一种用于检测人源性Nur77基因表达水平的引物组合物及其应用的制作方法

一种用于检测人源性nur77基因表达水平的引物组合物及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因检测技术领域，更具体的说是涉及一种用于检测人源性nur77基因表达水平的引物组合物及其应用。


背景技术：

2.nur77(又称为tr3，nr4a1，nak-1，ngfi-b)是一种孤儿核受体，由立早基因编码，能够对包括细胞应激在内的多种信号通路产生响应。nur77参与的生物学过程包括细胞增殖，分化，凋亡，自噬，迁移侵袭，代谢和炎症等方面。nur77能够被多种细胞生长因子以及凋亡诱导因子表达，同时nur77的蛋白修饰也显著影响nur77的功能。不仅如此，nur77还能够通过与其他蛋白的相互作用来调控生物功能的改变。总而言之，nur77通过复杂的调控网络发挥着多种多样的生物学功能。
3.nur77在肿瘤发展过程中发挥促增殖，促凋亡的双重作用。nur77在结肠癌，乳腺癌，前列腺癌等多种癌症中高表达，nur77作为新颖的抗癌药物靶点，对其潜在调控分子的研究具有重大的意义。
4.阿尔茨海默病(alzheimer’s disease，ad)是以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变。其典型组织病理学改变为脑内的淀粉样蛋白沉积和神经元纤维缠结。研究表明脑内nur77的表达是维持正常的认知功能所必须的，抑制nur77的转录活性会导致长时记忆的严重损伤，对模拟ad的转基因动物模型的研究表明，进行性淀粉样蛋白沉积会导致nur77表达水平明显不足。此外，研究表明ad病人外周血nur77基因表达水平明显下调。帕金森病(pd)细胞模型中，核孤儿受体nur77激动剂真菌聚酮(csn-b)对帕金森病神经细胞产生保护作用。一些对疾病的干预和治疗措施也可影响nur77的表达，因此通过对nur77表达水平的研究有助于明确疾病的发病机制和药物的药效机制。
5.对nur77表达水平的研究除采用免疫组化和western免疫印迹等方法从蛋白水平进行研究外，也可从mrna水平研究nur77的表达水平，包括半定量反转录pcr和荧光定量pcr方法等。以蛋白为检测目标的方法通常操作比较繁琐，耗时。半定量反转录pcr需要电泳检测，准确度不够高。细胞管家基因需选择维持细胞最低限度功能所不可少的基因，在所有细胞中均要表达的一类基因，且表达水平受环境因素影响较小。有研究表明比较常用的actin管家基因受内质网应激影响，表达量会减少，不适宜用于内质网应激的参考基因。
6.因此，提供一种用于检测人源性nur77基因表达水平的引物组合物及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了一种用于检测人源性nur77基因表达水平的引物组合物及其应用。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.一种用于检测人源性nur77基因表达水平的引物组合物，由引物组1和引物组2组成；所述引物组1用于nur77基因检测，所述引物组2用于rpl19内参基因检测；
10.所述引物组1的序列如下：
11.nur77-f：5
’‑
actggatacacccgtgacct-3’；seq id no.1；
12.nur77-r：5
’‑
tttctgcactgtgcgcttga-3’；seq id no.2；
13.所述引物组2的序列如下：
14.rpl19-f：5
’‑
ctcgatgccggaaaaacacc-3’；seq id no.3；
15.rpl19-r：5
’‑
ttctctggcattcgggcatt-3’；seq id no.4。
16.进一步，所述引物组1的上游和下游引物浓度均为0.1-0.5μm。
17.进一步，所述引物组2的上游和下游引物浓度均为0.1-0.5μm。
18.进一步，所述的引物组合物在检测人源性nur77基因表达水平的试剂中的应用。
19.进一步，所述的引物组合物在筛选rna干扰序列中的应用。采用2
‑△△
ct
相对定量方法计算不同rna干扰序列样品的nur77基因表达水平，筛选出表达水平最低的rna干扰序列。
20.进一步，一种用于检测人源性nur77基因表达水平的试剂盒，包括所述的引物组合物和荧光染料。
21.进一步，所述荧光染料为sybr green荧光染料。
22.进一步，一种非诊断治疗目的的用于检测人源性nur77基因表达水平的方法，包括如下步骤：
23.(1)提取样品rna；
24.(2)将步骤(1)提取出的rna反转录成cdna；
25.(3)以所述的引物组合物为引物，用荧光定量pcr法检测nur77基因以及rpl19内参基因表达水平；
26.(4)分析结果。
27.进一步，步骤(3)中荧光定量pcr反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火40s运行40个循环；最后40℃10s结束反应。
28.荧光定量pcr方法是一种高灵敏度、简便快捷的检测方法，操作简单，可应用sybr green染料法检测，无需使用荧光探针，设计简单，采用荧光定量pcr相对定量方法通过与表达水平相对稳定的管家基因比较来反映目的基因的表达水平，能很好的辅助nur77表达水平的研究，整个pcr反应过程只需1.5小时即可完成。核糖体蛋白基因产物例如rpl19是维持细胞生命活动所必须的，表达于所有细胞中，其表达只受启动序列或启动子与rna聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节，可用作细胞内质网应激的参考基因。
29.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种用于检测人源性nur77基因表达水平的引物组合物及其应用，具有以下有益效果：(1)特异性强
30.本发明设计nur77基因和rpl19基因的引物，通过比对分析设计的引物之间的二聚体、发夹结构等，最终设计出了2对引物组，能够特异性的检测nur77基因的表达水平，避免了同源性基因的干扰，通过对nur77的表达水平进行研究有助于明确疾病的发病机制和药物的疗效判断。
31.(2)检测敏感性高
32.常规对nur77表达水平的研究，通常采用免疫组化和western免疫印迹等方法从蛋
白水平进行研究，以蛋白为检测目标的方法通常操作比较繁琐，耗时。此外，也可以检测nur77的mrna量，但通常半定量反转录pcr需要电泳检测，准确度不够高。本发明建立的sybr green实时荧光定量rt-pcr方法对样品中的nur77表达水平进行定量，其检测的灵敏度非常高，用该技术建立的试剂盒可用于特异性的检测nur77的表达水平。
33.(3)操作方便简单
34.本发明采用染料法检测，无需使用荧光探针，设计简单，采用荧光定量pcr相对定量方法通过与表达水平相对稳定的管家基因比较来反映目的基因的表达水平，能很好的辅助nur77表达水平的研究。
35.(4)准确度更高
36.常用的actin管家基因受内质网应激影响，表达量会减少，不适宜用于内质网应激的参考基因，本发明以不受内质网应激影响的rpl19作为内参，提高了人源性nur77基因表达水平的检测准确性，检测过程简单、高效。
37.(5)检测时间短
38.本发明建立的sybr green实时荧光定量rt-pcr方法无需进行电泳，可直接通过电脑来观察反应结果，整个pcr反应过程只需1.5小时即可完成。而常规的rt-pcr方法至少需要3.5个小时来完成扩增反应，然后还需要花2个小时进行凝胶电泳来观察结果。
附图说明
39.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
40.图1为实时荧光定量pcr检测nur77标准品的荧光曲线图；
41.图2为根据nur77标准品的荧光曲线图得到的标准曲线；
42.图3为nur77引物扩增的熔解曲线；
43.图4为实时荧光定量pcr检测rpl19标准品的荧光曲线图；
44.图5为rpl19标准品的荧光曲线图得到的标准曲线；
45.图6为rpl19引物扩增的熔解曲线；
46.图7为不同rna干扰序列下的nur77基因表达水平。
具体实施方式
47.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
48.实施例1
49.一种非诊断治疗目的的用于检测人源性nur77基因表达水平的方法，包括如下步骤：
50.(1)组织或细胞rna提取
51.天根总rna提取试剂盒来提取细胞rna，具体操作按说明书进行。紫外分光光度计测定rna浓度，并控制提取质量，od260/280测定值为2.0。
52.(2)cdna反转录
53.取大约500ng rna，用takara商品化试剂盒primescript
tm rt master mix(perfect real time)来进行cdna的反转录，具体操作按说明书进行。
54.(3)荧光定量pcr反应
55.所用引物序列如下：
56.nur77-f：5
’‑
actggatacacccgtgacct-3’；seq id no.1；
57.nur77-r：5
’‑
tttctgcactgtgcgcttga-3’；seq id no.2；
58.rpl19-f：5
’‑
ctcgatgccggaaaaacacc-3’；seq id no.3；
59.rpl19-r：5
’‑
ttctctggcattcgggcatt-3’；seq id no.4。
60.实验中每种模板分别加入两种荧光定量pcr反应体系，分别进行nur77和rpl19基因检测，一种反应体系包含组分如下：
[0061][0062][0063]
另一种反应体系包含组分如下：
[0064]2×
acetaq sybr supermix12.5μl上游引物(rpl19-f)0.1～0.5μm下游引物(rpl19-r)0.1～0.5μm模板(1:5稀释的cdna)5μlddh2o余量总体积25μl
[0065]
荧光定量pcr反应条件为95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火40s运行40个循环；最后40℃10s结束反应。退火时检测荧光信号。可在运行结束后进行熔解曲线分析，检测引物扩增的特异性。
[0066]
本发明实施例中采用诺唯赞的acetaq sybr supermix，采用25μl反应体系。荧光定量pcr仪采用abi7500。
[0067]
(4)检测并分析结果
[0068]
根据系统自动基线和对数期阈值设置获得各个反应的ct值。
[0069]
计算2
‑△△
ct
值，即实验组nur77基因mrna表达水平与对照组比较的倍数。
[0070]
△△
ct＝(ctnur77(实验组)-ctrpl19(实验组))-(ctnur77(对照组)-ctrpl19(对照组))
[0071]
实施例2
[0072]
标准品为293t细胞cdna，采用dna稀释液依次1：4稀释，然后采用含有nur77引物对的sybr试剂进行检测，获得荧光曲线图，结果见图1。并根据标准品的量和对应ct值绘制标准曲线，结果见图2。
[0073]
nur77引物扩增的熔解曲线见图3。
[0074]
标准品为293t细胞cdna，采用dna稀释液依次1:4稀释，然后采用含有rpl19引物对的sybr试剂进行检测，获得荧光曲线图，结果见图4。并根据标准品的量和对应ct值绘制标准曲线，结果见图5。
[0075]
rpl19引物扩增的熔解曲线见图6。
[0076]
nur77和rpl19引物扩增的熔解曲线均只出现单一的熔解峰(图3和图6)，说明引物特异性较好，无非特异性扩增。
[0077]
实施例3
[0078]
根据nur77基因(nm_002135)表达水平来筛选rna干扰序列，具体步骤如下：
[0079]
(1)将nur77基因4种不同的rna干扰序列(s1～s4)及对照序列(表1)分别克隆至慢病毒质粒载体中。
[0080]
表1 nur77基因的干扰位点序列
[0081]
序列名称干扰序列序号s1tggtgaaggaagttgtccgaaseq id no.5s2gccctgtatccaagcccaataseq id no.6s3gcttcatgccagcattatggtseq id no.7s4gacagattctgacatttatatseq id no.8阴性对照caacaagatgaagagcaccaaseq id no.9
[0082]
在线分析nur77基因序列，确定四个干扰位点，序列如表1所示。由于克隆到rna干扰表达载体中的shrna包括干扰位点的两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构。根据确定的干扰位点分别设计4对针对nur77基因的shrna干扰序列上、下游引物和1对阴性对照序列的上下游引物，并在引物两端分别加入bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点，用于后续连接反应，将设计好的引物送苏州金唯智公司合成，上下游引物序列如表2(加粗序列是干扰位点)。
[0083]
表2干扰序列引物
[0084]
[0085][0086]
将合成好的4对干扰序列和对照序列的引物退火形成稳定的双链dna，退火反应条件如下：95℃，5分钟，缓慢降至室温。
[0087]
同时，将慢病毒干扰载体plenti-hu6-mcs-cmv(购自长沙赢润生物科技有限公司)通过bamhⅰ和ecorⅰ双酶切，将退火后的双链dna通过t4连接酶，连接到干扰载体中，获得4个rna干扰质粒及对照质粒。
[0088]
(2)采用瞬时转导的方法转导293t细胞：
[0089]
a.用含10％fbs的高糖dmem培养基培养293t细胞，将细胞放置于37℃，5％co2的细胞培养箱中培养。转导前1天消化293t细胞，计数，将细胞接种至35mm培养皿内，每个培养皿接种6
×
105个细胞；
[0090]
b.次日用不含fbs的dmem培养基分别配制钙转试剂(磷酸钙法细胞转染试剂盒(碧云天，货号c0508))和rna干扰质粒：每84μl培养基内加入16μl钙转试剂，获得钙转溶液；每100μl培养基内加入4μg质粒，获得质粒溶液；将分别混匀后的钙转溶液和质粒溶液混合，轻轻混匀，室温静置10分钟，逐滴加入培养皿内，在37℃，5％co2培养箱内培养24h，更换新鲜的含10％fbs的高糖dmem培养基继续培养48h。
[0091]
(3)收集细胞，提取细胞rna，反转录cdna，采用荧光定量pcr法检测nur77基因的表达水平：
[0092]
a.分别取500ng rna反转录cdna，采用荧光定量pcr法检测nur77基因的表达水平，以rpl19基因作为内参，荧光定量pcr所采用的引物序列见seq id no.1-4；
[0093]
b.用2
‑△△
ct
相对定量方法计算不同rna干扰序列样品的nur77基因表达水平。筛选出表达水平最低的rna干扰序列。
[0094]
检测结果见图7，表明s4序列的nur77基因表达水平最低，说明s4序列的rna干扰效果最好。
[0095]
本发明设计的nur77基因和rpl19基因的引物，能够特异性的检测nur77基因的表达水平，避免了同源性基因的干扰，通过对nur77的表达水平进行研究有助于明确疾病的发病机制和药物的疗效判断。
[0096]
通过上述实验结果可以得出，本发明的特异性引物组合及相应的方法，可以特异性检测人源性nur77基因的表达水平，避免同源性基因的干扰，并以不受内质网应激影响的rpl19作为内参，提高了人源性nur77基因表达水平的检测准确性，检测过程简单、高效。
[0097]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。