一种从复杂样本中特异捕获氨类化合物的材料及其制备方法和应用

1.本发明涉及复杂基质体系中代谢物分离技术领域，具体的说涉及一种从复杂样本中特异捕获氨类化合物的材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.氨基类代谢物例如氨基酸、儿茶酚胺、肽类以及多胺类化合物在细胞的生物合成、细胞成长、信号转导和免疫调节过程中起到了重要的作用。其中以氨基酸为例，氨基酸不仅仅是营养物质，为生命活动提供物质基础，而且在信号传递、基因表达、蛋白质合成中起到了重要作用。此外，氨基酸还可以参与调控体内重要的代谢通路，而这些通路对生命体正常功能的行使、生长发育、机体修复以及自生免疫至关重要，这些氨基酸也被称之为功能氨基酸，包括精氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、脯氨酸以及色氨酸等。氨基酸代谢产物如一氧化氮、多胺、谷胱甘肽、牛磺酸、甲状腺激素和血清素等的浓度对维持机体功能也起到了重要作用。此外，氨基酸以及其代谢产物例如氨、高半胱氨酸、非对称二甲基精氨酸水平的上升会引起一系列的疾病，例如神经系统疾病、氧化压力异常以及心血管疾病。因此，胞内和体液循环中氨基酸水平的稳定对于维持机体稳态显得至关重要。通过对组织、血液、尿液以及粪便中氨基类代谢物水平的检测可以进行疾病的诊断和预测。
3.代谢物小分子常规的分析技术包括核磁共振技术(nmr)、超高效液相色谱-质谱联用技术(uplc-ms)和气相色谱-质谱联用技术(gc-ms)，允许并行测定数百种代谢物。其中质谱法(ms)由于其优异的检测范围和灵敏度，是研究人体样品中复杂代谢物混合物的主要技术。
4.生物样本中成分往往比较复杂，除氨基类化合物外，还含有大量的无机盐、有机盐、磷脂、蛋白等会对测试结果产生干扰，需要对样本进行预处理，除去或减弱干扰，以得到稳定性高，重复性好的结果。样品中的蛋白可以通过有机溶剂例如甲醇和乙腈沉淀的方法除去，但样品中大量水溶性和脂溶性的杂质不能通过该方法除去。目前氨基类化合物常用的方法是液相-质谱联用，通过色谱柱进行分离，之后通过质谱进行检测，以降低基质干扰，尤其是在超高效液相色谱(uplc)的出现，进一步提高了分离效果。但是，由于大部分氨基类化合物例如氨基酸具有强极性基团，不利于化合物在反向色谱柱中的保留和分离。尽管目前有衍生化试剂对氨基类化合物进行衍生，以降低化合物的极性，提高色谱柱分离效果。例如柱前衍生化试剂异硫氰酸苯酯(pitc)，以及6-氨基喹啉基-n-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯类(aqc)对氨基类化合物进行衍生，将具有紫外吸收的脂溶性基团连接在分子上，便于后续的液相色谱分离和光谱检测。此外，还可以衍生出具有质谱信号增强效果的基团，提高氨基类分子在质谱中的检测能力。但存在的问题是，衍生不能除去大量的基质，过量的衍生化试剂也会对检测产生干扰，污染和堵塞色谱柱，降低仪器寿命。
5.因此，提供一种能解决目前直接进样过程中的基质干扰以及分析效率低等问题的从复杂样本中特异捕获氨类化合物的材料是本领域技术人员亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种从复杂样本中特异捕获氨类化合物的材料及其制备方法和应用，以解决直接进样过程中的基质干扰以及分析效率低的问题。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种从复杂样本中特异捕获氨类化合物的材料，其特征在于，其具有如通式(ⅰ)所示结构：
[0009][0010]
其中，黑色圆点为具有磁性响应的磁芯，x为氨基上不同取代基，y为两个氮原子之间的连接链；
[0011]
侧链含有胱胺，其中的二硫键为选择性断裂基团；侧链中的z为异硫氰酸酯基团结合母核；侧链末端含有异硫氰酸酯基团，用于特异性捕获氨基类化合物。
[0012]
进一步，所述具有磁性响应的磁芯材质为铁、钴、镍、四氧化三铁或含有上述材质的包被材料。
[0013]
更进一步，所述包被材料的包被物为氨基化二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯酸中的一种。
[0014]
优选的，磁芯材质可以为任意具有磁响应的材料，可以选自铁粉、四氧化三铁、镍粉、钴粉及其组合物，还可以为磁芯与其他材料的组合物，例如二氧化硅包被的四氧化三铁、二氧化硅氨基包被的四氧化三铁、二氧化硅羟基包被的四氧化三铁、二氧化硅羧基包被的四氧化三铁。磁芯表面含有氨基以及取代氨基，用于后续衍生。
[0015]
更优选的，磁芯为表面包被有二氧化硅氨基的四氧化三铁(fe3o4@sio
2-nh2)。
[0016]
进一步，所述所述连接链y为含有酰基或氨酰基的链，包含且不限于以下结构：
[0017][0017][0018]
优选的，x为h、ch3、ch2ch3、ch2ch2oh中的一种。y为含有氨基、羧基、异氰酸酯、异硫氰酸酯、醛基等可以被继续衍生的基团的分子。z为能够连接异硫氰酸酯基团的分子母核。
[0019]
更优选的，x为h，y为含有氨基或者羧基的化合物，z为含有苯环的母核。
[0020]
最优选的，y为丁二酸。
[0021]
进一步，z-ncs为末端异硫氰酸酯基团，包含且不限于以下结构：
[0022][0023]
进一步，所述从复杂样本中特异捕获氨类化合物的材料可以选择以下结构：
[0024]
[0025][0026]
本发明还提供了上述从复杂样本中特异捕获氨类化合物的材料的制备方法，包括以下步骤：
[0027]
(1)氨基磁芯连接胱胺琥珀酸链，其合成路线为：
[0028][0029]
步骤为：
[0030]
(1-1)芴甲氧羰酰胱胺琥珀酸侧链的制备：
[0031]
将胱胺二盐酸盐溶于水中，加入碳酸氢钠继续搅拌。后加入二氧六环，冰浴搅拌10分钟，后将丁二酸酐加入上述反应体系中，所得反应体系室温搅拌12小时。反应完成后，冰浴，向反应体系中加入n,n-二异丙基乙胺，准确称量9-芴甲基-n-琥珀酰亚胺基碳酸酯溶于
n，n-二甲基甲酰胺中，后逐滴到上述反应体系中。反应体系回复到室温，继续搅拌2个小时。反应完成后，过滤，滤液真空浓缩至粘稠，后加入水并不断搅拌，滤液中产生大量白色固体。过滤收集白的固体，水洗、真空干燥得到芴甲氧羰酰胱胺琥珀酸(，所得固体无需纯化，直接用于后续反应。；
[0032]
(1-2)磁性材料连接芴甲氧羰酰胱胺琥珀酸侧链：
[0033]
将芴甲氧羰酰胱胺琥珀酸与2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯混合，加入二甲亚砜溶解，后加入n,n-二异丙基乙胺，混合均匀，加入到上述磁珠中，继续振荡，连接fmoc-cs。连接完成后，磁分离，除去溶剂，洗涤，更换离心管，得到连接有fmoc-cs的磁珠；
[0034]
(1-3)磁性材料侧链脱芴甲氧羰基：
[0035]
在含有磁珠的离心管中加入n,n-二甲基甲酰胺溶液，加入1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯，振荡反应1小时反应完成后，洗涤，更换离心管，得到含有胱胺侧链的磁珠；
[0036]
(2)磁性材料衍生异硫氰酸酯基团，其合成路线为：
[0037][0038]
(2-1)4-羧基苯基异硫氰酸酯制备：
[0039]
称取4-氨基苯甲酸加入二氯甲烷中，磁力搅拌条件下加入三乙胺，冰浴，然后取硫代羰基二咪唑，加入到上述反应体系中，继续搅拌，再取盐酸加入石油醚，混合振荡，后逐滴加入到反应体系中，滴加完成之后，继续反应，反应体系中产生大量白色沉淀，，过滤，水洗得到淡黄色固体，蒸干水分后得到白色固体，即为4-羧基苯基异硫氰酸酯；
[0040]
(2-2)磁性材料衍生异氰酸酯基团：
[0041]
将4-羧基苯基异硫氰酸酯与2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯混合，加入二甲亚砜溶解，加入n,n-二异丙基乙胺，混合均匀，振荡后加入到步骤(1)制备的含有胱胺侧链的磁性材料中，所得反应体系继续振荡0.1-2。反应完成后，磁分离除去溶剂，洗涤，更换离心管，即得从复杂样本中特异捕获氨类化合物的材料。
[0042]
进一步，步骤(1-1)中所述胱胺二盐酸盐与碳酸氢钠的质量比为1:1；
[0043]
胱胺二盐酸盐的物质的量与二氧六环的体积比为10mmol：100ml；
[0044]
胱胺二盐酸盐与丁二酸酐的摩尔比为1:1；
[0045]
胱胺二盐酸盐的物质的量与n,n-二异丙基乙胺的体积比为10mmol：3.3ml；
[0046]
胱胺二盐酸盐与9-芴甲基-n-琥珀酰亚胺基碳酸酯的摩尔比为1:1；
[0047]
胱胺二盐酸盐的物质的量与n，n-二甲基甲酰胺的体积比为10mmol：10ml；
[0048]
进一步，步骤(1-2)中所述芴甲氧羰酰胱胺琥珀酸与2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯的质量比为1:1；
[0049]
芴甲氧羰酰胱胺琥珀酸的质量与二甲亚砜的体积比为1-10mg：1ml；
[0050]
芴甲氧羰酰胱胺琥珀酸的质量与n,n-二异丙基乙胺的体积比为1-10mg：0.1-1ml；
[0051]
进一步，步骤(1-3)中所述n,n-二甲基甲酰胺溶液用量为0.5ml；
[0052]
1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯用量为0.5ml；
[0053]
进一步，步骤(2-1)中所述4-氨基苯甲酸的的质量与二氯甲烷的体积的比为5g：51ml；
[0054]
三乙胺的用量为5.6ml；
[0055]
硫代羰基二咪唑的用量为8.45g；
[0056]
盐酸的用量为12ml，石油醚的用量为50ml；
[0057]
进一步，步骤(2-2)中所述4-羧基苯基异硫氰酸酯与2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯的质量比为15:1-20；
[0058]
二甲亚砜的用量为1-10ml；
[0059]
n,n-二异丙基乙胺的用量为01-1ml；
[0060]
本发明还提供了上述从复杂样本中特异捕获氨类化合物的材料的应用方法，包括以下步骤：
[0061]
1)取0.1-1mg所述材料，加入0.2-1ml二甲亚砜、0.3ml血清、0.001-0.1ml三乙胺，0-50℃振荡0.1-5h，反应完成后，磁分离除去溶剂，依次用磷酸盐缓冲液洗涤、水洗、乙腈和水的混合溶液洗涤，更换离心管，备用；
[0062]
2)捕获得到的氨基类化合物断键：
[0063]
将步骤1)制备的磁性材料混悬于0.1-1ml乙腈或甲醇的水溶液中，加入0.01ml二硫代苏糖醇振荡断键1-24h，断键完成后，磁分离，吸取溶液，稀释5倍，离心，用于后续的质谱检测分析。
[0064]
采用上述进一步方案的有益效果在于：不仅在操作上更加简便，不受大型仪器(如高速离心机)的限制，且实现了材料与溶液的彻底分离，更有利于后续实验的进行。
[0065]
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种全新的磁性材料、制备方法，以及该材料在复杂样本中选择性捕获氨基类化合物的应用方法。该磁性材料将氨基类柱前衍生化试剂异硫氰酸苯酯(pitc)及其类似物通过一段连接链固定在磁性材料上，形成磁性材料。材料上面的异硫氰酸酯基团可以选择性与氨基类化合物通过加成反应形成共价结合。而样品中不与异硫氰酸酯基团反应的成分，可以通过简单的磁分离和洗涤的方法除去。此外，连接链中含有二硫键，在氨基捕捉和洗涤过程中稳定，可以在二硫代苏糖醇等还原剂的存在下选择性断裂，将捕获的氨基类化合物从磁性材料上断裂下来。断键溶液经过简单的磁分离后便可以直接用于后续实验分析。本发明实现了复杂样本中氨基类化合物的快速、高效的选择性捕获，纯化和释放。捕捉到的氨基类化合物被衍生连接上一段脂溶性片段，提高了氨基类化合物在反向色谱柱中的分离效果；同时裂解片段具有强紫外吸收，兼容紫外检测器，
提供多维度检测方案。并且该磁性材料技术路线成熟，氨基捕获过程效率高、操作简单、价格低廉，可以实现高通量操作，具有很好的应用前景。
[0066]
与传统的氨基类分析方法相比，本发明提供的方法中富集条件温和、材料廉价易得，容易制备，捕获的特异性高，效果显著。采用本发明提供的方法进行氨基捕获，可以除去大量的磷脂、各种盐类等基质干扰，有利于后续的质谱分析，通过同位素标记的代谢物作为内标，能够更加真实地表现样本中氨基类化合物的种类和浓度水平，发现新的氨基类化合物，对生物标志物筛查研究及重大疾病的预警、疾病发展、预后评估等均具有重要的意义；为复杂样本中氨基类小分子检测和相关肿瘤标志物的筛查等提供了新思路和新方法。
附图说明
[0067]
图1为本发明中的四氧化三铁包被二氧化硅氨基磁芯的扫描电镜照片
具体实施方式
[0068]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0069]
在本发明实施例中：移液器吸头购自axygenscientific公司。
[0070]
实施例1
[0071]
从复杂样本中特异捕获氨类化合物的材料的制备方法：
[0072]
(1)氨基磁芯连接酰胱胺琥珀酸(cystaminesuccinicacid)链：
[0073][0074]
(1-1)芴甲氧羰酰胱胺琥珀酸(fmoc-cystaminesuccinicacid,fmoc-cs)侧链的制备：
[0075]
将胱胺二盐酸盐(2.25g，10mmol)溶于10ml水中，加入碳酸氢钠(2.25g，30mmol)继
续搅拌。后加入100ml二氧六环，冰浴冷却10分钟。将丁二酸酐(1.00g，10mmol)加入上述反应体系中，所得反应体系室温继续搅拌12小时。反应完成后，冰浴，向反应体系中加入n,n-二异丙基乙胺3.3ml，准确称量9-芴甲基-n-琥珀酰亚胺基碳酸酯(3.37g，10mmol)溶于n，n-二甲基甲酰胺10ml中，后逐滴到上述反应体系中。反应体系回复到室温，继续搅拌2个小时。反应完成后，过滤，滤液真空浓缩至粘稠，后加入200ml水并不断搅拌，滤液中产生大量白色固体。过滤收集白的固体，水洗、真空干燥得到2.23g芴甲氧羰酰胱胺琥珀酸(47％)。所得固体无需纯化，直接用于后续反应。
[0076]
(1-2)磁性材料连接芴甲氧羰酰胱胺琥珀酸侧链：
[0077]
将芴甲氧羰酰胱胺琥珀酸(5mg)与2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯5mg混合，加入二甲亚砜1.0ml溶解，后加入0.5mln,n-二异丙基乙胺，混合均匀，加入到上述磁性材料中，继续振荡。反应完成后，磁分离，除去溶剂，洗涤，更换离心管，得到连接有芴甲氧羰酰胱胺琥珀酸侧链的磁性材料。
[0078]
(1-3)磁性材料侧链脱芴甲氧羰酰胱胺琥珀酸保护：
[0079]
在含有磁性材料的离心管加入0.5ml芴甲氧羰酰胱胺琥珀酸溶液，加入1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯0.5ml。后振荡1小时，反应完成后，洗涤，更换离心管，得到含有胱胺侧链的磁性材料。
[0080]
(2)磁性材料衍生异氰酸酯基团：
[0081][0082]
(2-1)4-羧基苯基异硫氰酸酯制备：
[0083]
称取4-氨基苯甲酸(5.00g，36.5mmol)加入51ml二氯甲烷中，磁力搅拌条件下加入5.6ml三乙胺，冰浴，然后取硫代羰基二咪唑(8.45g，47.4mmol)，加入到上述反应体系中，继续搅拌，再取12ml盐酸加入50ml石油醚，混合振荡，后逐滴加入到反应体系中，滴加完成之后，继续反应，反应体系中产生大量白色沉淀，过滤，水洗得到淡黄色固体，蒸干水分后得到白色固体，即为4-羧基苯基异硫氰酸酯；
[0084]
(2-2)将4-羧基苯基异硫氰酸酯2.5mg与2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯10mg混合，加入5ml二甲亚砜溶解，加入0.5mln,n-二异丙基乙胺，混合均匀，振荡后加入到磁性材料中，所得反应体系继续振荡1小时。反应完成后，磁分离除去溶剂，洗涤，更换离心管备用。
[0085]
实施例2磁性材料对血清中氨基类化合物共价捕获：
[0086]
1)取实施例1制备的磁性材料0.5mg，加入0.6ml二甲亚砜，加入0.03ml血清，加入0.05ml三乙胺，25℃振荡3小时。反应完成后，磁分离除去溶剂，依次用磷酸盐缓冲液洗涤、水洗、乙腈和水的混合溶液洗涤，更换离心管，备用。
[0087]
2)捕获得到的氨基类化合物断键：
[0088]
将步骤1)磁性材料混悬于0.5ml乙腈的水溶液中，加入0.01ml二硫代苏糖醇(0.1m)振荡断键12小时。断键完成后，磁分离，吸取溶液，稀释5倍，离心用于后续的质谱检测分析。超高分辨的质谱分析结果表明，该方法可以测到超过1000个代谢相关的质谱峰。通过比对人类代谢组学数据库(hmdb，humanmetabolomedatabase)，找到超过150个目标代谢物分子，其中部分质谱结果如附表1所示。
[0089]
表1实施例1制备的磁性材料对血清富集部分结果
[0090]
[0091][0092]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。