一种抗内脏白点病大黄鱼的分子标记辅助选育方法

1.本发明涉及水产生物育种领域，尤其涉及一种抗内脏白点病大黄鱼的分子标记辅助选育方法。


背景技术：

2.大黄鱼是我国养殖量最大的海水鱼类，但是由于养殖密度增大、种质退化、养殖水环境恶化等因素的影响，大黄鱼养殖过程中各种病害频发，其中较为流行的为大黄鱼的内脏白点病。大黄鱼的内脏白点病是由变形假单胞菌引起的细菌性疾病，该病为体内发病，发病初期难以发现症状，发病后期病鱼的肝脏、脾脏、肾脏上已布满白色细菌结节，药物治疗效果不理想，因此培育抗内脏白点病的大黄鱼具有重要的现实意义。
3.分子标记辅助育种技术是利用分子标记与决定目的性状的基因紧密连锁的特点，通过检测分子标记存在，从而检测出目标基因，并筛选出目的性状。目前最为有效的dna分子标记种类为snp(单核苷酸多态性)标记，指在基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入。snp在基因组中分布十分广泛，数量多，与目标基因的连锁更为紧密。但目前还没有对大黄鱼的抗内脏白点病性状进行分子标记辅助选育的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种抗内脏白点病大黄鱼的分子标记辅助选育方法，包括如下步骤：
5.(1)通过人工攻毒实验对大黄鱼参考群体的抗内脏白点病性状进行测定，获得抗病力极端表型个体；
6.(2)提取抗病力极端表型个体的基因组dna，进行全基因组重测序，利用短序列比对软件bwa比对到大黄鱼参考基因组上，并使用gatk软件进行变异检测，获得其snp变异信息；
7.(3)使用plink软件筛选出符合下述要求的snp位点：最小等位基因频率》0.05，哈代-温伯格平衡校验p-value》0.01,测序覆盖度》5
×
，位点缺失率《20％；再使用beagle软件填充缺失的基因型；
8.(4)使用emmax软件进行gwas，表型为参考群体中每个个体自攻毒开始至濒死状态的时间，软件计算出每个snp位点与表型值相关性的显著性即p-value，将snp位点按照p-value从小到大排序，选取排位靠前的5～30个snp作为辅助育种的分子标记；p-value最低的snp位点即为与抗病性状最显著相关的snp位点；
9.(5)对大黄鱼候选亲鱼剪取少量鳍条提取基因组dna，并用适当的方法对每尾候选亲鱼打上可进行个体识别的标记；对候选亲鱼进行基因分型，获得各个snp标记的基因型信息，通过gblup方法计算每尾亲鱼的基因组估计育种值即gebv，挑选gebv值从高到低排位靠前的亲鱼繁育后代，其后代即为抗内脏白点病的抗病选育群体。
10.进一步，所述作为辅助育种的分子标记为ncbi sra：srp156868的0328_
1567750bp，0328_1607434bp，0328_1849967bp，0328_3244694bp，0408_460773bp，0602_1107844bp，2887_1015167bp，3024_837549bp，0196_6442294bp，0328_2973428bp，0641_260583bp，2772_2145054bp，b2797_264354p，2827_1882196bp，2965_107321bp，3122_151540bp，3207_1657548bp，3159_506493bp。
11.进一步，所述对每尾候选亲鱼打上可进行个体识别的标记是指在每尾大黄鱼背部肌肉内打入电子射频标记，或者其他容易读取编号又不易脱落的标记。
12.进一步，所述对候选亲鱼进行基因分型是指运用snp芯片、massarray、kasp、高通量测序的方法对候选亲鱼进行基因分型。
13.本发明的有益效果为：(1)首次将基因组选择育种技术应用于大黄鱼抗病选育工作中，为今后大黄鱼或其他养殖鱼类的抗病选育工作提供参考依据；(2)通过抗病标记的筛选，有效的降低了候选亲鱼的选育成本，并大大加快了抗病选育的周期。
附图说明
14.图1是选育组与对照组脾脏内相对含菌量检测结果图。
15.图2是选育组与对照组攻毒后存活率比较图。
具体实施方式
16.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
17.实施例1抗内脏白点病大黄鱼群体的选育
18.实验材料：
19.试验材料为大黄鱼，饲养于福建宁德金铃水产科技有限公司。变形假单胞菌菌种可商购(比如盖德化工网的cs-0019-1315)。
20.1.参考群体抗内脏白点病性状表型值的测定：
21.采用浸泡攻毒法对参考群体(800尾大黄鱼)进行攻毒实验，将养殖池内水位降低后，泼洒变形假单胞菌菌液(至池内菌液浓度为106cfu/ml)，池内保持充气。将所有大黄鱼在池内浸泡3h后捞出，经干净海水冲洗后放入干净海水池内，每个6h检查一次鱼体状态，当大黄鱼开始失去游泳能力，身体僵硬，并且逐渐腹部向上偏转时，认为该大黄鱼进入濒死状态，将濒死大黄鱼捞出解剖，确认病症后剪取鳍条保存于无水乙醇内，并记录死亡时间。每尾大黄鱼自攻毒实验开始至进入濒死状态的时间作为其抗病性状的表型值。
22.2.snp挖掘及gwas分析：
23.选取攻毒实验中最先发病的96尾作为易感组、到攻毒实验结束仍未出现病状的2尾与最迟进入濒死状态的94尾作为抗病组，加上发病时间居中的30尾，合计222尾提取其鳍条基因组dna，进行全基因组重测序。测序数据经bwa(bwa-0.7.17)软件比对后，使用gatk软件进行变异检测，获得其snp变异信息。使用plink(v1.90b6.12)软件对snp位点进行质量控制，筛选出符合标准的snp位点，质控标准为：最小等位基因频率》0.03，哈代-温伯格平衡校
验p-value》0.01，位点缺失率《20％，测序深度》5
×
。使用beagle(version 4.1)软件填充缺失的基因型。一共获得254,110个合格的snp位点。使用emmax软件计算个体间亲缘关系矩阵，并进行全基因组关联分析。计算得到p-value最低的snp位点即为与抗病性状最显著相关的snp位点。snps相关信息已提交ncbi sra：srp156868。作为辅助育种的分子标记的snp位置如表1：
24.表1大黄鱼抗内脏白点病snp分子标记基因组位置信息表
[0025][0026][0027]
3.抗内脏白点病亲鱼挑选：
[0028]
在784尾大黄鱼亲鱼的背部肌肉内打入电子射频标签，并剪取少量鳍条提取其基因组dna，进行massarray基因分型，通过gblup方法计算每尾亲鱼的基因组估计育种值(gebv)，挑选gebv最高的雌鱼31尾、雄鱼22尾作为亲本，按照常规的大黄鱼人工育苗方法进行催产、苗种培育，培育出的鱼苗即为抗内脏白点病的抗病选育群体。将同时期培育的普通大黄鱼作为普通对照组。
[0029]
实施例2：
[0030]
实验材料：试验数据为由抗内脏白点病分子标记辅助育种获得的抗内脏白点病选育群体，培育出的鱼苗养殖于宁德市晶力水产有限公司示范点渔排及宁波综合试验站象山湾网箱养殖基地。
[0031]
1.抗内脏白点病选育群体与普通对照组的存活率比较
[0032]
宁德市晶力水产公司示范点渔排所在海区于2019年夏季在海区爆发内脏白点病时，引起对照组大黄鱼不断死亡，而抗病选育组很少出现死亡情况。
[0033]
分别选取对照组与抗病选育组各30尾进行解剖观察并对脾脏组织内的变形假单胞菌含量进行检测。结果显示，30尾对照组大黄鱼的内脏上布满大量白色斑点，而抗病选育组的内脏没有发现感染症状；变形假单胞菌的检测结果如图1所示，抗病选育组的大黄鱼脾脏内病菌的含量显著少于对照组，表明选育组大黄鱼具有更强的抗病力。
[0034]
宁波综合试验站象山湾网箱养殖基地所在海区于2021年遭遇各种病害情况。2021年5月分别选取5000尾抗病选育组大黄鱼及普通大黄鱼养殖于同一渔排，截止至12月，普通
对照组剩余不足1000尾，存活率小于20％；抗病选育组剩余2150尾，存活率为43％，存活率显著提高，比对照组高1倍以上。
[0035]
2.抗病选育群体与普通对照组的攻毒实验存活率比较
[0036]
随机取148尾抗病选育组与164尾对照组进行变形假单胞菌的攻毒实验，实验方法与构建参考群体的攻毒方法相同。实验结果显示，攻毒后第4天，对照组就开始出现死亡情况，而选育组第5天才出现死亡情况；到攻毒后第8天，选育组存活率为27.03％，对照组仅为10.98％，明显低于选育组。实验结果如图2所示，与对照组相比，选育组的感染时间延迟，感染率较低，存活率明显提高。
[0037]
由以上结果显示，本发明提高了大黄鱼对内脏白点病的抗性，通过本发明的方法选育出的大黄鱼的抗病力显著高于普通对照组，获得了抗病力显著提高的选育群体。
[0038]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。