一种腺苷水解酶酶活性的检测方法与流程

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1.本发明涉及一种酶活性的检测方法，特别是涉及一种腺苷水解酶酶活性的检测方法。


背景技术：

2.腺苷，是由腺嘌呤的n-9与d-核糖的c-1通过β糖苷键连接而成的化合物，化学式为c
10h13
n5o4,其磷酸酯为腺苷酸，腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其他系统及组织均有生理作用，腺苷是用于合成三磷酸腺苷、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。
3.腺嘌呤，化学名为6-氨基嘌呤，化学式为c5h5n5，是核酸的组成成分，参与遗传物质的合成，是很多医药原料及中间体，主要用于生产维生素b4、植物激素6-苄基腺嘌呤、腺嘌呤核苷、抗乙肝药物阿德福韦酯及泰诺福韦酯等，其磷酸盐能促进白细胞增生，使白细胞数目增加，用于防治各种原因引起的白细胞减少症，特别是用于肿瘤化学治疗时引起的白细胞减少症，也用于急性粒细胞减少症。目前，生产腺嘌呤的方法主要有化学合成法、天然原料提取法和微生物发酵法以及酶法等。其中酶法生产腺嘌呤是以腺苷为底物，在腺苷水解酶的作用下生成腺嘌呤和d核糖，为了使酶反应更加彻底，加酶量的控制非常重要，因此需要准确的测定腺苷水解酶的酶活，准确的确定加酶量，在保证底物全部转化的同时，酶液恰好全部表达，因此酶活的测定具有重要的意义。
4.酶活性的检测方法有很多种，比如比色法、试剂盒法、纳米颗粒检测法等，但目前还没有关于腺苷水解酶酶活性检测方法的相关报道。
5.同时，比色法、试剂盒法、纳米颗粒检测法不同程度的存在检测结果准确度不高、污染环境等问题。如：专利cn200810220513.8公开木聚糖酶酶活力的检测，小麦在酶的作用下生成还原糖，以3，5二硝基水杨酸为显色剂，采用分光度计在固定的波长下测定吸光值，进而测定酶活力。该方法虽然简单，但准确度低，因为显色剂3，5二硝基水杨酸易受溶液的颜色影响，使结果偏高。同时显色剂配制的过程中需要加热，苯酚有毒，不但对身体有害，同时污染环境。
6.专利cn201110163453.2公开了一种将cd-via族纳米颗粒检测淀粉酶活性的方法，第一步，合成淀粉酶稳定的cd-via族纳米颗粒；第二步，离心纳米颗粒，向沉淀物中加入去离子水，超声分散获得产品；第三步，将已知不同活性的淀粉酶样品、磷酸缓冲液和去离子水混合，向其中加入第二步产品后立即开始计时，记录混合液中出现浑浊时一一对应的时间。以酶活性倒数为横坐标、该时间为纵坐标作图，采用线性拟合获得校准关系式；第四步：对活性未知的淀粉酶样品按第三步操作，记录出现浑浊时所需的时间。将此时间带入第三步校准关系式，计算出未知的酶活。虽然此方法快速，成本低，但准确度不高。
7.专利cn201711346017.2公开了α-酮戊二酸依赖型酶的酶活性检测试剂盒及其应用，其利用试剂盒来检测α-酮戊二酸依赖型酶的酶活，试剂盒包括还原型辅酶ii(nadph)或
者还原型辅酶i(nadh)中的一种，异柠檬酸脱氢酶idh突变体蛋白和缓冲盐，idh突变体蛋白是指idh特定氨基酸突变后所获得的具有催化α-酮戊二酸新功能的idh突变体蛋白。该方法操作简便，但准确度不高。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于利用酶的特异性、专一性，提供一种快速、准确检测腺苷水解酶酶活性的方法。
9.本发明由如下技术方案实施：一种腺苷水解酶酶活性的检测方法，其包括如下步骤：(1)确定腺苷在腺苷水解酶的作用下发生水解反应的终止时间；(2)计算腺苷水解酶的酶活性；其中，
10.(1)确定腺苷在腺苷水解酶的作用下发生水解反应的终止时间：将一定量腺苷底物加热至水解反应温度后，将一定量的腺苷水解酶加入腺苷底物中，在水解反应温度下，腺苷水解生成腺嘌呤和d-核糖，反应过程中多次取样，利用液相色谱法检测反应过程中腺苷底物中腺苷的浓度，并记录每次取样时的反应时间，当检测腺苷底物中腺苷的浓度不再下降时，对应取样时的反应时间即为反应终止时间；
11.(2)计算腺苷水解酶的酶活性：利用参与水解反应的腺苷的质量、反应终止时间和腺苷水解酶的加入体积计算腺苷水解酶的酶活性。
12.进一步的，所述步骤(1)中，水解反应温度为30℃-40℃。
13.进一步的，所述步骤(1)中，所述腺苷底物按如下方法制备得到：称取0.9g腺苷纯品加水溶解，定容100ml，调ph至6.5；所述腺苷水解酶的酶活性为30～50u/ml；所述腺苷底物为10ml，所述腺苷水解酶200ul，反应终止时间为20min，水解反应温度为37℃。
14.进一步的，所述步骤(2)腺苷水解酶的酶活性由式(1)计算得到：
[0015][0016]
式(1)中，m
前
表示水解反应前腺苷的质量，单位g；m
后
表示水解反应结束后腺苷的质量，单位g；m
腺苷
表示腺苷的摩尔质量；v
酶ml
表示酶液的体积；t
反应
表示反应终止时间，单位min。
[0017]
进一步的，水解反应前腺苷的质量和水解反应结束后腺苷的质量均利用液相色谱法检测并计算得到。
[0018]
本发明的优点：本发明将腺苷水解酶在适宜的条件下，将腺苷水解成腺嘌呤和d-核糖，然后采用液相色谱法检测剩余腺苷的含量，腺苷的减少量，即为腺苷水解酶在单位时间内催化反应的量。此方法测定腺苷水解酶的酶活性，结果准确，操作简便，及时、高效，不污染环境，适合工业化大生产检测。
[0019]
利用本发明方法能够准确的检测酶活性，进而在利用腺苷水解酶将腺苷水解成腺嘌呤和d-核糖的过程中，能够更加精准的确定腺苷水解酶的添加量，即能够使腺苷水解酶酶活性充分利用，又能够保证腺苷水解完全，避免酶液添加过量或腺苷水解不完全造成的浪费，提高反应效率，降低原料成本。
具体实施方式：
[0020]
下面将结合具体实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述
的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0021]
本发明的目的是建立一种快速检测腺苷水解酶酶活的检测方法，确立水解酶最佳反应体系，利用酶的专一性、特异性，将腺苷水解为腺嘌呤及d-核糖，利用液相色谱法测定腺苷含量，进而计算酶活性，具体实施步骤如下：
[0022]
1、酶反应体系建立
[0023]
1.1、酶活定义：酶催化一定化学反应的能力，即酶促转化速率。可以用单位时间内、单位体积酶的作用下，底物的减少量或产物的增加量来表示。在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物所需的酶量为一个活力单位(u)。
[0024]
1.2、实验原理：腺苷水解酶能够水解腺苷底物，在最适宜的条件下生成腺嘌呤。
[0025][0026]
1.3、实验材料
[0027]
药材：腺苷标准品，腺苷纯品，盐酸
[0028]
器材：液相色谱1200、天平、ph计、水浴锅等。
[0029]
1.4、实验步骤
[0030]
1.4.1腺苷底物的制备方法：称取0.9g腺苷纯品加水溶解，定容100ml，若不溶可加热溶解，调ph至6.5，待用。
[0031]
1.4.2制备酶液：购买市售的腺苷水解酶，产品说明中标注其酶活性为3000～5000u/ml，将其稀释100倍，使酶活性为30～50u/ml即：精确吸取1ml酶液于100ml容量瓶中，用纯水定容100ml，摇匀待用。
[0032]
1.4.3操作步骤
[0033]
试验组样品：准确吸取腺苷底物10ml于试管中，放入37℃水浴锅中预热至腺苷底物温度达到37℃，准确吸取200ul酶液于试管中，迅速混匀，恒温37℃，反应20min，冷却后稀释25倍，制备得到试验组样品。(此操作要迅速，吸样量要准确，时间要严格控制)。
[0034]
2、液相色谱法检测反应前和反应后腺苷底物中腺苷含量
[0035]
2.1色谱条件
[0036]
流动相：称量2.5g磷酸二氢钾，加入1700ml纯净水，加300ml甲醇，混合后用0.45微米过滤膜过滤，超声20分钟，备用。
[0037]
色谱柱：c18柱150mm*4.6mm，5um或250mm*4.6mm，5um，流速：0.8ml/min，波长：紫外检测器波长260nm，进样量10ul。
[0038]
2.2制作利用液相色谱法检测腺苷浓度的标准曲线
[0039]
精确称取腺苷标准品0.0100g定容10ml，摇匀，分别配制成不同浓度的样品：0.1g/l、0.2g/l、0.4g/l、0.6g/l、0.8g/l、1.0g/l，并利用液相色谱法分别检测各浓度样品得到对应不同浓度的峰面积，然后用浓度和峰面积制作标准曲线，标准曲线的线性较好r2＝1.0000。
[0040]
2.3分别检测并计算反应前和反应后腺苷底物中所含腺苷质量
[0041]
将制备得到的试验组样品上机检测，将峰面积带入标准曲线，得到反应后腺苷底物的浓度，进而计算出反应后腺苷底物中腺苷的质量。
[0042]
将反应前腺苷底物上机检测，将峰面积带入标准曲线，得到反应前腺苷底物的浓度，进而计算出反应前腺苷底物中腺苷的质量。
[0043]
2.4计算腺苷水解酶酶活力
[0044]
酶解前后腺苷底物中所含腺苷质量的差值即为酶分解消耗的腺苷量，将水解反应前腺苷的质量、水解反应后腺苷的质量、腺苷水解酶体积以及反应终止时间带入式(1)中，计算腺苷水解酶酶活力：
[0045][0046]
式(1)中，m
前
表示水解反应前腺苷的质量，单位g；m
后
表示水解反应结束后腺苷的质量，单位g；m
腺苷
表示腺苷的摩尔质量；v
酶ml
表示酶液的体积；t
反应
表示反应终止时间，单位min。
[0047]
通过上述操作步骤检测计算腺苷水解酶酶活性，上述实验重复进行3次，每次对试验组样品分别平行5次测定，rsd在1.0％以内，稳定性较好。具体结果如下表：
[0048][0049][0050]
备注：水解反应前腺苷的质量为：10ml腺苷底物采用液相色谱检测得到腺苷底物的浓度，然后用腺苷底物的浓度乘以体系的体积10ml，得到水解反应前腺苷的质量；水解反应后腺苷的质量为：加酶反应结束后，采用液相色谱检测得到剩余腺苷的浓度，然后用剩余腺苷的浓度乘以体系的体积10.2ml(10ml底物+0.2ml酶液)，得到水解反应前腺苷的质量。
[0051]
2.5腺苷水解酶酶活性检测结果准确性验证实验：
[0052]
为验证1.4.3中在反应20min时，200ul酶液是否完全表达，本实验将反应时间延长至30min，腺苷底物取20ml，具体实验步骤如下：
[0053]
准确吸取腺苷底物20ml于试管中，放入37℃水浴锅中预热至腺苷底物温度达到37
℃，准确吸取200ul酶液于试管中，迅速混匀，恒温37℃，反应30min，冷却后稀释25倍，制备得到待测样品。(此操作要迅速，吸样量要准确，时间要严格控制)。
[0054]
将制备得到的待测样品上机检测，将峰面积带入标准曲线，得到反应后腺苷底物的浓度为6.3317g/l，进而计算出反应后腺苷底物中腺苷的质量为0.1279g。
[0055]
将反应前腺苷底物上机检测，将峰面积带入标准曲线，得到反应前腺苷底物的浓度为8.99g/l，进而计算出反应前腺苷底物中腺苷的质量为0.1798g。
[0056]
计算反应前后腺苷的减少量为0.0519g。
[0057]
将2.4中重复进行3次检测到水解反应前腺苷的质量与水解反应后腺苷的质量作差，并计算其平均值为0.0519g。
[0058]
由上述实验结果可以看出，反应时间延长至30min，腺苷底物取20ml，反应前后腺苷的减少量为0.0519g，与反应时间为20min，腺苷底物取10ml时腺苷的减少量比较，相差为0.00g，证明反应时间为20min，酶液基本完全表达。
[0059]
为验证1.4.3中，200ul酶液是否在反应20min之前即已完全表达，本实验将反应时间缩短至19min，腺苷底物取10ml，具体实验步骤如下：
[0060]
准确吸取腺苷底物10ml于试管中，放入37℃水浴锅中预热至腺苷底物温度达到37℃，准确吸取200ul酶液于试管中，迅速混匀，恒温37℃，反应19min，冷却后稀释25倍，制备得到待测样品。(此操作要迅速，吸样量要准确，时间要严格控制)。
[0061]
将制备得到的待测样品上机检测，将峰面积带入标准曲线，得到反应后腺苷底物的浓度为3.9804g/l，进而计算出反应后腺苷底物中腺苷的质量为0.0406g。
[0062]
将反应前腺苷底物上机检测，将峰面积带入标准曲线，得到反应前腺苷底物的浓度为8.99g/l，进而计算出反应前腺苷底物中腺苷的质量为0.0899g。
[0063]
计算反应前后腺苷的减少量为0.0493g。
[0064]
将2.4中重复进行3次检测到水解反应前腺苷的质量与水解反应后腺苷的质量作差，并计算其平均值为0.0519g。
[0065]
由上述实验结果可以看出，反应时间缩短至19min，反应前后腺苷的减少量为0.0493g，与反应时间为20min时腺苷的减少量比较，相差为0.0026g，证明反应时间为19min，酶液尚未完全表达。
[0066]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。