贯叶连翘提取物作为促进剂在生物质厌氧发酵中的用途

1.本发明涉及贯叶连翘提取物作为促进剂在生物质厌氧发酵中的用途。


背景技术：

2.厌氧发酵技术是指在无氧条件下，通过微生物的协同作用降解有机物转化为ch4、co2和稳定化学物质的过程，既可以有效处理有机废弃物，又可产生高热值的生物质能源——甲烷，是有机生物质资源深度开发和循环利用的重要途径之一，对缓解我国能源紧张状况、促进经济可持续发展以及改善生态环境具有重要意义。
3.目前，厌氧发酵技术在工业废水处理、有机废弃物(如餐厨果蔬垃圾、农林业生物质和废弃物、市政污泥等)处理等领域的应用一直呈现增长趋势。在工业化沼气生产中，如何提高沼气发酵原料的分解利用率和产气效率，增加其经济产值，是推进沼气产业化发展的当务之急。其中，使用发酵促进剂来增加产甲烷菌种群、改善厌氧发酵环境、提高发酵菌的代谢功能已逐渐成为目前生物质厌氧发酵研究的热点，是提高原料的分解利用率和沼气产量的有效途径之一。
4.贯叶连翘提取物是通过藤黄科植物贯叶金丝桃提取的以金丝桃素、原金丝桃素、伪金丝桃素、金丝桃苷、芦丁、槲皮素等为主要成分的一种物质，目前关于其的研究主要集中在药用方面，但尚未见其作为促进剂在厌氧发酵领域中的应用。


技术实现要素：

5.本发明旨在克服现有技术的不足，提供贯叶连翘提取物作为促进剂在生物质厌氧发酵中的用途。
6.为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
7.在总固体含量2％—20％，优选为8％—12％之间的常规厌氧发酵体系中加入贯叶连翘提取物，混匀，贯叶连翘提取物能够促进厌氧发酵体系中水解菌类、酸化菌、产乙酸菌和甲烷菌等相关微生物的活动，提高有机质的可厌氧发酵性能；其中，贯叶连翘提取物在发酵体系中的用量为0.1g/l—50g/l发酵体系。
8.所述厌氧发酵的底物为高浓度有机废水、有机固体废弃物(如农林废弃物、能源作物、畜禽废弃物、餐厨垃圾、市政污泥等)的一种或者多种。
9.所述的发酵体系中也可以添加其他催化剂，其他催化剂包括微生物、酶类、营养物质、螯合剂、微量元素、吸附剂、抑制剂以及其他具有催化作用的物质等中的一种或者几种。
10.本发明所述具体应用的过程如下：
11.(1)根据《中华人民共和国药典》(2020年版一部“贯叶金丝桃”)制备得到贯叶连翘提取物；
12.(2)可选用处理高浓度有机废水、餐厨垃圾、农业生物质废弃物、剩余污泥的厌氧污泥，或反刍动物的瘤胃液等作为厌氧发酵的接种物；高浓度有机废水、农林废弃物、能源作物、畜禽废弃物、餐厨垃圾等废弃物等均可作为底物；
13.(3)根据接种物与底物的总固体含量(total solid，ts)和挥发性固体含量(volatile solids，vs)的值，计算进样量。根据计算结果将接种物和底物加入厌氧发酵系统中，并添加贯叶连翘提取物，搅拌均匀，然后通入氮气，将发酵罐中的空气排出以制造厌氧环境；
14.(4)在发酵罐内置搅拌装置，便于混匀物料；将发酵罐的出气口与集气单元相连，便于分析发酵系统内产甲烷的情况；于厌氧反应器中部和/或底部设置温度传感器和加热装置，便于保持温度。运行厌氧发酵罐，保持适宜的厌氧发酵条件，每日记录甲烷产量。
15.进一步的，步骤(1)中，贯叶连翘提取物的主要成分为金丝桃素、原金丝桃素、伪金丝桃素、金丝桃苷、芦丁、槲皮素等，vs/ts为75％-95％。
16.进一步的，步骤(2)中，取自厌氧发酵罐中的污泥，可调节含水率，储存于密封的容器中并通入氮气，排除反应装置内的氧气，使整个容器中的温度保持在15-25℃左右。而瘤胃接种物取自屠宰场的奶牛瘤胃，将新鲜瘤胃内含物放入保温带盖容器内，1h内迅速通过纱布过滤掉草料获得瘤胃液，再经12000rpm离心10min后获得瘤胃接种物，保存在4℃环境中。为了减少接种物自身产气的影响，待无气体产生后进行接种。农林废弃物、能源作物秸秆取回后可自然风干，然后粉碎过筛，置于阴凉干燥处备用；剩余污泥、餐厨垃圾、畜禽废弃物取回后，置于4℃冰箱中冷藏备用。
17.进一步的，步骤(3)中，厌氧污泥与物料的挥发性固体含量比为0.1～5，发酵体系的总固体含量为3％～12％，贯叶连翘提取物有效浓度为0.1g/l-50g/l，通入氮气的时间大于2min。
18.进一步的，步骤(4)中，厌氧发酵在中温条件(30～40℃)下进行，ph为6.3～7.8，搅拌方式为间歇性搅拌。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
20.(1)通过直接向厌氧发酵体系中添加贯叶连翘提取物，促进有关微生物的活动，加速有机物的分解，提高厌氧发酵系统的甲烷产量、缩短滞后时间及发酵周期、提高发酵系统稳定性；同时该发明无需增加额外设备，操作简单易行。
21.(2)所适用的厌氧发酵底物广泛，可用于高浓度有机废水、有机固体废弃物(如农林废弃物、能源作物、畜禽废弃物、餐厨垃圾、市政污泥等)的厌氧处理。
22.(3)使用的贯叶连翘提取物来源广、用量少、成本低。
23.本发明通过向厌氧发酵系统中加入贯叶连翘提取，促进微生物的活动，提高厌氧发酵系统的甲烷产量、缩短滞后时间及发酵周期、提高发酵系统稳定性。
附图说明
24.图1为贯叶连翘提取物对累积甲烷产量的影响；
25.图2为贯叶连翘提取物对厌氧发酵周期的影响；
26.图3为样本中细菌科水平的相对丰度分布图；
27.图4为样本中古菌属水平的相对丰度分布图；
28.图5为不同发酵时期细菌群落主成分分析图；
29.图6为不同发酵时期古菌群落主成分分析图。
具体实施方式
30.实施例1
31.添加贯叶连翘提取物可提高有机质厌氧发酵累积甲烷产量：
32.(1)利用全自动甲烷潜能测试装置进行中温厌氧消化实验：厌氧消化实验在工作体积为500ml的血清瓶中进行，接种物来自处理市政污泥的厌氧发酵罐，以玉米秸秆作为有机底物。厌氧污泥取回后调节含水率，加入适量碳源、氮源及微量元素，通入氮气，连接搅拌转子，在中温条件下进行驯化，待污泥内有机质消耗完毕且活性较好时，进行厌氧消化实验。进料原则为：发酵体系总固体浓度为8％左右，污泥与底物的挥发性固体含量比为1，贯叶连翘提取物作为发酵促进剂的添加量分别为0.1、1、5、10、25、50g/l。实验以污泥为空白对照，以不添加贯叶连翘提取物作为阴性对照。
33.(2)厌氧发酵实验的运行条件：利用留有取样口和出气口的橡胶塞将瓶口封住，从取样口通入2min氮气，保证厌氧环境，然后将瓶子放入37℃恒温水浴锅，采用聚乙烯软管将厌氧发酵罐出气口与co2吸收装置连接起来，再将吸收装置与集气单元连接，使得发酵过程中所产生的甲烷能被实时监测到。而取样口上连接止水阀，并在不取样时保持阀门关闭。同时将发酵装置与机械搅拌连接，设置搅拌周期为开启60s，停止60s，搅拌强度约为80rpm。每日记录甲烷产量，直至甲烷产量小于5ml/3d时，视为厌氧发酵过程已经结束，并计算出累积甲烷产量。
34.(3)扣除污泥和贯叶连翘提取物的自身甲烷产量后，各组的累积甲烷产量为：阴性对照组1278.0
±
17.5nml，添加0.1、1、5、10、25、50g/l贯叶连翘提取物的实验组分别为1291.6
±
11.9、1342.4
±
26.8、1574.0
±
0.9、1400.1
±
11.7、1346.5
±
8.2、1305.0
±
7.1nml，累积甲烷产量如图1所示。与未添加贯叶连翘提取物作为阴性对照组相比，累计甲烷产量提高1％-25％。
35.实施例2
36.添加贯叶连翘提取物可缩短有机质厌氧发酵周期：
37.(1)利用全自动甲烷潜能测试装置进行中温厌氧消化实验：厌氧消化实验在工作体积为500ml的血清瓶中进行，接种物来自处理市政污泥的厌氧发酵罐，以微晶纤维素作为有机底物。厌氧污泥取回后调节含水率，加入适量碳源、氮源及微量元素，通入氮气，连接搅拌转子，在中温条件下进行驯化，待污泥内有机质消耗完毕且活性较好时，进行厌氧消化实验。进料原则为：发酵体系总固体浓度为10％左右，污泥与底物的挥发性固体含量比为1，贯叶连翘提取物作为发酵促进剂的添加量为10g/l。以污泥为空白对照，以不添加贯叶连翘提取物作为阴性对照。
38.(2)厌氧发酵实验的运行条件：利用留有取样口和出气口的橡胶塞将瓶口封住，从取样口通入2min氮气，保证厌氧环境，然后将瓶子放入37℃恒温水浴锅，采用聚乙烯软管将厌氧发酵罐出气口与co2吸收装置连接起来，再将吸收装置与集气单元连接，使得发酵过程中所产生的甲烷能被实时监测到。而取样口上连接止水阀，并在不取样时保持阀门关闭。同时将发酵装置与机械搅拌连接，设置搅拌周期为开启60s，停止60s，搅拌强度约为80rpm。每日记录甲烷产量，直至甲烷产量小于5ml/3d时，视为厌氧发酵过程已经结束，并计算出累积甲烷产量。
39.(3)实验结果：阴性对照组在48h时停止产甲烷，发酵结束。添加10g/l贯叶连翘提
取物后，发酵周期为22h，相对于阴性对照组发酵周期缩短了54.2％。发酵周期如图2所示。
40.实施例3
41.添加贯叶连翘提取物可促进发酵系统中的化学需氧量(cod)物质的降解：
42.(1)利用全自动甲烷潜能测试装置ampts进行中温批式厌氧消化实验，厌氧消化实验在工作体积为500ml的血清瓶中进行，接种物来自处理市政污泥的厌氧发酵罐，以微晶纤维素作为有机底物。厌氧污泥取回后调节含水率，加入适量碳源、氮源及微量元素，通入氮气，连接搅拌转子，在中温条件下进行驯化，待污泥内有机质消耗完毕且活性较好时，进行厌氧消化实验。进料原则为：发酵体系总固体浓度为12％左右，污泥与底物的挥发性固体含量比为1，贯叶连翘提取物作为发酵促进剂的添加量为0.1g/l和1g/l。以不添加贯叶连翘提取物作为阴性对照。
43.(2)厌氧发酵实验的运行条件：利用留有取样口和出气口的橡胶塞将瓶口封住，从取样口通入2min氮气，保证厌氧环境，然后将瓶子放入37℃恒温水浴锅，采用聚乙烯软管将厌氧发酵罐出气口与co2吸收装置连接起来，再将吸收装置与集气单元连接，使得发酵过程中所产生的甲烷能被实时监测到。而取样口上连接止水阀，并在不取样时保持阀门关闭。同时将发酵装置与机械搅拌连接，设置搅拌周期为开启60s，停止60s，搅拌强度约为80rpm。以每日甲烷产量甲烷产量小于5ml/3d作为厌氧发酵过程结束。在发酵的早、中、晚期取样，检测发酵液中挥发性悬浮固体(vss)、挥发性脂肪酸(vfas)、可溶性蛋白质、可溶性多糖，以及h2和甲烷产量，以发酵前发酵系统的总cod含量作为参照，对发酵系统进行cod衡算。
44.(3)实验结果：在贯叶连翘提取物的作用下，发酵系统中的cod物质更快的降解，生成甲烷。不同贯叶连翘提取物浓度下，厌氧发酵系统的cod质量平衡分析如表1所示。
45.表1厌氧发酵系统的cod质量平衡分析
[0046][0047]
厌氧发酵过程是有机质转化的过程，该过程中的总cod是保持不变的。本试验研究了以微晶纤维素为底物的厌氧发酵产气高峰期间，不同浓度的贯叶连翘提取物对反应器中各种有机质分布的影响。其中vss是发酵体系中固相cod的来源，scod、可溶性蛋白质和可溶性多糖是发酵体系中液相cod的来源，ch4和h2是气体中主要的cod成分。从表1结果可知，贯叶连翘提取物的添加使vss所占cod百分比较对照组显著降低，1g/l的贯叶连翘提取物可使系统中大部分cod分布于ch4，表明贯叶连翘提取物的添加可有效促进可溶性挥发性固体的液化及向甲烷的转化。
[0048]
实施例4
[0049]
贯叶连翘提取物促进发酵系统中内有关微生物活动：
[0050]
(1)利用全自动甲烷潜能测试装置ampts进行中温批式厌氧消化实验，厌氧消化实验在工作体积为500ml的血清瓶中进行，接种物来自处理市政污泥的厌氧发酵罐，以微晶纤
维素作为有机底物。进料原则为：发酵体系总固体浓度为3％左右，污泥与底物的挥发性固体含量比为1，贯叶连翘提取物作为发酵促进剂的添加量为1g/l。以不添加贯叶连翘提取物作为对照组。发酵装置设置搅拌周期为开启60s，停止60s，搅拌强度约为80rpm。
[0051]
(2)微生物样本取样方式与命名：将发酵前的厌氧污泥作为原始微生物样本(命名为s0)，在发酵的第6、12、18天从发酵装置中取污泥样品，作为不同发酵时间点的微生物样本(依次命名为s1、s2、s3)。未添加贯叶连翘提取物的对照组命名为ck，添加1g/l贯叶连翘提取物的实验组命名为hy组。
[0052]
(3)微生物样本的总dna获取：取发酵液20ml，8000rpm条件下离心10min，收集沉淀，采用fast dna spin kit for soil(mp biomedicals，美国)试剂盒提取各个微生物样本中总dna。
[0053]
(3)发酵的第6、12、18天分别为厌氧发酵产甲烷的高峰期，中期和晚期。结果中s0代表发酵前的厌氧污泥中的微生物样本，ck-s1/s2/s3分别为对照组在发酵的高峰期、中期和晚期的微生物样本，hy-s1/s2/s3分别为添加贯叶连翘提取物的实验组在发酵的高峰期、中期和晚期的微生物样本。各样本中细菌科水平的相对丰度分布如图3所示，不同发酵时期细菌群落主成分分析如图4所示；各样本中古菌属水平的相对丰度分布如图5所示，不同发酵时期古菌群落主成分分析如图6所示。
[0054]
(4)细菌群落差异性：在细菌科水平(图3)，添加贯叶连翘提取物使优势产乙酸菌lachnospiraceae得到了富集，提高了乙酸的产生；而其它产酸菌dysgonomonadaceae、ruminococcaceae被抑制，降低了其它挥发性脂肪酸的产生，提高了厌氧发酵体系的稳定；促进gracilibacteraceae菌株的富集，进一步维持厌氧发酵反应的稳定，并且加速了以lachnospiraceae菌科为主微生物种群的恢复，减短了反应的周期；并且提高了互营菌synergistaceae的互营氧化反应效率，从而提高了乙酸化的效率。
[0055]
(5)古菌群落差异性：在古菌属水平(图4)，添加贯叶连翘提取物能够降低厌氧污泥中rumen-m2、的相对丰度，增加了methanobrevibacter、candidatus-methanogranum、methanosaeta、candidatus_methanogranum四类菌属的相对丰度，说明连翘提取物对methanomassiliicoccales下的各类菌属的组成结构有较大影响，从而对于甲烷化阶段产生影响。贯叶连翘提取物不仅加强了乙酸发酵产甲烷途径，也加强了利用co2产甲烷的氢营养型途径，总体上提高了甲烷化阶段的效率。
[0056]
(6)微生物群落差异分析
[0057]
不同发酵时期细菌群落的pcoa分析(图5)可知，hys1与cks1，hys3与cks3之间距离较近，说明在发酵早期s1和晚期s3，实验组与对照组细菌群落组成差异不显著；hys2和cks2之间距离较远，hys2与cks3及hys3的距离较近，说明在发酵中期s2，实验组与对照组微生物群落组成具有一定差异，此时hys2更接近发酵终点的菌群组成，说明连翘提取物促进厌氧发酵产甲烷效率，发酵周期显著缩短，因此微生物群落结构与发酵终点更为相似。
[0058]
不同发酵时期古菌群落的pcoa(图6)可知，hys1与cks1，hys2与cks2在pc2轴上分开，说明在发酵早期s1和中期s2，实验组与对照组古菌群落组成有差异；hys3和cks3之间距离较近，说明在发酵晚期s3，实验组与对照组微生物群落组成十分接近。