技术特征：
1.一种同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片，其特征在于：该基因芯片用于同时检测新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型，所述基因芯片包括设置于载体上的若干个相同的探针阵列，每个探针阵列分别包含多个片基质控探针、多个阳性对照探针、多个甲型流感病毒特异性寡核苷酸探针、多个乙型流感病毒特异性寡核苷酸探针、多个腺病毒特异性寡核苷酸探针、多个呼吸道合胞病毒特异性寡核苷酸探针、多个人偏肺病毒特异性寡核苷酸探针、多个内标探针1、多个新型冠状病毒orf1ab基因特异性寡核苷酸探针2、多个新型冠状病毒n基因特异性寡核苷酸探针、多个副流感病毒1型特异性寡核苷酸探针、多个副流感病毒2型特异性寡核苷酸探针、多个副流感病毒3型特异性寡核苷酸探针、多个内标探针2、多个阴性对照探针、多个空白对照探针。2.根据权利要求1所述的同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片，其特征在于：所述载体为醛基化修饰的玻璃片、硅片、聚苯乙稀基片、尼龙基片中的一种。3.一种如权利要求1所述的同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、获取新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型共九种病原体基因序列，在九种病原体基因序列的保守位置设计特异性寡核苷酸探针及特异性引物，每条探针的3’端加入12个碱基t且3’末端t用氨基修饰作为连接臂，以使其能固定在载体上；片基质控探针为20t序列，片基质控探针3’末端t进行nh2修饰，5’端同时标记生物素bio标记；阴性对照探针为与呼吸道病原体无关的植物基因序列，用来指示特异性；s2、将合成后的特异性寡核苷酸探针用去离子水稀释成100μm，分别取10μl探针溶液，和10μl芯片点样液混匀，使探针点样终浓度为50μm，装于384孔板，将芯片表面贴上10样品孔阵列膜，用点样仪将特异性寡核苷酸探针点制在载体上形成探针阵列，每个探针的点样量均为3nl，点样过程中保持一定湿度，点样完成后将芯片置于干燥器中避光常温静置48h，点制好的芯片常温干燥保存，即得同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片。4.根据权利要求3所述的同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片的制备方法，其特征在于：所述步骤s1中设计10条特异性寡核苷酸探针及8对引物，特异性寡核苷酸探针长度为31-44nt，引物长度为18-27nt。5.一种如权利要求1所述的同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，提取呼吸道病毒核酸；步骤二，多重不对称pcr扩增：扩增使用pcr试剂将整个扩增体系分为a、b两管，a管包括甲型流感病毒，乙型流感病毒，呼吸道合胞病毒，人偏肺病毒，内标1；b管包括新型冠状病毒orf1ab基因，新型冠状病毒n基因，腺病毒，副流感病毒，内标2；扩增按以下循环参数进行扩增：50℃反转录20min，95℃预变性3min，95℃20s、60℃40s共40个循环，72℃延伸5min，4℃保存或进行下一步实验；步骤三，芯片杂交：将基因芯片分别置0.2％sds和去离子水中清洗30s，离心干燥；将步骤二得到的扩增产物在98℃变性5min后立即置于冰浴中5min，取变性的a管产物2.5μl和b管产物2.5μl与5μl杂交液混匀，使用加样器加于芯片加样孔使其均匀覆盖于阵列表面，将
基因芯片放入杂交盒内在45℃杂交1h；步骤四，杂交后清洗基因芯片：基因芯片杂交完成后，从杂交盒中取出芯片，并立即依次在洗液1
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ssc+0.2％sds、0.2
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ssc和0.1
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ssc中各清洗30s，最后将基因芯片表面液体离心干燥；步骤五，样品标记：向芯片加入10μl标记液，用移液器涂匀后将芯片放回杂交盒中置37℃水浴中反应25min，取出芯片以pbst清洗20s，离心干燥；步骤六，样品标记：向芯片加入10μl底物液，用移液器涂匀后将芯片放回杂交盒中置37℃水浴中反应25min，取出芯片以pbst清洗20s，离心干燥；步骤七，样品标记：向芯片加入10μl纳米颗粒，用移液器涂匀后将芯片放回杂交盒中置37℃水浴中反应25min，取出芯片以pbst清洗20s，离心干燥；步骤八，成像：向芯片反应区加入1:1混合的显色液a和b组成的混合溶液30μl，用移液器涂匀后避光反应约5分钟，用纯净水冲洗终止显色反应，晾干后于可视化芯片成像仪上扫描成像；步骤九，数据分析：成像结束后使用分析软件进行芯片探针信号分析，每条探针的信号取其三个重复点的平均值，根据探针cutoff值，探针信号值>该探针cutoff值的判读为该探针信号阳性。6.根据权利要求5所述的同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片的使用方法，其特征在于：所述步骤二中pcr扩增使用的反向引物5’端修饰分子为cy3、cy5、生物素bio中的一种。7.根据权利要求5所述的同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片的使用方法，其特征在于：所述步骤三中使用的杂交液组分为8
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ssc，0.6％sds，10％甲酰胺，10
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denhardt。8.根据权利要求1所述的同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片的使用方法，其特征在于，所述步骤八中，显色试剂a液是浓度为1-5mg/ml的醋酸银，显色试剂b是浓度为5-20mg/ml的氢醌。
技术总结
本发明公开了一种同时检测九种呼吸道病原体的基因芯片及制备和使用方法，本发明建立了一种基于酪酰胺信号放大技术、可视化成像法的基因芯片，可同时甄别九种重要的呼吸道病原体，包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、副流感病毒1型、副流感病毒2型、副流感病毒3型，该基因芯片具有快速、准确、高通量、特异性高的优势，可为呼吸道病毒感染的临床诊断及流行病学调查提供一种新的检测手段，本发明的基因芯片可以对九种不同的呼吸道病原体进行准确甄别，特异性良好，本发明芯片对九种呼吸道病原体的检测灵敏度能达到1000copies/mL。体的检测灵敏度能达到1000copies/mL。体的检测灵敏度能达到1000copies/mL。
技术研发人员：刘琪琦 周喆 张力 豆峰娜 曹鹏程 丁艳磊 赵昶旭
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：2022.04.08
技术公布日：2022/7/29