一种抗BXMAS1嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞及应用

一种抗bxmas1嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞及应用
技术领域
1.本发明属于生物基因领域，具体涉及一种抗bxmas1嵌合抗原受体及其修饰的免疫细胞及应用。


背景技术：

2.嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)介导的t细胞(car-t)疗法被认为是目前最有望攻克恶性血液系统肿瘤的治疗手段之一。car-t疗法是通过基因工程的手段将靶向肿瘤表面抗原的嵌合抗原受体导入患者自体或健康供者来源的t细胞内，从而赋予t细胞以人类白细胞抗原(hla)非依赖性的形式识别和杀伤肿瘤细胞的能力。过继输注的car-t能在患者体内存活相当长的时间并维持免疫记忆功能，从而发挥持久的抗肿瘤效应并行使免疫监视作用，因而被誉为“活体药物”。相比于传统的放、化疗导致的机体免疫功能受损，病情较易复发，以及肿瘤细胞易产生耐药等缺点，car-t疗法的毒副作用相对较小且可控，同时抗肿瘤疗效更持久。
3.多发性骨髓瘤是一种临床常见的严重威胁人类健康的血液系统恶性肿瘤，而b细胞成熟性抗原(bcma)是目前应用最广泛的针对该疾病的car-t疗法的靶标抗原。靶向bcma的car-t疗法在一系列治疗难治复发性多发性骨髓瘤患者的临床实验中取得了令人瞩目的治疗效果，已经被fda批准上市。然而，研究也发现bcma作为多发性骨髓瘤car-t疗法的靶标有一些局限性。首先，一部分多发性骨髓瘤患者肿瘤细胞本身的bcma抗原表达水平就很低，无法被bcma car-t所识别，因而不适用bcma car-t疗法；其次，有很多患者在早期对bcma car-t治疗有一定的反应性，后期却因发生bcma抗原表达下降或者丢失引起的免疫逃逸而导致肿瘤复发，针对这类复发患者需要采用针对其他靶标的car-t治疗。基于这些原因，我们仍然需要探寻靶向其他抗原的car-t疗法以应对患者肿瘤细胞原发性低表达bcma的问题以及bcma抗原丢失引起的抗原逃逸和复发。
4.bxmas1是fc受体样基因家族成员之一，在染色体上定位于1q21，其编码的蛋白质与fcγr1具同源性，胞外有9个免疫球蛋白样结构域，胞内有免疫受体酪氨酸抑制性基序结构域。与bcma相类似，它在正常细胞的表达局限于小部分b细胞和浆细胞表面。bxmas1在多发性骨髓瘤患者的肿瘤细胞表面高度表达，而且在复发难治性患者的肿瘤细胞表面仍然维持高度表达，因而有望成为car-t疗法治疗b细胞恶性肿瘤的一个潜在的分子靶点。已有文献报道靶向bxmas1的双特异性抗体在体外培养的骨髓瘤细胞以及荷瘤小鼠中表现出明显的抗骨髓瘤效应，同时在食蟹猴中的安全性评价显示其具有较好的安全性，仅对正常b细胞和浆细胞有损伤。值得指出的是，抗体类药物的半衰期较短因而无法发挥持续长久的抗肿瘤疗效，相比较而言，car-t能在体内长期存续及扩增从而发挥更持久的抗肿瘤效应，而且目前的技术水平已能有效监视和控制car-t引起的不良反应如细胞因子释放综合征等，因此采用car-t的手段靶向肿瘤细胞表面的bxmas1可能更具有前景。
5.尽管car-t所依赖的抗原识别功能结构域大多来源于特异性靶向靶标抗原的单克隆抗体的scfv(由单克隆抗体的重链可变区vh和轻链可变区vl的编码序列通过linker连接
起来)，然而并不是所有识别靶标抗原的scfv都能用来构建car的表达载体。car只能识别肿瘤细胞膜抗原，因而首先要求所使用的scfv必须能识别肿瘤抗原的胞外结构域。另一方面，并不是所有针对靶标抗原细胞外结构域的scfv都能作为car的抗原识别部分。研究表明有多个与scfv相关的因素(对靶标抗原识别的特异性、亲和力以及所识别的抗原表位与细胞膜之间的距离等)会对car-t细胞的效应功能产生很大的影响，甚至会导致car-t细胞的抗肿瘤效应严重受损。因此，筛选及鉴定出针对特定靶标抗原的适合的scfv对研发出功能完备的car-t细胞同样至关重要。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种能够靶向bxmas1的嵌合抗原受体。
7.本发明的另一目的是提供一种安全具有抗肿瘤效应的抗bxmas1嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
8.本发明的再一目的是提供一种治疗肿瘤的药物。
9.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
10.一种抗bxmas1嵌合抗原受体，其包括bxmas1抗原结合结构域，所述的bxmas1抗原结合结构域具有seq id no.1所示的氨基酸序列或与seq id no.1所示的氨基酸序列有85％以上的同源性的氨基酸序列，所述的氨基酸序列包含未突变或点突变的氨基酸序列。
11.本发明的bxmas1抗原结合结构域为单链抗体scfv。
12.所述的单链抗体scfv的氨基酸序列如seq id no.1所示，或者为与seq id no.1高度相似但包含点突变的氨基酸序列，例如与seq id no.1所示的氨基酸序列有85％、88％、90％、92％、95％、97％或99％的同源性的氨基酸序列。
13.优选地，所述的抗bxmas1嵌合抗原受体还包括信号肽(leader)、铰链区(hinge)、跨膜结构域、共刺激信号传导区和cd3ζ信号传导结构域。
14.本发明中，所述的信号肽为能够指导嵌合抗原受体跨膜分布的信号肽，本领域技术人员可以根据实际需要选择常规的信号肽，所述信号肽可以为任何一个分泌蛋白或者膜蛋白的信号肽。
15.优选地，所述的信号肽为人cd8α分子的信号肽。
16.本发明中，所述的铰链区本领域技术人员可以根据实际情况进行选择。
17.优选地，所述的铰链区为人cd8α分子的铰链区。
18.本发明中，所述的跨膜结构域为人cd28跨膜结构域和/或cd8α跨膜结构域。
19.在一些具体实施方案中，可以通过氨基酸替换来选择或修饰跨膜结构域，本发明优选采用cd28跨膜结构域。
20.优选地，所述的共刺激信号传导区为cd28、cd137/4-1bb、cd27、cd134/ox40、icos信号传导结构域中的任意一种或至少两种的组合。
21.根据一些具体实施方式，所述的抗bxmas1嵌合抗原受体由cd8α信号肽、bxmas1抗原结合结构域、cd8α铰链区、cd28跨膜结构域、cd28信号传导结构域以及cd3ζ信号传导结构域依次串联而成。
22.优选地，所述的抗bxmas1嵌合抗原受体具有seq id no.3所示的氨基酸序列或与seq id no.3所示的氨基酸序列有85％以上的同源性的氨基酸序列，例如与seq id no.3所
示的氨基酸序列有85％、88％、90％、92％、95％、97％或99％的同源性的氨基酸序列，所述的氨基酸序列包含未突变或点突变的氨基酸序列。
23.本发明还提供一种包含编码所述的抗bxmas1嵌合抗原受体的核苷酸序列的慢病毒表达载体。
24.优选地，所述的慢病毒表达载体为pcdh-sffv-ires-egfp。编码所述的抗bxmas1嵌合抗原受体的核苷酸序列克隆在sffv启动子的下游。
25.本发明还提供由所述的慢病毒表达载体包装得到的表达bxmas1 car的慢病毒。
26.优选地，慢病毒包装细胞系采用293t细胞。
27.优选地，所述的抗bxmas1嵌合抗原受体修饰的免疫细胞由含有编码所述的抗bxmas1嵌合抗原受体的核苷酸序列的慢病毒表达质粒转染免疫细胞得到。
28.优选地，bxmas1特异性car表达质粒与辅助质粒pspax2和pmd2.g按4：3：1的质量比采用磷酸钙转染法共转染至293t细胞内。
29.本发明还提供一种由所述的抗bxmas1嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
30.优选地，所述的免疫细胞为自体的、异体的或转基因的细胞。
31.优选地，所述的免疫细胞为t细胞、nk细胞、nkt细胞、b细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或cik细胞。
32.所述的t细胞包括但不限于细胞毒性t细胞、调节性t细胞、记忆性t细胞、记忆性干性t细胞或双特异性t细胞。
33.本发明还提供如所述的抗bxmas1嵌合抗原受体或所述的抗bxmas1嵌合抗原受体修饰的免疫细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
34.本发明还提供一种治疗肿瘤的药物，所述的药物包括所述的抗bxmas1嵌合抗原受体或所述的抗bxmas1嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
35.优选地，所述的肿瘤为b细胞性肿瘤或浆细胞性肿瘤或任何其他表达bxmas1抗原的肿瘤。
36.进一步优选地，所述的肿瘤包括但不限于多发性骨髓瘤，淋巴瘤和白血病。
37.优选地，所述的药物采用静脉注射方式给药。
38.优选地，所述的药物的给药对象为哺乳动物。
39.优选地，所述的药物可以与靶向bcma的car-t细胞和/或靶向cd19的car-t细胞联用。
40.本发明筛选到两个可作为靶向bxmas1的car-t的抗原识别区结构域的scfv片段，这是开发bxmas1 car-t疗法治疗肿瘤的重要前提。
41.本发明中靶向bxmas1的car-t细胞既可以应用于未接受过任何car-t细胞治疗的肿瘤患者，也可以应用于治疗对靶向其他靶标如bcma或cd19的car-t细胞治疗后缺乏反应性或者因发生抗原丢失导致复发的病例，还可以与靶向bcma或cd19的car-t细胞一起联合应用以避免抗原逃逸的发生，因而具有广泛的临床应用前景。
42.本发明与现有技术相比具有如下优势：
43.本发明的抗bxmas1嵌合抗原受体的结构稳定性高，能特异性识别bxmas1表面抗原，携带该嵌合抗原受体的免疫细胞可应用于治疗表达bxmas1抗原的肿瘤，并且具有较好的安全性，为肿瘤治疗提供了更多的选择，具有广泛的临床应用前景。
附图说明
44.图1为本发明的抗bxmas1嵌合抗原受体的模块示意图；
45.图2为两种包含不同bxmas1抗原结合结构域的bxmas1 car-t细胞对bxmas1阳性的多发性骨髓瘤细胞株nci-h929的体外杀伤活性统计图；
46.图3为具有较强体外杀伤活性的bxmas1 car-t#a细胞、阳性对照bcma car-t细胞以及阴性对照mock t细胞在接种nci-h929细胞的荷瘤小鼠体内的抗肿瘤效应统计图；
47.图4为接受bxmas1 car-t#a细胞、阳性对照bcma car-t细胞以及mock t细胞治疗的各组小鼠的皮下部位分离出的肿瘤的照片；
48.图5为流式检测一例多发性骨髓瘤患者肿瘤细胞表面bcma和bxmas1蛋白的表达情况；
49.图6为制备出的患者来源的bxmas1 car-t#a细胞、bcma car-t细胞以及阴性对照mock t细胞对患者自体骨髓瘤细胞的杀伤活性统计图。
具体实施方式
50.下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
51.由于现有用于治疗肿瘤的靶向bcma的car-t疗法存在患者肿瘤细胞原发性低表达bcma的问题以及bcma抗原丢失引起的抗原逃逸和复发等问题，本技术发明人选择肿瘤细胞表面高度表达的bxmas1抗原为靶点，设计靶向bxmas1的car-t细胞。
52.鉴于car-t细胞的效应功能影响因素众多，无法直接判定出某个scfv可否用作car的抗原识别功能域，发明人经大量研究并经实验学手段去测试携带特殊scfv的car-t是否具有抗肿瘤效应，从而筛选出针对bxmas1抗原的可以用作car的抗原识别功能域的scfv并开发了能够靶向bxmas1的嵌合抗原受体，进一步开发了一种安全且具有抗肿瘤效应的抗bxmas1嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
53.根据实施例，所述的抗bxmas1嵌合抗原受体由cd8α信号肽、抗原结合区结构域、cd8α铰链区、cd28跨膜结构域、cd28共刺激信号传导区、cd3ζ信号传导结构域串联而成；所述的抗bxmas1嵌合抗原受体的氨基酸序列如seq id no.3所示或者为与seq id no.3高度类似但同时引入了点突变的氨基酸序列；所述的抗原结合区结构域为单链抗体scfv，所述的单链抗体scfv的氨基酸序列如seq id no.1所示或者为与seq id no.1高度类似但同时引入了点突变的氨基酸序列。
54.根据实施例，所述的靶向bxmas1的car细胞为由所述的抗bxmas1嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
55.根据实施例，所述的治疗肿瘤的药物包括所述的抗bxmas1嵌合抗原受体修饰的免疫细胞。
56.根据实施例，所述的抗bxmas1嵌合抗原受体修饰的免疫细胞表现出抗肿瘤效应且具有很好的安全性。
57.下面结合具体实施实施例进一步阐述本发明的技术方案和技术效果。
58.本发明中具体实施例中，若无特殊说明，所使用的原料、试剂、仪器均是本领域中常用的且均可通过市售获得。
59.实施例1：靶向bxmas1的car表达载体的构建
60.通过全基因合成的方式合成两种具有不同bxmas1抗原结合结构域(对应氨基酸的序列分别为seq id no.1和seq id no.2)的bxmas1特异性car的dna长片段，分别记为片段1和片段2，这两种bxmas1特异性car均由cd8α信号肽(cd8αleader)、bxmas1抗原结合结构域(scfv(bxmas1))、cd8α铰链区(cd8αhinge)、cd28跨膜结构域(cd28tm)、cd28信号传导结构域(cd28intra)以及cd3ζ信号传导结构域序贯连接而成，如图1所示，即cd8αleader-scfv(bxmas1)-cd8αhinge-cd28tm-cd28intra-cd3ζ。其中，片段1编码的car的完整氨基酸序列如seq id no.3所示，片段2编码的car的完整氨基酸序列如seq id no.4所示。
61.将上述片段1和片段2通过本领域常规方法分别克隆到慢病毒表达载体pcdh-sffv-ires-egfp(本实验室构建及保存)的sffv启动子的下游，通过本领域常规方法转化到onestbl3
tm
化学感受态大肠杆菌，挑取克隆并提取质粒后进行测序验证，从而得到两种不同的bxmas1特异性car表达质粒，将包含片段1的质粒标记为质粒1，包含片段2的质粒标记为质粒2。
62.实施例2：表达bxmas1 car的慢病毒包装
63.慢病毒包装细胞系293t细胞在含10％fbs的dmem高糖培养基中贴壁生长，胰蛋白酶消化后接种于10cm细胞培养皿中，37℃5％co2培养条件下，汇合率为80％-90％时进行转染。将实施例1中制得的bxmas1特异性car表达质粒(质粒1和质粒2)以及空载质粒(pcdh-sffv-ires-egfp)分别与辅助质粒pspax2(addgene公司，#12260)和pmd2.g(addgene公司，#12259)按4：3：1的质量比采用磷酸钙转染法共转染至293t细胞内，置于37℃、5％co2培养箱中培养12小时后，换新鲜培养基继续培养48小时后离心收集上清，过滤去除细胞碎片，将得到的病毒上清置于-80℃低温冰箱冻存或者直接用于t细胞的感染。
64.实施例3：bxmas1 car-t细胞的制备
65.用淋巴细胞分离液从正常人外周血中分离得到外周血单个核细胞(pbmcs)。2x 106个pbmcs经抗人cd3抗体和抗人cd28抗体活化2天后得到t细胞，然后加入3ml含有上述新鲜或者解冻的病毒液(moi＝5)的培养基以及终浓度为8μg/ml的聚凝胺(polybrene)后混匀，于32℃，1800rpm离心1小时，然后置入37℃培养箱内培养8小时后换用新鲜培养基继续培养。72小时后用流式分选仪分别分选出gfp阳性的空载慢病毒感染t细胞(mock-t)和两种bxmas1 car-t细胞(感染质粒1病毒所得到的car-t记为bxmas1 car-t#a；感染质粒2病毒所得到的car-t记为bxmas1 car-t#b)，通过本领域常规方法扩增后用于功能性测试。
66.实施例4：bxmas1 car-t细胞在体外对肿瘤细胞的杀伤检测
67.使用慢病毒感染的方式将萤火虫荧光素酶导入高表达bxmas1的骨髓瘤细胞株nci-h929，所获得的h929-ffl细胞作为靶细胞；以本发明制备的bxmas1 car-t#a、bxmas1 car-t#b以及mock-t细胞作为效应细胞进行杀伤活性测定。按照不同的效应细胞与靶细胞数目比(2：1、1:1、0.5:1和0.25:1)接种于96孔板中，37℃5％co2培养6小时后，裂解混合培养的细胞，加入萤火虫荧光素酶的底物读取发光值，依据每组中发光值的读数同靶细胞单独培养对照组的读数比较计算剩余的活细胞比例从而计算出所杀伤的靶细胞的比例，即体
外杀伤活性(specific lysis，％)，两种包含不同bxmas1抗原结合结构域的bxmas1car-t细胞对bxmas1阳性的多发性骨髓瘤细胞株nci-h929的体外杀伤活性统计结果见图2。
68.如图2所示，在不同的效应细胞/靶细胞比例(e/t)情况下，与mock t细胞相比，bxmas1car-t#a细胞和bxmas1 car-t#b细胞均对h929-ffl细胞表现出显著增强的体外杀伤效应，且bxmas1 car-t#a细胞的杀伤效应明显优于bxmas1 car-t#b细胞；这说明本发明成功制备出能在体外有效杀伤bxmas1阳性肿瘤细胞的两种bxmas1 car-t细胞，并以第一种即bxmas1 car-t#a细胞的杀伤效应更强，进一步将其用于体内抗肿瘤效应的测试。
69.实施例5：bxmas1 car-t细胞在荷瘤小鼠体内的抗肿瘤效应
70.将nog免疫缺陷小鼠置于动物房饲养(室温23
±
2℃，湿度50％
±
10％)，在第0天收集处于对数生长期的h929细胞5
×
106个重悬于100μl的磷酸盐缓冲液中，以微量注射器注入小鼠背部的皮下组织。每两天以游标卡尺测量一次肿瘤的长径l和短径w，按公式v＝lw2/2计算出肿瘤的体积。待7天后小鼠皮下出现体积约为80mm3的瘤块时将小鼠随机分为三组，每组6只小鼠：a组为实施例3制备的转入空载体的mock t细胞治疗组，b组为实施例3制备的bxmas1 car-t#a细胞治疗组，c组为同步制备的作为阳性对照组的包含目前临床试验广泛采用的bcma car序列(其中bcma scfv来源于c11d5.3抗体)的bcma car-t细胞治疗组。分别在第7天和第9天经尾静脉途径注射5x106个mock t细胞治疗组(a组)、bxmas1 car-t#a细胞治疗组(b组)以及bcma car-t细胞治疗组(c组)进行治疗性处理。在第二次注射car-t细胞之后每2天以游标卡尺测量一次肿瘤的长径l和短径w，计算出肿瘤的体积后绘制肿瘤生长曲线。由肿瘤生长曲线结果(图3)可知：a组小鼠随着时间的推移皮下肿瘤逐渐增大，与a组相比，b组和c组中小鼠的肿瘤生长速度均明显减缓，但同时b组和c组间的差异无统计学意义。
71.在第一次注射car-t细胞14天时处死小鼠后将小鼠的皮下肿瘤解剖出来进行拍照，各组中小鼠的肿瘤照片见图4，其中
“×”
表示其中一只小鼠未剖出肿瘤。图4显示bxmas1car-t#a细胞治疗组(b组)中小鼠的肿瘤体积明显小于mock t细胞治疗组(a组)小鼠的肿瘤，bcma car-t细胞治疗组(c组)中大部分小鼠的肿瘤体积比mock t细胞治疗组(a组)小鼠的肿瘤小，部分小鼠的肿瘤体积和mock t细胞治疗组(a组)小鼠的肿瘤没有明显的差异。这说明bxmas1 car-t#a细胞与阳性对照bcma car-t细胞在荷瘤小鼠体内均能够发挥抗骨髓瘤效应，而bxmas1 car-t#a细胞的抗骨髓瘤效果略微优于阳性对照bcma car-t细胞。
72.实施例6：骨髓瘤患者来源的bxmas1 car-t细胞在体外对bcma-bsmax1
+
自体肿瘤细胞的杀伤检测
73.已有文献报道部分患者骨髓瘤细胞表面不表达bcma，在临床上发现一例骨髓瘤患者的骨髓单个核细胞中的肿瘤细胞表面不表达bcma但高表达bsmax1(bcma-bsmax1
+
自体肿瘤)，如图5所示。通过美天旎公司的cd138 microbeads分选出肿瘤细胞，并用eflour670荧光染料标记。参照上述方法从患者pbmcs中扩增出t细胞并分别制备出bxmas1car-t#a，bcma car-t以及mock t细胞作为效应细胞进行杀伤活性测定。按照效应细胞与靶细胞数目比5：1接种于96孔板中，设单独肿瘤细胞培养组，37℃5％co2培养6小时后，加入123counting beads计数微球(thermo fisher公司)，依据共培养组中剩余的活细胞数目以及单独细胞培养组的数目，计算出所杀伤的靶细胞的比例，即体外杀伤活性(specific lysis，％)。如图6所示，制备出的患者来源的bcma car-t细胞完全无法杀伤bcma阴性的自体骨髓瘤细胞，而
制备出的患者来源的bxmas1 car-t#a细胞则能显著杀伤这些耐受性细胞。
74.以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。