美洲大蠊GRP蛋白表达抑制剂及其编码基因与应用

美洲大蠊grp蛋白表达抑制剂及其编码基因与应用
技术领域
1.本发明涉及卫生害虫防治领域，具体涉及美洲大蠊grp蛋白表达抑制剂及其编码基因与应用。


背景技术：

2.美洲大蠊(蟑螂)是蜚蠊科中体型最大的昆虫，幼虫需要经历十四个龄期变成成虫，成虫的大约3～4厘米，体色呈黄棕色。蟑螂在世界范围内广泛的分布，喜欢温暖阴暗潮湿的环境，主要生存于各种下水道，厨房、浴室、厕所等。蟑螂是一种群居性的昆虫，通常会通过其粪便中的聚集性激素聚集在一起。蟑螂是一种杂食性的昆虫，偏好含糖、含脂和含淀粉等食物。蟑螂在日常生活中不仅会污染我们的食物，还是多种病原微生物的携带者，是世界性的卫生害虫。蟑螂被认为是最难以防治的卫生害虫之一，其中很重要的一个原因就是它具有极强的环境适应能力和繁殖力。蟑螂一生中可以多次产卵，每颗卵鞘可以孵化出大约16只幼虫，孵化周期为30～40天。蟑螂在恶劣的环境中仍能够繁殖下一代是因为蟑螂能够产生一个高度硬化，且高度保水的卵鞘。卵鞘这一特性使得蟑螂在千百年来，即使发生了很多地质环境的变化也没有灭绝。
3.随着人们生活水平和生活质量的要求日益提高，越来越多的人关注卫生害虫的防治。市面上也出现了不同类型的蟑螂药。这些蟑螂药往往具有一定的毒性，而且过度的使用生态环境会造成一定的影响。随着长期大量的使用蟑螂可能出现了耐药性，甚至发生一些突变。卫生害虫与人们生活质量和食品安全息息相关。开发环境友好、高效、低毒的蟑螂防治方法是对于国家经济发展、社会进步和食品安全具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种蛋白质，能够用于防控美洲大蠊。
5.本发明还提出一种与上述蛋白质相关的生物材料。
6.本发明还提出一种上述蛋白质和生物材料的应用。
7.本发明还提出一种grp抑制剂。
8.本发明还提出上述grp抑制剂的应用。
9.本发明还提出一种防治美洲大蠊的方法。
10.在本发明的第一方面，提出了一种蛋白质，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
11.a)氨基酸序列如seq id no.2所示的蛋白质；
12.b)氨基酸序列如seq id no.2所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；
13.c)将seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；
14.d)与seq id no.2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功
能的蛋白质。
15.在本发明的一些实施方式中，所述蛋白质为grp蛋白。
16.在本发明的第二方面，提出了与上述蛋白质相关的生物材料，为下述1)至8)中的任一种：
17.1)编码上述的蛋白质的核酸分子；
18.2)含有1)所述核酸分子的表达盒；
19.3)含有1)所述核酸分子的重组载体；
20.4)含有2)所述表达盒的重组载体；
21.5)含有1)所述核酸分子的重组微生物；
22.6)含有2)所述表达盒的重组微生物；
23.7)含有3)所述重组载体的重组微生物；
24.8)含有4)所述重组载体的重组微生物。
25.在本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如seq id no.1所示。
26.在本发明的第三方面，提出了上述蛋白质和生物材料的应用，所述应用为在降低美洲大蠊卵鞘保水性中的应用。
27.在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备防治美洲大蠊的产品中的应用。
28.在本发明的第四方面，提出了一种grp抑制剂。
29.在本发明的一些实施方式中，所述grp抑制剂为靶向上述蛋白质的dsrna、mirna、核酶或shrna。
30.一种dsrna，所述dsrna为由如seq id no.5所示的核苷酸序列作为正义链及由与seq id no.5所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列作为反义链组成的双链rna。
31.一种制备上述基因的dsrna的方法，包括以下步骤：以美洲大蠊卵鞘保水性相关的基因grp的cdna为模板，以干扰引物组为引物进行pcr扩增即得。
32.根据本发明的一些实施方式，所述干扰引物组包括上游引物和下游引物，其中，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示。
33.根据本发明的一些实施方式，所述制备方法具体为：将上述引物组用于扩增靶向沉默grp基因的dsrna靶向序列dna片段，将扩增得到的dna片段克隆到p18t载体，命名为p18t-grp，然后以p18t-grp为模板，设计两端含有t7启动子的引物，进行pcr扩增，得到dsrna靶向序列。
34.根据本发明的一些实施方式，所述两端含有t7启动子的引物的上游引物的核苷酸序列如seq id no.6所示；下游引物核苷酸序列如seq id no.7所示。
35.根据本发明的一些实施方式，所述dsrna靶向序列采用t7ribomax express rnai system转录合成即得。
36.在本发明的第五方面，提出了上述grp抑制剂的应用，所述应用为在降低美洲大蠊卵鞘保水性中的应用。
37.在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备防治美洲大蠊的产品中的应用。
38.在本发明的一些实施方式中，所述应用为制备用于降低美洲大蠊卵的孵化率的产品中的应用。
39.在本发明的第六方面，提出了一种防治美洲大蠊的方法，包括以下步骤：将上述grp抑制剂、dsrna导入到美洲大蠊体内。
40.根据本发明的一些实施方式，所述导入操作通过注射的方式；优选地，所述注射操作为显微注射。
41.根据本发明的一些实施方式，所述导入操作为导入至美洲大蠊成虫的腹腔中。
42.根据本发明的一些实施方式，所述导入操作还可以通过饲喂的方式。
43.根据本发明的一些实施方式，所述导入操作在操作前对美洲大蠊进行co2麻醉。
44.根据本发明的一些实施方式，所述注射操作是从沿腹部从下往上方向的第3至第4腹节处注入。
45.根据本发明的一些实施方式，所述导入操作是在刚羽化后的第四天和第六天分别注射一次。
46.本发明的有益效果在于：本发明提供了一种与美洲大蠊卵鞘保水性相关的基因grp，通过设计合成了靶向沉默美洲大蠊卵鞘保水性相关的基因grp的dsrna序列，将该dsrna导入美洲大蠊体内，能够显著抑制grp基因的表达，进而影响保水率和孵化率，从而实现防治害虫的最终目的，为害虫防治提供了新的分子靶标。
47.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
48.图1为本发明实施例2中rnai表达水平检测结果图；
49.图2为本发明实施例2中卵失水率统计结果图；
50.图3为本发明实施例2中卵的形态的对比结果图。
具体实施方式
51.为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
52.实施例1 dsrna的设计与合成
53.dsrna的设计与合成包括以下步骤：
54.(1)引物设计
55.根据已有的美洲大蠊基因组信息，蛋白质谱鉴定获得grp基因的完整序列(如seq id no.1所示)，利用dsrna设计网站e-rnai(https://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3/)，将美洲大蠊grp基因开放阅读框序列复制粘贴到网站中，通过设计参数筛选得到最佳的dsrna靶向序列，得到靶向沉默美洲大蠊grp基因的dsrna序列(由如seq id no.5所示的核苷酸序列作为正义链及由与seq id no.5所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列作为反义链组成的双链rna)。根据序列seq id no.5所示的核苷酸序列设计引物，正向引物：
56.ggctacgggcttggttatggacttggtctc(seq id no.3)和反向引物：cgtatccgccgtagccgtatccaatagctg(seq id no.4)。
57.美洲大蠊grp基因序列(seq id no.1)具体如下：
58.atgaacggtcaactcgcttgcgcccttcttgttgcggtactatctcaagctagtgccagtggatttggaccattcctcggtggatatggacttggaggatatggacttggtttaggacttaaaggatatggatggggacatggactaggctatggacttggatatggaggatttggactaggatacggaggacttggactagggtatggaggacttggactaggatatggaggatttggactagggtacggaggacttggactaggatatggaggacttggactaggatatggaggatttggattaggatataaaggctttggcctaggatatggaggttatggactaggtctaggacttaaaggctacgggcttggttatggacttggtctcggatatggaggatatggactcggttatggacttggtctaggacttaaaggttatggacttggtcttggatatggactcggttatggactgggtcatggttatggacttggtctaggctatggaggttacggactaggacttggatatggaggttacggacttggactgggttacggacttggtctaggttacggaggatatggactcggctacggaggttttggacacggataccctggagtcggagtgactaaggtgaaatcagtttctgtcggatacccagctattggatacggctacggcggatacggtctcgggtacggcggatatggactcggctacggcggatatggactgggcttcggcggatacgggcttggatatggcctaggtcatggacttggtcttggatatggatggaagtaa。
59.美洲大蠊grp蛋白质序列(seq id no.2)具体如下：
60.mngqlacallvavlsqasasgfgpflggyglggyglglglkgygwghglgyglgyggfglgygglglgygglglgyggfglgygglglgygglglgyggfglgykgfglgyggyglglglkgyglgyglglgyggyglgyglglglkgyglglgyglgyglghgyglglgyggyglglgyggyglglgyglglgyggyglgyggfghgypgvgvtkvksvsvgypaigygyggyglgyggyglgyggyglgfggyglgyglghglglgygwk*。
61.靶向沉默美洲大蠊grp基因的dsrna序列(由seq id no.5所示)，具体如下：
62.ggatacggaggacttggactagggtatggaggacttggactaggatatggaggatttggactagggtacggaggacttggactaggatatggaggacttggactaggatatggaggatttggattaggatataaaggctttggcctaggatatggaggttatggactaggtctaggacttaaaggctacgggcttggttatggacttggtctcggatatggaggatatggactcggttatggacttggtctaggacttaaaggttatggacttggtcttggatatggactcggttatggactgggtcatggttatggacttggtctaggctatggaggttacggactaggacttggatatggaggttacggacttggactgggttacggacttggtctaggttacggaggatatggactcggctacggaggttttggacacggataccctggagtcggagtgactaaggtgaaatcagtttctgtcggatacccagctattggatacggctacggcggatacggtctcgggtacggcggatatggactcggctacggcggatatggactgggcttcggcggatacg。
63.(2)目的片段的克隆与载体的构建
64.使用trizol(lifetechnologies)方法提取美洲大蠊粘液腺总rna，然后使用prime script ii reverse transcriptase(takara bio，shiga，japan)合成cdna。以cdna为模板扩增得到含有靶向序列的dna片段，并将其克隆改到p18t载体(aidlab，china)中，测序验证序列是否存在碱基突变，挑选没有任何突变的克隆用于后续实验，载体命名为p18t-grp。
65.(3)重组载体的转化
66.将构建好的载体连接转化感受态细菌(dh5α)，制作成重组菌株。筛选出阳性克隆，扩大培养后提取重组质粒。
67.(4)合成grp dsrna
68.采用pcr在dsrna靶向序列两侧引入t7启动子，具体方法为用设计两端含有t7启动子的引物，taatacgactcactataggggctacgggcttggttatggacttggtctc(seq id no.6)和taatacgactcactataggcgtatccgccgtagccgtatccaatagctg(seq id no.7)。以p18t-grp载体为模板进行扩增，得到两端含有t7启动子的pcr产物，然后利用t7ribomaxtm express rnai system(promega corporation)来合成双链rna。
69.实施例2 dsrna对grp基因干扰影响
70.为了验证本发明制备的靶向grp基因的dsrna对美洲大蠊卵鞘保水能力的影响，对美洲大蠊行dsrna注射的方式来实现。
71.挑选刚羽化的美洲大蠊进行饲养，分为实验组和对照组(注射无法靶向美洲大蠊任何基因的dsck)，在其羽化后的第四天和第六天将其co2麻醉后，然后使用显微注射方法将靶向grp基因的dsrna注射2μl(500ng/μl)到美洲大蠊腹部内。第十天收集产的卵，卵鞘至于温度37℃，湿度75％，统计失水率和孵化率。其中，实验组和对照组各三个生物学重复，每个重复使用的美洲大蠊为25只。
72.1、dsrna对grp基因干扰效果验证
73.注射dsrna后的48h，解剖美洲大蠊雌性粘液腺，提取总rna，rna反转录得到cdna。利用primer premier5引物设计软件设计qpcr引物。荧光定量pcr检测所用到引物如下所示：actcggctacggcggatat(seq id no.8)和ccaagaccaagtccatgaccta(seq id no.9)。使用sybr green qpcr mix(yisheng，china)进行基因表达定量检测，反应体系如下：2
×
hiefftm qpcrgreen master mix 10μl，forward primer(10μm)1μl，reverse primer(10μm)1μl，cdna 2μl，rnase-free ddh2o 6μl反应程序如下：95℃1min；95℃10sec，60℃20sec，72℃30sec，共40个循环，通过对定量结果进行分析，检测靶基因干扰效果，
74.结果如图1所示，从图1中可以看出，dsrna具有可以显著干扰靶基因grp的表达。(图中“***”代表p《0.001，表明处理组和对照组之间相对表达量有显著差异。
75.2、dsrna靶向沉默grp后卵鞘的保水率的统计
76.dsrna靶向沉默grp基因后雌虫产的卵失水率和卵的形态的结果如图2和图3所示，其中，图2中为实验组和对照组失水率的对比结果图，图3为实验组和对照组卵的形态的对比结果图，从图中可以看出，dsrna靶向沉默grp基因后能够有效影响卵鞘的保水率导致卵鞘干瘪，进而导致蟑螂后代数量显著的减少。
77.基于dsrna技术的害虫防治策略具有专一性，对非靶标生物安全，且无毒无污染，是一种绿色的卫生害虫的生物学防治手段。
78.综上所述，通过dsrna干扰技术靶向沉默grp基因能够有效影响美洲大蠊的卵的保水率使得卵鞘干瘪，进而导致蟑螂后代数量显著的减少，达到防治美洲大蠊的目的。
79.以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。