一种多肽类似物在抗皱抗衰老中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药领域和医美化妆品领域，具体涉及一种多肽类似物在抗皱抗衰老中的应用。


背景技术：

2.自身免疫性疾病和衰老有极其密切的关系，随着年龄的增长，人体的固有免疫不断增强而适应性免疫不断减弱，炎症因子如tnf-αil-1,il-6的表达水平升高，引起慢性炎症，慢性炎症会造成dna损伤，加速衰老细胞的积累，这种炎症造成的衰老称为“炎症衰老”。慢性炎症同时还会造成免疫系统失调，增加自身免疫性疾病的发病风险。
3.mymd-1可以选择性地抑制tnf-α，它陆续被用于探索治疗肌少症、衰老等疾病。 mymd-1选择性抑制炎症因子tnf-α的表达，减少了慢性炎症的发生，使得细胞难以释放出活性氧(ros)破坏dna，端粒就不容易受到损伤，以此达到抗衰老的目的。而mymd-1可以穿越血脑屏障意味着它或许能治疗阿尔兹海默症和其他大脑相关疾病。
4.mymd-1选择性极高，当tnf-α在自身免疫性疾病和细胞因子风暴中过度激活时，它能够选择性地阻断tnf-α，但不会阻止免疫系统正常应对中度感染，也不会引起全局免疫抑制或毒性，而修美乐(阿达木单抗)和目前市面上的其他tnf-α抑制剂是通过不加选择地阻断 tnf-α而起作用，可能导致严重甚至致命的感染。
5.目前抗衰老成熟多肽产品有阿基瑞林、棕榈酰五肽-4、syn-ake蛇毒肽等，这类多肽以一种特别的方式局部针对皱纹形成机制进行作用，是一种更安全、更廉价、更温和的肉毒杆菌毒素的替代品，它们作用于神经肌肉接头，影响神经递质释放，使肌肉收缩减弱，防止皱纹形成。而这些多肽产品的抗衰老产品因其机理原因，大部分仅对表皮层皮肤改善方面有较好的效果，不能深层次的起到抗衰老的作用，其中阿基瑞林参与竞争snap-25在融泡复合体的位点，从而影响融泡复合体的形成，导致囊泡不能有效释放神经递质，使肌肉收缩减弱，进而可以放松肌肉、舒缓细纹使肌肤呈现清透无暇，也可以促使细胞再生使肌肤恢复柔软弹性，因此被广泛应用于制备化妆品和保健品。阿基瑞林(argireline)是模仿snap-25蛋白n端 6个氨基酸的寡肽一，因此阿基瑞林功效主要是减少由面部表情肌收缩造成的皱纹，对额头或眼睛周围的皱纹有理想的祛除效果。
6.棕榈酰五肽-4(pal-lys-thr-thr-lys-ser)包含5个与16碳脂肪族链相连的氨基酸，以改善分子通过皮肤脂质结构的渗透性。棕榈酰五肽-4是信使肽，能够通过特定受体相互作用调节细胞活性，它们激活参与细胞外基质更新和细胞增殖过程的某些基因。通过激活细胞外基质大分子的新合成，这种肽的抗皱功效的研究(体外和体内)表明，棕榈酰五肽-4具有抗皱作用。体外研究表明，i型胶原蛋白的合成增加了212％，iv型胶原蛋白的合成增加了100％至327％，透明质酸的合成增加了267％。胶原蛋白i主要存在于人体的19种形式的胶原蛋白中。因此，提高胶原蛋白i的产量对重建皮肤具有非常显着的作用。六个月的体内研究表明，平均皱纹深度减少了17％，深层皱纹的表面积减少了68％，中度皱纹的表面积减少了 51％，皮肤粗糙度减少了16％。
7.syn-ake是一种模拟蛇毒毒素waglerin i活性的小肽，waglerin i发现于temple viper 毒蛇的毒液(tripidolaemus waglerin)。syn-ake是一种合成三肽衍生物和一种新的蛇毒类似活性化合物，为肌肉烟碱乙酰胆碱受体(nmachr)拮抗剂。


技术实现要素：

8.为了解决现有技术的不足，本发明旨在提供一种多肽类似物在抗皱抗衰老中的应用。具体方案如下：
9.本发明的第一目的在于提供一种多肽类似物或其药学上可接受的盐，所述多肽类似物为 mymd与阿基瑞林、棕榈酰五肽或syn-ake的融合肽，其具有如下式(1)所示结构式：
[0010][0011]
其中，r为阿基瑞林残基、棕榈酰五肽残基或syn-ake残基，所述阿基瑞林残基、棕榈酰五肽残基或syn-ake残基通过酰胺键与mymd连接。
[0012]
进一步地，当r为阿基瑞林残基时，所述多肽类似物记为argireline-mymd(分子量为： 1019.15)，其具有如下i所示结构式：
[0013][0014]
当r为棕榈酰五肽残基时，所述多肽类似物记为pentapeptide-mymd(分子量为：974.26)，其具有如下ii所示结构式：
[0015][0016]
当r为syn-ake残基时，所述多肽类似物记为syn-ake-mymd(分子量为：547.66)，其
具有如下iii所示结构式：
[0017][0018]
本发明的第二目的在于提供所述多肽类似物的制备方法，当多肽类似物为mymd与阿基瑞林的融合肽时，所述制备方法包括：
[0019]
1.1在rinkamide resin树脂上，按照序列偶联fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、 fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh和mymd-1 酰氯，偶联结束后经洗涤和干燥，得到肽树脂；
[0020]
1.2所得肽树脂用裂解液进行裂解，滤掉树脂，析出白色固体，洗涤，纯化，即得；
[0021]
当多肽类似物为mymd与棕榈酰五肽的融合肽时，所述制备方法包括：
[0022]
2.1在fmoc-ser(tbu)-wang resin树脂上，按照序列偶联fmoc-lys(boc)-oh、 fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-lys(alloc)-oh和棕榈酰氯，偶联结束后经洗涤和干燥，得到线性肽肽树脂；
[0023]
2.2选择性脱除lys的alloc保护基，得到脱除alloc的肽树脂，向其中加入mymd-1 酰氯和dipea进行反应，反应结束后经洗涤，得到肽树脂；
[0024]
2.3所得肽树脂用裂解液进行裂解，滤掉树脂，析出白色固体，洗涤，纯化，即得；
[0025]
当多肽类似物为mymd与syn-ake的融合肽时，所述制备方法包括：
[0026]
3.1脱除rinkamide resin树脂的fmoc保护基，加入4-羟甲基苯乙酸、hobt和dic 组成的活化液，鼓氮气开始反应，反应开始后加入nmm，反应结束后，抽滤，用dmf洗涤、 dcm洗涤；
[0027]
3.2向步骤3.1反应体系中加入boc-dab(fmoc)-oh和dcm，鼓氮气开始反应，加入吡啶，控制反应液温度＜20℃，滴加dcb，滴加完成后保持低温30分钟，之后升温至35～30℃，反应结束后，抽滤，用dmf洗涤；
[0028]
3.3boc-pro-oh和hobt用dmf溶解，用dic活化后加入至步骤3.2反应体系中，鼓氮气开始反应，加入nmm，反应结束后，抽滤，用dmf洗涤、dcm洗涤，再加入tfa/dcm，鼓氮气反应至反应完全，抽滤，使用dmf洗涤；
[0029]
3.4boc-β-ala-oh和hobt用dmf溶解，用dic活化后加入至步骤3.3反应体系中，鼓氮气开始反应，加入nmm，反应结束后，抽滤，用dmf洗涤、dcm洗涤，再加入tfa/dcm，鼓氮气反应至反应完全，抽滤，使用dmf洗涤；
[0030]
3.5苄胺用dmf/thf溶解后加入至骤3.4反应体系中，鼓氮气开始反应，反应结束后，用dmf洗涤、dcm洗涤，得到肽树脂；
[0031]
3.6向步骤3.5所得肽树脂中加入mymd-1酰氯和dipea进行反应，反应结束后经洗涤，得到肽树脂；
[0032]
3.7步骤3.6所得肽树脂用裂解液进行裂解，滤掉树脂，析出白色固体，洗涤，纯化，
即得。
[0033]
进一步地，步骤1.2，步骤2.3和步骤3.7中所述裂解液为tfa、tis、edt、phoh和 h2o的组合物；
[0034]
优选地，所述tfa、tis、edt、phoh和h2o的体积比为90:3:3:2:2；
[0035]
步骤3.1中脱除rinkamide resin树脂的fmoc保护基所用试剂为20％(v/v)哌啶/dmf 溶液。
[0036]
本发明的第三目的在于提供所述多肽类似物或其药学上可接受的盐在制备药物、护肤品、化妆品或保健品中的应用。
[0037]
进一步地，所述药物、护肤品、化妆品或保健品为用于抗皱抗衰老；
[0038]
进一步地，所述药物、护肤品、化妆品或保健品为用于增强皮肤弹性、紧实肌肤、淡化色斑或美白嫩肤。
[0039]
本发明的第四目的在于提供一种含有所述多肽类似物或其药学上可接受的盐的产品。
[0040]
进一步地，所述产品为药物、护肤品、化妆品或保健品；
[0041]
进一步地，所述产品还包括除本发明所述多肽类似物或其药学上可接受的盐以外的其他活性成分；
[0042]
进一步地，所述护肤品或化妆品还包括其他辅料；
[0043]
进一步地，所述药物或保健品还包含可药用辅料。
[0044]
进一步地，所述护肤品或化妆品为凝胶、乳液、精华液、眼霜、面膜、面霜、冻干粉或柔肤水。
[0045]
进一步地，所述药物或保健品为药膏、药水、药用凝胶、药用乳膏、药用乳液或敷贴药剂。
[0046]
本发明的第五目的在于提供一种皮肤外用精华液，其活性成分包括所述多肽类似物或其药学上可接受的盐。
[0047]
进一步地，所述皮肤外用精华液中还包括除所述多肽类似物或其药学上可接受的盐以外的其他活性成分；
[0048]
优选地，所述多肽类似物或其药学上可接受的盐以外的其他活性成分选自syn-ake；
[0049]
优选地，所述多肽类似物具有如下iii所示结构式：
[0050][0051]
进一步地，所述皮肤外用精华液还包括其他辅料；
[0052]
优选地，所述其他辅料包括甘油、己二醇、戊二醇和抗氧化剂中的一种或多种。
[0053]
本发明的有益效果为：
[0054]
本发明创新性地将mymd-1和抗皱及皮肤美容肽syn-ake、pentapeptide或argireline 相结合，获得的多肽类似物具有双功能抗衰老的作用，不仅能从皮肤表层起到抗皱、美白的效果，而且具备mymd-1选择性抑制炎症的功效，减少了慢性炎症的发生，使得细胞难以释放出活性氧(ros)破坏dna，保护端粒酶不损伤，以此达到从内到外的抗衰老的目的。其中 syn-ake-mymd的抗皱抗衰老效果更佳。
附图说明
[0055]
图1：syn-ake-mymd纯品的hplc分析检测结果。
[0056]
图2：syn-ake-mymd纯品的质谱检测结果。
[0057]
图3：皮肤弹性测试的实验结果。
具体实施方式
[0058]
为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
[0059]
实施例1：argireline-mymd的制备
[0060]
argireline-mymd，分子量为1019.15，具有如下所示结构：
[0061][0062]
argireline-mymd的制备方法，具体包括：
[0063]
1.1、称取rinkamide resin树脂(sub＝0.25mmol/g)4克(1mmol)于反应柱中，用 dmf清洗3次，再用dmf溶胀30分钟。然后用dblk脱除fmoc保护基团，用dmf洗涤 6次，称取fmoc-arg(pbf)-oh 3.9克(6mmol)，hobt 0.9克(6.6mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入1.2克dic(9mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时后，茚三酮检测结果为阴性(树脂无色透明)，然后用dblk脱除fmoc保护基团。重复上述操作，按照序列偶联fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、 fmoc-glu(otbu)-oh、mymd-1酰氯，合成完成后用dmf、dcm、甲醇依次清洗，干燥后得到肽树脂。
[0064]
1.2、肽树脂用预先配制好的裂解液(tfa：tis：edt：phoh：h2o＝90:3:3:2:2(体积比)) 进行裂解，裂解反应时间2.5小时，滤掉树脂，树脂用少量tfa洗涤，合并滤液，加入到无水乙醚中析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥的到白色固体，白色固体为 argireline-mymd粗肽，用hplc对上述粗肽进行纯化，得到纯度96.25％的精肽208mg，产品总收率28.12％。产品经结构确认，确认是目标产物。
[0065]
实施例2：pentapeptide-mymd的制备
[0066]
pentapeptide-mymd，分子量为974.26，具有如下所示结构：
[0067][0068]
pentapeptide-mymd的制备方法，具体包括：
[0069]
2.1、称取fmoc-ser(tbu)-wang resin(sub＝0.30mmol/g)3.3克(1mmol)于反应柱中，用dmf清洗3次，再用dmf溶胀30分钟。然后用dblk脱除fmoc保护基团，用dmf洗涤6次，称取fmoc-lys(boc)-oh 3.9克(6mmol)，hobt 0.9克(6.6mmol)，用dmf溶解，0℃冰水浴下加入1.2克dic(9mmol)，活化5分钟，加入反应柱，反应2小时后，茚三酮检测结果为阴性(树脂无色透明)，然后用dblk脱除fmoc保护基团。重复上述操作，按照序列偶联fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-lys(alloc)-oh、palmitoyl chloride，合成完成后用dmf、dcm、甲醇依次清洗，干燥后得到线性肽肽树脂。
[0070]
2.2、将2.1步骤中得到的全保护肽树脂，用dcm清洗3次，称取4.3克的苯硅烷，量取 50ml的dcm，加入反应柱中，反应5分钟之后，加入1.2克的pd0(ph3p)4，反应1小时。然后用dcm清洗3次树脂，用dmf溶液清洗肽树脂30分钟，dmf清洗树脂3次，再用dcm 清洗树脂3次，得到选择性脱除allocl的肽树脂，然后加入mymd-1酰氯和dipea，反应2 小时，完成后用dcm、甲醇依次清洗，得到肽树脂。
[0071]
2.3、肽树脂用预先配制好的裂解液(tfa：tis：edt：phoh：h2o＝90:3:3:2:2(体积比)) 进行裂解，裂解反应时间2.5小时，滤掉树脂，树脂用少量tfa洗涤，合并滤液，加入到无水乙醚中析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥的到白色固体，白色固体为 pentapeptide-mymd粗肽，用hplc对上述粗肽进行纯化，得到纯度96.12％的精肽178g，产品总收率23.15％。产品经结构确认，确认是目标产物。
[0072]
实施例3：syn-ake-mymd的制备
[0073]
syn-ake-mymd，分子量为547.66，具有如下所示结构：
[0074][0075]
syn-ake-mymd的制备方法，具体包括：
[0076]
3.1、取rinkamide resin树脂4g(1mmol，树脂取代值为0.25mmol/g)加入反应器中，洗涤后用dmf溶胀1小时，抽滤，再加入20％哌啶/dmf溶液，取4-羟甲基苯乙酸0.9克、 hobt 0.9克，低温溶解，缓缓加入dic 1.2克，并搅拌，得到活化液，将活化液加入反应器中，鼓氮气开始反应，反应开始后加入nmm 15ml，持续反应2小时，抽滤，用dmf洗涤、 dcm洗涤；
[0077]
3.2、取boc-dab(fmoc)-oh 2.7克加入反应器中，加入dcm适量溶解，鼓氮气，加入吡啶0.5克，控制反应液温度＜20℃，滴加dcb 2.5ml，滴加完成后保持低温30分钟，之后升温至35～30℃，反应2小时，抽滤，用dmf洗涤；
[0078]
3.3、称取boc-pro-oh 1.3克，hobt 0.9克，用dmf冰浴溶解，缓缓加入dic 1.2克，边加边搅拌，加入完成后，保持低温，再加入反应器中，鼓氮气开始反应，加入nmm 15ml，持续反应2小时，抽滤，使用dmf洗涤，再使用dcm洗涤；加入tfa/dcm 20ml(体积比1:3)，鼓氮气反应至反应完全，抽滤，使用dmf洗涤；
[0079]
3.4、称取boc-β-ala-oh 1.2克，hobt 0.9克，用dmf冰浴溶解，缓缓加入dic 1.2克，边加边搅拌，加入完成后，保持低温，再加入反应器中，鼓氮气开始反应，加入nmm 15ml，持续反应2小时，抽滤，使用dmf洗涤，再使用dcm洗涤；加入tfa/dcm 20ml(体积比 1:3)，鼓氮气反应至反应完全，抽滤，使用dmf洗涤；
[0080]
3.5、称取苄胺0.7克加入烧杯中，加入dmf/thf 16ml(体积比1:1)溶解后加入反应器中，鼓氮气反应6小时，使用dmf洗涤，再使用dcm洗涤得到肽树脂；
[0081]
3.6、上述3.5中肽树脂加入mymd-1酰氯1.2克和dipea 1.6克，反应2小时，完成后用dcm、甲醇依次清洗，得到肽树脂。
[0082]
3.7、得到的肽树脂用预先配制好的裂解液(tfa：tis：edt：phoh：h2o＝90:3:3:2:2 (体积比))进行裂解，裂解反应时间2.5小时，滤掉树脂，树脂用少量tfa洗涤，合并滤液，加入到无水乙醚中析出白色固体，离心，无水乙醚洗涤固体，真空干燥的到白色固体，白色固体为syn-ake-mymd粗肽，用hplc对上述粗肽进行纯化，得到纯度97.87％的精肽124mg，产品总收率10.28％。质谱检测的分子量结果及hplc检测的纯度结果如图1和图2所示。
[0083]
实施例4：多肽精华液制备
[0084]
多肽精华液成分配比见下表1，多肽为syn-ake-mymd、pentapeptide-mymd、 argireline-mymd或syn-ake：
[0085]
表1
[0086]
成分比例(质量百分比)水55％甘油25％己二醇5％戊二醇5％抗氧化剂(卵磷脂)6％多肽4％
[0087]
4.1、将甘油、水、己二醇、戊二醇、抗氧化剂(卵磷脂)按照对应比例依次加入乳化锅中，开启搅拌，温度控制在85℃；
[0088]
4.2、当乳化锅原料溶解完全后，开启降温，当温度降至45℃时，分别加入活性多肽类似物(syn-ake-mymd、pentapeptide-mymd、argireline-mymd、syn-ake)，搅拌均匀；
[0089]
4.3、当温度降至40℃时，过滤出料，即得精华液1(多肽类似物为syn-ake-mymd)、精华液2(多肽类似物为pentapeptide-mymd)、精华液3(多肽类似物为argireline-mymd)、精华液4(多肽类似物为syn-ake)。
[0090]
实施例5：复合肽精华液制备
[0091]
复合肽精华液成分配比见下表2：
[0092]
表2
[0093]
成分比例(质量百分比)水55％甘油25％己二醇4％戊二醇4％抗氧化剂(卵磷脂)6％多肽1(syn-ake-mymd)4％多肽2(syn-ake)2％
[0094]
5.1、将甘油、水、己二醇、戊二醇、抗氧化剂(卵磷脂)按照对应比例依次加入乳化锅中，开启搅拌，温度控制在85℃；
[0095]
5.2、当乳化锅原料溶解完全后，开启降温，当温度降至45℃时，再加入活性多肽 (syn-ake-mymd、syn-ake)，搅拌均匀；
[0096]
5.3、当温度降至40℃时，过滤出料，即得精华液5。
[0097]
实施例6：抗衰老功效测试
[0098]
选25到50岁志愿试用者30名随机分成5组，每组6人，分别使用实施例4、5所制备的5种精华液。
[0099]
试验方法：所有志愿者在每晚睡前进行洁面处理，每人右脸使用所分配的精华液，左脸不使用精华液，使用方法：受试者每天固定半脸早晚各用一次含活性肽的精华液，使用量保证半脸均匀涂抹两次，连续6周，在试验期间不与其他祛皱抗衰老护肤品同用，在0、2、4、 6周随访1次，共4次。
[0100]
皮肤弹性测试：使用皮肤弹性测试仪测量左右眼尾部位皮肤。选择参数r5(回弹部分的弹性量/拉伸部分的弹性量，两个过程的弹性性能之比)、f4(最大拉伸量与时间构成的面积)值作为比较指标。对左右眼尾部位各测量4次取平均值。每组6人的数据去掉最大值和最小值，再平均得到该组的实验数据。通过测量使用产品前后的皮肤弹性参数r5和紧致参数f4来评估该产品对眼部肌肤弹性的改善效果。r5值越接近1，皮肤弹性越好；f4值越小，皮肤越紧致。通过图3的结果显示精华液1和精华液5效果r5值有明显提升，而且精华液1和精华液5结果基本一致，因此认为加入了syn-ake-mymd的精华液具有增强皮肤弹性，紧实肌肤的效果，而其中起主要作用的是多肽类似物syn-ake-mymd。
[0101]
抗衰老测试：对参与实验组群的实验效果进行评估，评估标准为有效表示为试用者左右脸对比面部明显更加细白嫩滑，面部细纹减少，明显淡化色斑，嫩白更有弹性；无效表示为试用者皮肤质感无任何变化；一般为试用者肤质有所改善但是效果不显著，介于有效和无效之间，其结果如前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。
[0102]
抗衰老测试结果如表3，结果显示精华液1和精华液5效果一致，而且同为最佳，因此认为加入了syn-ake-mymd的精华液具有抗衰老美白的效果，而其中起主要作用的是多肽类似物syn-ake-mymd。
[0103]
表3
[0104][0105]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明的内容进行一些稍微的变更，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。