一种植物乳杆菌sf-l38及其在制备血糖控制产品中的应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌sf-l38及其在制备血糖控制产品中的应用。
背景技术：
2.糖尿病是一种由于机体不能正常释放或利用胰岛素，而使血中葡萄糖(一种单糖)水平不适当升高所导致的一种常见的、多发的、伴随终身的疾病。近年来，国内糖尿病患病率呈逐渐攀升趋势。据调查数据显示：“在我国20岁以上的人群中，男性和女性的糖尿病患病率分别达10.6%和8.8%，总体糖尿病患病率为9.7%，由此，推算出全国糖尿病总患病人数约为9200万人。”2019年中国糖尿病患病人数约为1.16亿人，中国已成为全球糖尿病患病人数最多的国家；与此同时，糖尿病患者数量仍在持续快速增长。预测2040年中国糖尿病患病人群数量将达到1.51亿人。我国胰岛素市场增长速度也超过了全球平均增速。
3.糖尿病的药物治疗分胰岛素治疗、口服降糖西药治疗和中医药治疗，目前已发展到生物技术治疗。专利cn201610629475.6公布了糖尿病治疗产品含有于回肠末端和结肠定位释放的口服定位释放制剂口服定位释放制剂含有营养成分。cn201711432775.6公开了治疗糖尿病药物2-(苯氨基)-4h-苯并[e][1,3]噻嗪-4-酮的合成方法。cn201110375880.7公开了一种薯蓣皂苷在制备预防及治疗糖尿病药物中的应用。cn201110073133.8公开一种用于治疗糖尿病药物中应用的新疆一枝蒿制剂及制备。cn200910114494.5公开了一种通过微生物发酵制备α-葡萄糖苷酶抑制剂，用于糖尿病治疗。综上西药治疗糖尿病价格昂贵，毒副作用大，治标不治本；中成药降糖见效慢，需要时间长。
技术实现要素：
[0004]
针对现有技术西药副作用大、中药见效慢等问题，本发明提供一种植物乳杆菌sf-l38及其在制备血糖控制产品中的应用，可有效抑制人体中多糖转化为单糖，改善血糖指标，具有预防和治疗糖尿病的作用。
[0005]
第一方面，本发明提供一种植物乳杆菌sf-l38，该植物乳杆菌（lactobacillus plantarum）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 23475，保藏日期为2021年9月23日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0006]
第二方面，本发明提供一种植物乳杆菌sf-l38的培养方法，包括将植物乳杆菌sf-l38接种到灭菌的mrs液体培养基中，接种量为1％，在37℃下培养18h，获得植物乳杆菌sf-l38培养液。
[0007]
进一步的，mrs液体培养基包括以下组分：蛋白胨10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，k2hpo4·
7h2o 2.0g，柠檬酸三铵2.0g，葡萄糖20.0g，ch3coona
·
3h2o 5.0g，mgso4·
7h2o 0.2g，mnso4·
4h2o 0.05g，吐温80 1.0ml，琼脂15.0g，蒸馏水1000ml。
[0008]
第三方面，本发明提供一种植物乳杆菌sf-l38的应用，即，植物乳杆菌sf-l38在制备血糖控制产品中的应用。
[0009]
进一步的，血糖控制产品为植物发酵饮品。
[0010]
第四方面，本发明提供一种使用植物乳杆菌sf-l38制备植物发酵饮品的方法，包括如下步骤：（1）将人参、枸杞、茯苓、葛根、黄芪、桑葚、苦瓜、玉竹分别破碎后加水煎煮得提取液，提取液浓缩后喷雾干燥，分别得人参提取物、枸杞提取物、茯苓提取物、葛根提取物、黄芪提取物、桑葚提取物、苦瓜提取物、玉竹提取物；（2）将人参提取物、枸杞提取物、茯苓提取物、葛根提取物、黄芪提取物、桑葚提取物、苦瓜提取物、玉竹提取物与淮山药粉、胡萝卜汁、净化水混合得混合浆料，混合浆料在120℃高压灭菌30min，冷却至40℃，得到灭菌液；（3）将植物乳杆菌sf-l38接种到灭菌的mrs液体培养基中，接种量为1％，在37℃下培养18h，获得植物乳杆菌sf-l38培养液；（4）将植物乳杆菌sf-l38培养液接种到灭菌液中，接种量为1％，在37℃下培养20h，得发酵液；（5）发酵液破壁后添加水蜜桃浓缩汁、菠萝浓缩汁混合，破壁压力为20mpa，巴氏灭菌得植物发酵饮品。
[0011]
进一步的，植物发酵饮品包括如下重量份的原料：净化水50~70份，人参提取物1~2份，枸杞提取物2~5份，茯苓提取物2~5份，葛根提取物1~3份，黄芪提取物3~5份，桑葚提取物1~2份，苦瓜提取物2~6份，玉竹提取物2~3份，淮山药粉2~4份，胡萝卜汁2~7份，水蜜桃浓缩汁4~6份、菠萝浓缩汁3~5份。
[0012]
进一步的，植物发酵饮品包括如下重量份的原料：净化水60份，人参提取物1份，枸杞提取物3份，茯苓提取物2份，葛根提取物2份，黄芪提取物3份，桑葚提取物2份，苦瓜提取物4份，玉竹提取物2份，淮山药粉3份，胡萝卜汁4份，水蜜桃浓缩汁5份、菠萝浓缩汁4份。
[0013]
本发明采用如下各辅料药用作用机理：人参：大补元气、补脾益肺、生津、安神的功效。性味为甘微苦。
[0014]
淮山药：补脾养胃，生津益肺，补肾涩精，清热解毒。
[0015]
枸杞：养肝，滋肾，润肺。
[0016]
茯苓：味甘、淡，性平。归心、肺、脾、肾经。利水渗湿，健脾，宁心。
[0017]
葛根：甘、辛，凉。有解肌退热，透疹，生津止渴，升阳止泻之功。
[0018]
黄芪：补气固表，托毒排脓，利尿，生肌。
[0019]
桑葚：味甘性寒，入心肝、肾经，有滋阴补血作用，并能治阴虚津少、失眠等。
[0020]
苦瓜：具有祛暑涤热，明目，解毒之功效。
[0021]
玉竹：养阴润燥，生津止渴。
[0022]
本发明的有益效果在于，本发明提供的植物乳杆菌sf-l38具有高粘附性、强肠胃适应能力，同时以植物乳杆菌sf-l38为菌种发酵制得发酵饮品，可抑制多糖转化为单糖，改善血糖指标，具有预防和治疗糖尿病的重要功能。
具体实施方式
[0023]
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施
例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
[0024]
下述实施例使用的mrs液体培养基包括以下组分：蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、k2hpo4·
7h2o 2g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、ch3coona
·
3h2o 5g、mgso4·
7h2o 0.2g、mnso4·
4h2o 0.05g、吐温80 1ml、蒸馏水1000ml。
[0025]
下述实施例使用的mrs固体平板培养基包括以下组分：蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、k2hpo4·
7h2o2g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、ch3coona
·
3h2o5g、mgso4·
7h2o0.2g、mnso4·
4h2o 0.05g、吐温80 1ml、琼脂15.0g、蒸馏水1000ml；下述实施例的各物质提取物的制备方法为：将人参，枸杞，茯苓，葛根，黄芪，桑葚，苦瓜，玉竹提洗净后破碎成粗粒，分别用10倍量水煎煮2次，两次煎煮时间为3h、1h，合并两次滤液，静置2h后过滤得提取液，将提取液在真空度-0.08mpa条件下浓缩至1.10（80℃），然后进行喷雾干燥，最后粉碎成80目细粉，即得提取物。
[0026]
下述实施例淮山药粉制备方法为：山药薄片用清水洗净后放入沸水中烫漂8min，捞出山药薄片并用清水漂去粘液，之后将山药薄片烘干、电磨加工成粉，即得淮山药粉。
[0027]
下述实施例胡萝卜汁、水蜜桃浓缩汁的制备方法为：分别将去皮的胡萝卜丁、水蜜桃丁预煮5min后打浆，用卧螺机提取浆液中的汁液，同时用两效真空蒸发器将物料浓缩至40%，高温杀菌，待物料冷却，即可分别制得胡萝卜汁、水蜜桃浓缩汁。
[0028]
下述实施例菠萝浓缩汁的制备方法为：将去皮菠萝榨汁后过滤，去除粗纤维、杂质、其他悬浮物及易产生沉淀的胶粒，菠萝汁脱气后灭菌，待菠萝汁冷却至50℃后加入苯甲酸钠（以菠萝汁计，0.5g/kg），真空浓缩至总糖量（以转化糖计）60%，即得菠萝浓缩汁。
[0029]
实施例1本实施例为植物乳杆菌sf-l38的分离和鉴定1、菌源：酸奶，采集时间为2021年1月，采集地点为青海省西宁市。
[0030]
2、菌株的分离对酸奶样品做十倍梯度稀释，每个梯度取100μl均匀涂布于mrs固体平板培养基上，随后取出置于厌氧罐中，37℃厌氧培养过夜；次日可见平板上长有形态大小各异的菌落，挑取若干乳酸菌的特征菌落作二代划线纯化处理，平板厌氧活化1天，得培养物，随后做菌株鉴定。
[0031]
本发明分离的植物乳杆菌sf-l38具有以下微生物学特征：为圆端直杆菌，通常为0.9~1.2vtm
×
3.0~8.0μm，单个、成对或短链状。通常缺乏鞭毛，但能运动。革兰氏阳性，不生芽孢。兼性厌氧，表面菌落直径约3mm，凸起，呈圆形，表面光滑，细密，色白，偶尔呈浅黄或深黄色。能发酵戊糖或葡萄糖酸盐，终产物中85%以上是乳酸。能产生dl-乳酸，能在葡萄酸盐中生长，并产co2。发酵1分子的核糖或其他的戊糖生成1分子的乳酸和1分子的乙酸。15℃能生长，通常最适生长温度为30～35℃。
[0032]
3、植物乳杆菌sf-l38的鉴定(1)鉴定单位：生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0033]
(2)引物序列27f：5'
‑ꢀ
agagtttgatcmtggctcag
ꢀ‑
3'；
1492r：5'
‑ꢀ
ggttaccttgttacgactt
ꢀ‑
3'。
[0034]
(3)鉴定的序列aagggttaccttgttacgacttcaccctaatcatctgtcccaccttaggcggctggttcctaaaaggttaccccaccgactttgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgagaatggctttaagagattagcttactctcgcgagttcgcaactcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctcaccagagtgcccaacttaatgctggcaactgataataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaccatgcaccacctgtatccatgtccccgaagggaacgtctaatctcttagatttgcatagtatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcagcactgaagggcggaaaccctccaacacttagcattcatcgtttacggtatggactaccagggtatctaatcctgtttgctacccatactttcgagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgcacttcttcggttgagccgaaggctttcacatcagacttaaaaaaccgcctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaaataccgtcaatacctgaacagttactctcagatatgttcttctttaacaacagagttttacgagccgaaacccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagactttcgtccattgtggaagattccctactgctgcctcccgtagagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgattaccctctcagtcggctacgtatcattgccatggtgagccgttaccccaccatctagctatacgccgcgggaccatccaaagtgatagccgaagccatctttcaagctcggacatgcggttccagtgtatgcgtatagcatctgttcagtgtatccccgctctggccagtttcccacgtgtttacttcac。
[0035]
(4)鉴定结果该菌株被鉴定为lactobacillus（乳杆菌属），为lactobacillus plantarum（植物乳杆菌）。
[0036]
实施例2本发明植物乳杆菌sf-l38发酵饮品的制备方法，包括如下步骤：（1）首先将净化水60份，人参提取物1份，淮山药粉3份，枸杞提取物3份，茯苓提取物2份，葛根提取物2份，黄芪提取物3份，桑葚提取物2份，苦瓜提取物4份，玉竹提取物2份，胡萝卜汁4份按配方比例混合，得混合浆料。
[0037]
（2）将步骤（1）制备的混合浆料输送至灭菌容器中，经过120℃高压灭菌30min，然后冷却至40℃，得到灭菌液；（3）将植物乳杆菌sf-l38接种到mrs液体培养基中，接种量为1％，在37℃下培养18h制备接种剂；（4）将步骤（3）制备的植物乳杆菌sf-l38接种剂接种于步骤（2）灭菌液中，接种量为1％，在37℃下培养20h，制备发酵液；（5）待步骤（4）发酵完成后，将制备的发酵液输送至高压喷雾破壁机中，压力设置20mpa，进行破壁处理；（6）将步骤（5）破壁后发酵液与水蜜桃浓缩汁5份、菠萝浓缩汁4份混合调味后，进行巴氏灭菌，得发酵饮品。
[0038]
实施例3本发明植物乳杆菌sf-l38发酵饮品的制备方法，包括如下步骤：（1）首先将净化水50份，人参提取物2份，淮山药粉2份，枸杞提取物2份，茯苓提取物3份，葛根提取物1份，黄芪提取物5份，桑葚提取物2份，苦瓜提取物2份，玉竹提取物3份，胡萝卜汁7份按配方比例混合，得混合浆料；（2）将步骤（1）制备的混合浆料输送至灭菌容器中，经过120℃高压灭菌30min，然后冷却至40℃，得到灭菌液；（3）将植物乳杆菌sf-l38接种到mrs液体培养基中，接种量为1％，在37℃下培养18h制备接种剂；（4）将步骤（3）制备的植物乳杆菌sf-l38接种剂接种于步骤（2）灭菌液中，接种量为1％，在37℃下培养20h，制备发酵液；（5）待步骤（4）发酵完成后，将制备的发酵液输送至高压喷雾破壁机中，压力设置20mpa，进行破壁处理；（6）将步骤（5）破壁发酵液与水蜜桃浓缩汁4份、菠萝浓缩汁3份混合调味后，进行巴氏灭菌，得发酵饮品。
[0039]
实施例4本发明植物乳杆菌sf-l38发酵饮品的制备方法，包括如下步骤：（1）首先将净化水70份，人参提取物1份，淮山药粉4份，枸杞提取物5份，茯苓提取物5份，葛根提取物3份，黄芪提取物4份，桑葚提取物1份，苦瓜提取物6份，玉竹提取物2份，胡萝卜汁2份按配方比例混合，得混合浆料；（2）将步骤（1）制备的混合浆料输送至灭菌容器中，经过120℃高压灭菌30min，然后冷却至40℃，得到灭菌液；（3）将植物乳杆菌sf-l38接种到mrs液体培养基中，接种量为1％，在37℃下培养18h制备接种剂；（4）将步骤（3）制备的植物乳杆菌sf-l38接种剂接种于步骤（2）灭菌液中，接种量为1％，在37℃下培养20h，制备发酵液；（5）待步骤（4）发酵完成后，将制备的发酵液输送至高压喷雾破壁机中，压力设置20mpa，进行破壁处理；（6）将步骤（5）破壁发酵液与水蜜桃浓缩汁6份、菠萝浓缩汁5份混合调味后，进行巴氏灭菌，得发酵饮品。
[0040]
对比例1对比例1与实施例2制备方法不同的是，采用植物乳杆菌jylp-326进行发酵，植物乳杆菌jylp-325购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号cgmcc no.18038，制得发酵制品。
[0041]
对比例2对比例2与实施例2制备方法不同的是，采用植物乳杆菌jylp-375进行发酵，植物乳杆菌jylp-375购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号cgmcc no.18039，制得发酵制品。
[0042]
实施例5 植物乳杆菌sf-l38粘附特性测试
本实验根据实施例1所获得的植物乳杆菌sf-l38，测试其对胞外机制的粘附能力。
[0043]
将植物乳杆菌sf-l38按1％的接种量接种于mrs液体培养基中，37℃培养12～14h，发酵菌液8000r/min离心15分钟，除去上清液，收集沉淀的菌体，将菌体和rpmi-1640细胞培养基重混合，使其浓度达到108cfu/ml。将制备完成的菌悬液加入到24孔平板中，每孔1ml，将24孔细胞培养板在5％co2、95％空气的co2培养箱中37℃培养3小时，吸收出未粘附的菌悬液，用磷酸盐缓冲盐冲洗5次，然后加入含有聚乙二醇辛基苯基醚的磷酸盐缓冲液溶解细胞，加入无菌水溶解。最后进行计数，培养条件为37℃恒温厌氧培养，2-3天后统计活菌数(gb4789.35方法检测)。
[0044]
对比菌株为：jylp-375、jylp-326和bb12，其中bb12为行业内公认的高粘附力双歧杆菌菌种标品，上述菌种均来源于开放的菌种保藏库，能够在市面上购买得到。由表1可以看出，0.2％是较理想指标，结果表明，本发明的植物乳杆菌sf-l38粘附力有明显优势。
[0045]
表1植物乳杆菌sf-l38粘附特性测试结果实施例6 植物乳杆菌sf-l38胃肠道适应性测试本实验根据实施例1所获得的植物乳杆菌sf-l38。
[0046]
(1)模拟胃液的配置：将胃蛋白酶溶于灭菌的生理盐水(0.9％w/v)，调节ph至3.0中，使终浓度为3g/l。以0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用；(2)模拟肠液的配置：将胰蛋白酶溶于灭菌的生理盐水(0.9％w/v，调节ph至8.0)中，使终浓度为1g/l，并加入胆盐使终浓度为0.3％。以0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用；(3)将不同植物乳杆菌（jylp-375、jylp-326和sf-l38）连续活化三代(每次18h)后进行实验。测定连续活化三代的菌株在a600下的od值，通过计算求出od 5所需的菌液量；(4)将od 5的菌液以8000g离心10min，弃上清，重悬于1ml模拟胃液中，37℃培养3h后进行平板活菌计数；(5)取模拟胃液处理后的菌液8000g离心10min，弃上清，重悬于等体积的模拟肠液中，37℃培养4h后进行平板活菌计数。
[0047]
耐受胃肠液后的存活率(％)＝(耐受模拟肠液后菌液中的活菌数/菌液中的原始活菌数)
×
100％。
[0048]
表2植物乳杆菌sf-l38胃肠道适应性测试结果显示，植物乳杆菌sf-l38较其他植物乳杆菌胃肠适应能力强。
[0049]
实施例7 对α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力预防糖尿病功能制品对α-葡萄糖苷酶抑制活性测定：在150μlpbs中加入75μl20mm的4-硝基酚-α-d-吡喃葡葡糖苷（pnpg）溶液及25μl待测样品（分别为实施例2、实施例3、实施例4、对比例1、对比例2制备的发酵制品），将混合物于37℃水浴10min。加入50μl大鼠肠道提取的α-葡萄糖苷酶溶液(0.17u/ml)继续反应10min。加入1ml0.1mna2co3作为反应终止液。并将反应液于405nm处测其吸光值，吸光值与4-硝基酚（pnp）的游离量成正比。反应体系中采用ph6.8的0.1mpbs作为α-葡萄糖苷酶溶液及待测样品的空白对照，采用以下公式计算样品的抑制活性：酶抑制率（%）=[1-(c-d)/(a-b)]
×
100%，其中a为含有α-葡萄糖苷酶溶液但不含样品的测定吸光值；b为不含α-葡萄糖苷酶溶液及待测样品的测定吸光值；c为含有α-葡萄糖苷酶溶液及待测样品的测定吸光值；d为不含α-葡萄糖苷酶溶液但含待测样品的测定吸光值；由表3可知，实施例2-4所制得的植物乳杆菌sf-l38发酵制品α-葡萄糖苷酶活性抑制率均明显高于对比例，且实施例2制备的植物乳杆菌sf-l38发酵制品对α-葡萄糖苷酶活性有抑制作用效果最明显，抑制率达15.6%，表明本发明制得的植物乳杆菌sf-l38发酵制品可改善血糖指标。
[0050]
表3 实施例及对比例制得发酵制品对α-葡萄糖苷酶活性影响实施例8本实施例验证了所制得植物乳杆菌sf-l38发酵制品对糖尿病预防及治疗效果。
[0051]
门诊患者32例，其中男性17例，女性15例，年龄35-60岁。本实施例采用实施例2的植物乳杆菌sf-l38发酵制品，用量为一日三次，每次20ml。15天为一个疗程，服用六个疗程。
[0052]
评定标准：显效：空腹血糖及餐后2小时血糖下降至正常范围；或空腹血糖及餐后2小时血糖值下降超过治疗前的40％；糖化血红蛋白值下降至正常，或下降超过治疗前的30％。
[0053]
好转：空腹血糖及餐后2小时血糖下降超过治疗前的20％，但未达到显效标准；糖化血红蛋白值下降超过治疗前的10％，但未达到显效标准。
[0054]
无效：空腹血糖及餐后2小时血糖无下降，或下降未达到好转标准；糖化血红蛋白值无下降，或下降未达到好转标准。
[0055]
表4 植物乳杆菌sf-l38发酵制品临床治疗效果
由表4可以看出，本发明所制得的植物乳杆菌sf-l38发酵制品对糖尿病具有良好的治疗效果。
[0056]
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。