一种与大豆芽期耐低温相关的QTL、分子标记、扩增引物及应用

一种与大豆芽期耐低温相关的qtl、分子标记、扩增引物及应用
技术领域
1.本发明涉及大豆分子育种领域，具体涉及一种与大豆芽期耐低温相关的qtl、分子标记、扩增引物及应用。


背景技术：

2.种子萌发是植物生命周期中最重要的阶段之一。通常，胚根的出现表明种子萌发的完成。低温胁迫是植物生长发育和产量形成过程中主要的非生物胁迫因素之一，大豆种子萌发常受到低温胁迫，影响大豆的出苗率和出苗整齐度，进而影响大豆的产量。目前，低温对大豆种子萌发分子机理的影响在很大程度上还缺乏了解。针对芽期耐低温性状进行品种改良，对于提高大豆产量和品质具有重要意义。但是芽期耐低温属于复杂的数量性状，受多基因控制，传统育种周期长，难度大，需要耗费大量的人力物力。随着分子遗传学的发展，分子标记辅助选择育种为人们加快育种进程提供了新的途径。标记辅助选择育种是指在育种选择时通过对与功能基因相连锁的分子标记对目标性状进行间接选择。利用分子标记对数量性状基因座(quantitative trait locus，qtl)进行定位，是进行标记辅助选择育种的重要手段。目前国内外科研工作者已定位到的大豆芽期耐低温qtl较少，而且关于大豆芽期耐低温的qtl定位大部分都是初级定位，标记与目标性状距离过大，对其定位的精确性较差。qtl随机定位是在不同组合的不同遗传背景下发生多样化的重组过程，因此定位的qtl具有杂交组合特异性，标记区间过大，随着世代和遗传背景的改变可能会丧失，不利于应用。难于进行分子辅助选择。


技术实现要素：

3.本发明提供了一种与大豆芽期耐低温相关的qtl、分子标记、扩增引物及应用，所述的qtl位点，标记区间为0.56mb，lod值为4.18，其贡献率为10.59％，并鉴定了与大豆芽期耐低温相关的分子标记ssr-09-1126。
4.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
5.本发明的第一个目的是提供一种与大豆芽期耐低温相关的qtl，所述qtl位于大豆第9号染色体的38426868bp-38983456bp区间。
6.本发明的第二个目的是提供一种与大豆芽期耐低温相关的所述所述qtl的ssr分子标记，所述分子标记为ssr-09-1126，大豆第9号染色体的38701572bp-38701609bp区间，所述分子标记为ssr-09-1126的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明的第三个目的是提供了所述ssr分子标记的扩增引物，所述扩增引物如下：
8.ssr-09-1126f：5
′‑
ctcaatcgcgaaccctaaac-3
′
；
9.ssr-09-1126r：5
′‑
gtgctccgaaggctgtctac-3
′
。
10.本发明的第四个目的是提供所述扩增引物在大豆芽期耐低温性状鉴定中的应用。
11.本发明的第五个目的是提供了一种利用所述的扩增引物鉴定大豆芽期耐低温性
状的方法，包括以下步骤：
12.s1、提取大豆待鉴定材料基因组dna；
13.s2、利用ssr-09-1126扩增引物对待鉴定大豆材料进行pcr扩增；
14.s3、对扩增产物进行电泳分析，如果待鉴定大豆材料扩增产物的电泳带型属于ssr-09-1126中的1号带型，则鉴定为大豆芽期耐低温材料，如果待鉴定大豆材料扩增产物的电泳带型属于ssr-09-1126中的2号带型，则鉴定为大豆芽期低温敏感材料。
15.本发明的第六个目的是提供了所述ssr分子标记在大豆芽期耐低温性状选育中的应用。
16.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
17.1、本发明以栽培大豆和野生豆为亲本构建遗传群体，定位到1个与大豆芽期耐低温相关的qtl位点，标记区间为0.56mb，lod值为4.18，其贡献率为10.59％，并鉴定了与大豆芽期耐低温相关的分子标记ssr-09-1126，可用于分子标记辅助选择育种以及挖掘相关功能基因。同时可以利用野生资源，拓宽栽培大豆的遗传基础。
18.2、本发明利用培养箱对大豆芽期进行低温胁迫处理，将低温处理的大豆种子的发芽率作为评价大豆芽期耐低温能力的指标。并以黑龙江主栽品种绥农14作为轮回亲本，野生豆品种zyd00006作为供体亲本，杂交之后经过多代回交和自交，构建了全基因组导入系(chromosome segment substitution lines，cssls)群体。每个株行只含有少数的野生豆导入片段，能够缩小qtl区间，提高定位精度和准度，并在区间内鉴定与大豆耐低温相关的分子标记，这对于大豆耐低温性状的分子标记辅助选择育种以及功能基因研究是十分必要的，而且对于丰富大豆栽培种遗传多样性也具有重要意义。
附图说明
19.图1为作图群体构建过程图。
20.图2为群体重测序流程图。
21.图3为母本染色体覆盖深度分布图。
22.图4为各染色体snp标记与bin标记分布密度图。
23.图5为开发分子标记所用材料聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
24.其中，图a为ssr-09-1126引物耐性材料的电泳图，从左到右各泳道分别表示公野03-7239、庆安小金黄、黑农24、茶色豆、吉育39、公野03-5570、昌吉黄豆、铁荚四粒黄、黄宝珠、金满大豆、吉育93、公野04l-141、吉林20、元宝金、铁荚黑、大白眉、通农13、青冈四粒顶、吉育71、公野04-l15、黄金元、白皮豆、嫩丰11、吉育97、千斤黄、小白豆、吉育406、吉育66、五常豆、猫眼豆；
25.图b为ssr-09-1126引物敏感性材料的电泳图，从左到右各泳道分别表示黑河25、公p06-12、通农15、黑农69、j2512、吉育69、公p06-6、吉育441、吉育303、蒙豆31、黑农31、黑河29、长农14、黑河35、长农25、黑河11、黑河31、吉育299、合丰37、黑河14、九农36、黑河13、长密豆30、绥农15、吉农32、天鹅蛋、长农29、黑河43、绥农28、绥无腥豆2号。
具体实施方式
26.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限
制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
27.实施例1
28.与大豆芽期耐低温相关的qtl、分子标记、扩增引物及应用
29.一、与大豆芽期耐低温相关的qtl、分子标记、扩增引物的获得
30.1、作图群体的构建
31.2006年以绥农14(sn14)为轮回亲本，以野生大豆zyd00006为供体亲本，通过连续的回交与自交，构建全基因组导入系群体。具体世代见图1。
32.2、群体基因型检测
33.对群体进行重测序检测基因型(流程如图2所示)，步骤包括：
34.(1)利用ctab法提取亲本及后代株系dna。样品检测合格后，用超声破碎的方法将dna随机打断，dna片段经末端修复、3'端加a、加测序接头、纯化、pcr扩增完成测序文库的构建。文库经质检合格后通过illumina hiseqtm测序平台进行测序。
35.(2)将重测序获得的测序reads重新定位到参考基因组上，进行后续变异分析。利用bwa软件比对二代高通量测序得到的短序列与参考基因组。通过比对定位clean reads在参考基因组上的位置，统计各样品的测序深度(图3)、基因组覆盖度等信息，并进行变异的检测。
36.(3)对于bwa比对得到的结果，使用picard的mark duplicate工具去除重复，屏蔽pcr-duplication的影响。使用gatk进行indel realignment，即对存在插入缺失比对结果附近的位点进行局部重新比对，校正由于插入缺失引起的比对结果错误。使用gatk进行碱基质量值再校准(base recalibration)，对碱基的质量值进行校正。使用gatk进行变异检测(variant calling)，主要包括snp和indel。对snp进行严格过滤：snp cluster过滤(5bp内如果有2个snp则过滤掉)，indel附近snp过滤(indel附近5bp内的snp过滤掉)；和相邻indel过滤(两个indel距离小于10bp过滤掉)。最终筛选可用的snp标签为580524个。
37.(4)利用得到的580524个snp，以17个snp为一个窗口，1个snp为步长在染色体上滑动扫描，当滑窗内的snp分型为aa的snp大于12个时分型为aa，当滑窗内的snp分型为bb的snp大于14个时分型为bb，其它情况的为ab进行基因型填补和校正。
38.(5)完成标记填补和校正后，根据子代重组情况进行bin划分。将各样本按染色体物理位置排列整齐，当任何样本中出现分型转变就认为出现了重组断点，然后将重组断点间的snp划为bin中，经过bin筛选，最后以3196个bin作为作图的标记进行定位(图4)。
39.3、表型数据获取
40.本实施例以大豆低温处理后的发芽率作为大豆芽期耐低温的评价指标。
41.发芽率表型获取试验如下：每个材料设置3次重复，选择大小一致、圆润饱满无病、无虫害种子，用1％的次氯酸钠溶液消毒后，用蒸馏水漂洗三次，每40粒置于一个灭菌的9cm培养皿中，上下各铺一层灭菌滤纸，放入20℃培养箱吸胀12h后取出换水，转入6℃培养箱。吸胀结束后第6天调查其发芽数。
42.4、大豆芽期耐低温qtl分析
43.利用icimapping4.1软件中的icim(完备区间作图法)法对群体芽期耐低温进行qtl定位，选择icim-add模块进行分析，导入系群体采用csl模板。以lod值设为≥2.5，对大豆芽期耐低温进行qtl分析。在9号染色体上发现大豆芽期耐低温qtl区间，物理位置为
38426868bp-38983456bp，如表1所示。
44.表1大豆芽期耐低温qtl区间
[0045][0046]
5、分子标记鉴定
[0047]
利用60份大豆现有品种在区间内鉴定与大豆芽期耐低温相关的分子标记，鉴定到一个分子标记与芽期耐低温相关，分子标记位于大豆第9号染色体的38701572bp-38701609bp区间，命名为ssr-09-1126，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0048]
seq id no.1：
[0049]
gagagagagagagagagagagagagagagagagagaga上述60份大豆现有品种的表型数据如表2所示；
[0050]
表2开发分子标记所用材料表型
[0051]
[0052][0053]
所述分子标记ssr-09-1126的扩增引物如下：
[0054]
ssr-09-1126f：5
′‑
ctcaatcgcgaaccctaaac-3
′
(seq id no.2)；
[0055]
ssr-09-1126r：5
′‑
gtgctccgaaggctgtctac-3
′
(seq id no.3)。
[0056]
二、分子标记ssr-09-1126及其扩增引物的应用
[0057]
1、大豆芽期耐低温材料鉴定
[0058]
s1、提取大豆待鉴定材料基因组dna；
[0059]
ctab法提取大豆叶片基因组dna的步骤为：
[0060]
(1)取大豆叶片2-4g放入1.5ml离心管中，加入4颗直径2毫米的钢珠，放入液氮中冷冻，之后进行研磨，30次/s，研磨一分钟；
[0061]
(2)研磨完毕后加入事先65℃预热的ctab提取液700μl，并充分混匀；
[0062]
(3)将加好ctab的离心管放入65℃水浴锅中，水浴60分钟，每间隔15分钟上下颠倒混匀；
[0063]
(4)向水浴完成后的离心管中加入700μl氯仿溶液，颠倒混匀后，12000rpm/min离心15min；
[0064]
(5)吸取上清液放入另一个准备好的1.5ml离心管中，再次加入700μl氯仿，上下轻轻混匀后，12000rpm/min，离心15min；
[0065]
(6)另取新的1.5ml离心管，加入700μl事先预冷的-20℃异丙醇，将离心好的溶液取上清液，慢慢滴入装有异丙醇溶液的离心管中，8000rpm/min离心2min；
[0066]
(7)将上清液倒出，保留沉淀。加入700μl无水乙醇吹打数次，将无水乙醇吸出，加入700μl 75％乙醇再此吹打数次，将75％乙醇吸出，将dna放在通风处晾干；
[0067]
(8)向晾干的dna中加入100μl灭菌水，放入4℃冰箱中至dna完全溶解，转入-20℃冰箱中保存。
[0068]
s2、利用ssr-09-1126扩增引物对待鉴定大豆材料进行pcr扩增；
[0069]
pcr反应体系见表3，pcr反应程序见表4；
[0070]
表3 pcr反应体系
[0071][0072]
表4 pcr反应程序
[0073][0074]
s3、对扩增产物进行电泳分析，如果待鉴定大豆材料扩增产物的电泳带型属于ssr-09-1126中的1号带型，则鉴定为大豆芽期耐低温材料，如果待鉴定大豆材料扩增产物的电泳带型属于ssr-09-1126中的2号带型，则鉴定为大豆芽期低温敏感材料。
[0075]
扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如图5所示，图a为ssr-09-1126引物耐性材料(公野03-7239、庆安小金黄、黑农24、茶色豆、吉育39、公野03-5570、昌吉黄豆、铁荚四粒黄、黄宝珠、金满大豆、吉育93、公野04l-141、吉林20、元宝金、铁荚黑、大白眉、通农13、青冈四粒顶、吉育71、公野04-l15、黄金元、白皮豆、嫩丰11、吉育97、千斤黄、小白豆、吉育406、吉育66、五常豆、猫眼豆)的电泳图；
[0076]
图b为ssr-09-1126引物敏感性材料(黑河25、公p06-12、通农15、黑农69、j2512、吉育69、公p06-6、吉育441、吉育303、蒙豆31、黑农31、黑河29、长农14、黑河35、长农25、黑河11、黑河31、吉育299、合丰37、黑河14、九农36、黑河13、长密豆30、绥农15、吉农32、天鹅蛋、长农29、黑河43、绥农28、绥无腥豆2号)的电泳图。
[0077]
开发分子标记所用材料表型基因分型结果如表5所示；
[0078]
表5开发分子标记所用材料表型基因分型结果
[0079]
[0080][0081]
所述ssr-09-1126分子标记1号带型和2号带型芽期发芽率的单因素方差分析结果差异显著，如表6所示；
[0082]
表6ssr-09-1126分子标记1号带型和2号带型单因素分析结果
[0083][0084]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0085]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。