨基酸比例由26.73%提高到32.78%，大大提高了粕类产品的营养价值。
29.实施例5： 低值原料开发新型饲用蛋白产品分别取低值原料（玉米秸秆、玉米芯、甘蔗渣），按照料水比1:2.5加入水，作为固态发酵的培养基。米曲霉a02和黑曲霉60b-3dw种子液均按照10%接种量(即1：1配比)添加至低值原料固态发酵的培养基表面，30℃下培养96小时。
30.测定其总氮含量、粗蛋白含量和氨基酸含量如下表所示。由此可知，混合发酵针对三处原材料而言，单细胞蛋白中粗蛋白含量均超过29%，氨基酸含量均超过24%，实现农业废弃物资源变废为宝。材料玉米秸秆甘蔗渣玉米芯总氮含量（%）4.714.924.81粗蛋白含量（%）29.4430.7530.06氨基酸含量（%）24.1124.5324.76
[0031] 本发明中从饲料蛋白资源“开源”、
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节流”两个角度，提升现有饲料蛋白资源的利用率，开发新型饲料蛋白资源，缓解我国饲用蛋白资源短缺的现状。粕类蛋白是我国最常用的饲用蛋白资源，经过特定的米曲霉a02和黑曲霉60b-3dw混合发酵后，粕类蛋白粗蛋白含量提升11%，必需氨基酸比例也均提升5%左右，大大提高了粕类产品的营养价值。低值原料包括甘蔗渣，玉米秸秆，玉米芯为底物，本发明经过特定的米曲霉a02和黑曲霉60b-3dw混合发酵后，单细胞蛋白中粗蛋白含量均超过29%，氨基酸含量均超过24%。因此，本发明可产业化应用，具有较好的产业化前景，能够实现农业废弃物资源变废为宝，颠覆传统农业蛋白生产模式，促进我国蛋白原料的自给自足，实现我国循环经济和农业可持续发展的重要途径。同时精准解决我国农业废弃物资源化利用率低、传统农业蛋白短缺两大难题，提升我国农业的综合生产力和竞争力，具有重要的战略意义。