冠状病毒M蛋白胞外域多肽及其应用

冠状病毒m蛋白胞外域多肽及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，特别涉及冠状病毒m蛋白胞外域多肽及其应用。


背景技术：

2.人类冠状病毒(hcovs)，例如hcov-229e和hcov-oc43，长期以来一直在人群中传播，它们通常引起轻度呼吸道感染，并伴有普通感冒症状。但在最近20年间，人群中出现的sars-cov、mers-cov以及sars-cov-2却具备高传染性和高致病性。相关数据统计，sars-cov的全球致死率达到10％，mers-cov的全球致死率达到35％，而sars-cov-2仍在全球范围内大规模传播，已导致数百万人死亡。新冠病毒的爆发对人类健康和世界经济的发展造成了持续威胁，未来的疫情发展方向仍不明朗。
3.冠状病毒是一个高度多样化的包膜病毒家族，它包含非分段的正义单链rna基因组，主要宿主为脊椎动物。冠状病毒属于套式病毒目(nidovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)、冠状病毒属(coronavirus)，有α、β、γ、δ四个亚属，其中sras-cov、mers-cov和sars-cov-2被归类为β亚属，sars-cov-2与sars-cov具有约79％的核苷酸序列同源性，与mers-cov具有约50％的同源性。冠状病毒主要由四种结构蛋白组成：s蛋白、m蛋白、包膜蛋白(envelope，e)、核衣壳(nucleocapsid，n)蛋白，少数病毒还包含血凝素酯酶(hemagglutinin-esterase，he)
4.s蛋白在病毒附着、进入和诱导中和抗体中起着关键作用，并具有较强的免疫原性，这让其广泛用作疫苗开发的靶点。然而s蛋白是一种高度糖基化的同源三聚体蛋白，冠状病毒可以通过糖基化屏蔽其多肽表位，逃避免疫系统监视。此外，冠状病毒在传播过程中极易突变导致s抗原表位发生漂变，有利于增强病毒的传染性、致病性和免疫逃逸。在最新的一项研究中显示，接种过两针辉瑞bnt162b2疫苗的志愿者血清中和omicron突变株的效力已经下降到了d614g野生株的1/41。多项临床研究也显示，接种疫苗者的血浆针对α-突变株、β-突变株、γ-突变株以及δ-突变株的中和滴度也有不同程度的下降。因此针对冠状病毒更加保守的结构蛋白设计广谱免疫原将有潜力增强现有疫苗保护效果。
5.n蛋白位于病毒包膜内难以被抗体触及，但由于其氨基酸序列高度保守的特点，n蛋白常用来研究t细胞免疫应答。e蛋白具有较小的结构，目前基于e蛋白免疫学功能的研究较少。m蛋白是一种在冠状病毒脂质膜上分布拷贝数最多的结构蛋白，它可改变自身构型以调整膜的曲率，促进病毒包膜的形成，并与其他三种结构蛋白相互作用进行病毒颗粒的组装。新冠病毒与sars-cov的m蛋白氨基酸序列具有高度的同源性。我们使用开源预测平台alphafold deepmind预测和分析冠状病毒m蛋白结构，结果表明冠状病毒m蛋白结构与葡萄糖转运蛋白semisweet的结构相似，具有三个跨膜螺旋结构域，并包含两个胞外域(预测1-20aa左右的n端胞外域，第二次和第三次跨膜区之间暴露的4个氨基酸残基)及两个胞内域。虽然有学者借助生物信息学工具预测到了sars-cov-2 m蛋白n端胞外域含有b细胞表位，但没有相关实验数据支撑其预测表位的准确性。有学者曾在2005年鉴定出sars-cov病毒m蛋白n端胞外域包含人b细胞表位，并且由n端1-31aa构成的多肽半抗原能够在小鼠和家兔模
型中诱导高滴度的血清抗体，但未验证这些血清抗体是否有抗病毒作用。近期几个研究小组在新冠感染患者的血清中检测到了针对新冠m蛋白n端胞外域的特异性抗体反应，表明m蛋白胞外域包含人b细胞表位，但缺少对其免疫原性的研究。
6.总的来说，冠状病毒m蛋白胞外域是一种有潜力的广谱疫苗免疫原设计靶点，但目前为止尚未见到优化的m多肽用于临床检测、疫苗研发、抗病毒药物研发等相关报道。


技术实现要素：

7.本发明提供了冠状病毒m蛋白胞外域多肽及其应用，其目的是为了解决现有技术中上述问题。
8.有鉴于此，本发明提供了冠状病毒m蛋白胞外域多肽，所述多肽的氨基酸序列如表1中seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5所示；或如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5经过一个或多个氨基酸残基取代、缺失、添加而形成。
9.本发明基于比对的冠状病毒m蛋白胞外域多肽氨基酸序列，分析其在不同冠状病毒中的保守性，设计并合成了五种m蛋白胞外域多肽氨基酸序列如表1所示(或详见于多肽序列表中)，或由其中的氨基酸序列经过修饰例如经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸序列组成，或者具有与表1中多肽相同或者相似功能的多肽或者蛋白质分子经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
10.表1冠状病毒m蛋白胞外域多肽编号及氨基酸序列
[0011][0012]
基于冠状病毒m蛋白较为保守的特点，借助alphafold蛋白质结构预测工具，生成了sars-cov-2 m蛋白的3d结构模型如图1所示，将预测模型与uniprot数据库中sars-cov-2 m蛋白信息进行比对，推断出位于m蛋白1-19aa左右的n端氨基酸残基为其胞外域序列，相同方法推断了sars-cov和mers-cov的m蛋白胞外域在1-18aa左右。
[0013]
优选地，所述多肽序列，可以通过任何已有的体外多肽合成设备和不同技术原理人工合成，获得方法主要有以下步骤，包括多肽的合成，纯化以及最后产品的收集。
[0014]
冠状病毒m蛋白胞外域多肽序列，可应用于制备sars-cov-2诊断试剂、广谱抗冠状病毒疫苗以及抗冠状病毒药物方面。
[0015]
本发明提供了一种用于检测临床血清样品中sars-cov-2 m蛋白抗体的试剂盒，所述试剂盒以表1所述多肽中的一种或者多种为检测抗原。
[0016]
优选地，所述试剂盒为elisa(酶联免疫吸附)检测试剂盒，包含预包被表1所述多肽中的一种或者多种的固相载体，所述固相载体优选为酶标板。
[0017]
优选地，所述试剂盒还包含以下试剂：酶标抗体、10
×
洗涤液、阳性对照、阴性对照、显色底物和终止液。
[0018]
elisa检测方法是利用抗原多肽与待测溶液中的sars-cov-2 m蛋白抗体特异性地结合，然后加入酶标二抗与待测抗体结合，再加入hrp酶底物tmb显色，最后加入1m h2so4终止液停止反应，检测在450nm波长处的od值，即可测出待检测抗体滴度。
[0019]
上述elisa试剂盒用于检测covid-19康复者血清抗体和接种两针sars-cov-2灭活疫苗者血清抗体时，具有较好的特异性和灵敏性，可根据试剂盒检测出的抗体滴度差异区分上述两种血清抗体。
[0020]
本发明提供了表1所述多肽在制备冠状病毒疫苗中的应用，如制备冠状病毒多肽疫苗的方法：包括将上述多肽制备成免疫原；包括将上述多肽片段与载体蛋白结合成偶联物，再将偶联物进行纯化。
[0021]
本发明提供了多肽偶联物，由权利要求1所述的冠状病毒m蛋白胞外域多肽和载体蛋白通过交联剂偶联获得；所述载体蛋白为卵清蛋白(ova)、钥孔血蓝蛋白(klh)、牛血清白蛋白(bsa)、热休克蛋白、白喉毒素突变体crm197、白喉类毒素、破伤风杆菌类毒素、霍乱弧菌分泌的不耐热肠毒素各亚基、流感嗜血杆菌蛋白d中的一种或多种；所述交联剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)、碳化二亚胺、戊二醛、二异氰酸。
[0022]
优选地，所述载体蛋白或其类似物、衍生物、突变体、或其商品化形式。
[0023]
优选地，所述载体蛋白是可溶的，增强所述偶联物的可溶性，增强对所述多肽的体液免疫反应。
[0024]
本发明还提供了免疫原组合物，包括权利要求1所述的冠状病毒m蛋白胞外域多肽、权利要求2所述多肽偶联物、佐剂(或药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂)；
[0025]
所述佐剂能增强偶联抗原免疫原性，所述佐剂为氢氧化铝、脂质a、灭活的细菌、多糖、矿物油、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、磷酸铝、铁盐、锌盐、钙盐、乙酰化酪氨酸、乙酰化糖、阳离子衍生化的多糖、阴离子衍生化的多糖、聚磷腈、生物降解微球、单磷酰脂质a中的一种或多种。
[0026]
优选地，所选佐剂为弗氏不完全佐剂。
[0027]
本发明还提供了一种接种免疫原的方法，包括如下步骤：通过皮下多点注射或者腹腔注射方式向哺乳动物施用有效量的上述免疫原组合物。
[0028]
优选地，哺乳动物是balb/c小鼠。
[0029]
优选地，向哺乳动物施用有效量的包含seq id no.2、seq id no.3或seq id no.5多肽的免疫原组合物后，诱导机体产生特异性体液免疫反应。
[0030]
本发明提供了一种制备抗冠状病毒m多肽抗原的血清抗体方法，包括如下步骤：提供所示seq id no：2、seq id no：3或seq id no：5的多肽(或包含seq id no：2、seq id no：
cov-2(wt)感染靶细胞；细胞孵育；收集上清；提取病毒总rna；qrt-pcr方法检测sars-cov-2 rna依赖性rna聚合酶(rdrp)基因的拷贝数。
[0051]
本发明提供了一种冠状病毒m蛋白胞外域多肽抗血清与sars-cov-2 rbd抗血清协同中和sars-cov-2的方法，包括如下步骤：提供抗seq id no：2、seq id no：3或seq id no：5多肽的特异性血清抗体；提供抗sars-cov-2 rbd特异性血清抗体；倍比稀释抗m多肽血清抗体；倍比稀释抗rbd血清抗体； 倍比稀释的抗m多肽血清抗体分别与抗rbd血清抗体混合；抗体混合液与等体积sars-cov-2病毒液混合孵育；血清抗体-病毒混合液与靶细胞接触孵育；移去血清抗体-病毒混合液；细胞孵育；细胞中sars-cov-2含量检测。
[0052]
优选地，血清抗体倍比稀释度为2。
[0053]
优选地，靶细胞是非洲绿猴肾(vero e6)细胞。
[0054]
本发明的上述方案有如下的有益效果：
[0055]
(1)利用本发明提供的m抗原多肽构建检测sars-cov-2 m蛋白胞外域特异性抗体的elisa检测试剂盒，有望快速有效地对sars-cov-2感染者进行诊断，并且该试剂盒可以精确区分covid-19康复者血清样品和接种两针sars-cov-2灭活疫苗者血清样品，提高临床样品检测的效率。
[0056]
(2)本发明提供的s2m11-30、s2m2-30或msm2-19多肽具有诱导产生高滴度的特异性血清抗体的能力。这三种冠状病毒m抗原多肽可作为研发冠状病毒广谱疫苗的新型靶点，在预防冠状病毒尤其是sars-cov-2的感染方面起到积极有效的作用。
[0057]
(3)本发明提供的高滴度s2m11-30、s2m2-30或msm2-19多肽抗血清具有体外中和sars-cov-2的能力，并且能够和sars-cov-2 rbd抗血清协同中和sars-cov-2，这在研发广谱抗冠状病毒药物方面具有广泛的应用前景。
附图说明
[0058]
图1是本发明实施例1中alpha deepmind预测的sars-cov-2 m蛋白的3d结构模型图；
[0059]
图2是本发明实施例2中sars-cov-2、sars-cov和mers-cov m蛋白1-30aa氨基酸序列保守性分析图；
[0060]
图3是本发明采用酶联免疫吸附法检测实施例3中covid-19大流行之前健康者血清样品(nc，n＝12)、covid-19康复者血清样品(convalescent，n＝10)、接种sars-cov-2灭活疫苗者血清样品(vaccinated,n＝10)分别与冠状病毒m抗原多肽的结合能力；
[0061]
图4是本发明采用酶联免疫吸附法检测实施例3中covid-19大流行之前健康者血清样品(nc，n＝35)、covid-19康复者血清样品(convalescent，n＝23)、接种sars-cov-2灭活疫苗者血清样品(vaccinated,n＝53)分别与冠状病毒m抗原多肽的结合能力的重复试验结果(血清1:300稀释)；
[0062]
图5是本发明实施例4中sars-cov-2 rbd和冠状病毒m多肽免疫原组合物分别免疫小鼠后的抗体滴度；
[0063]
图6是本发明实施例5中梯度稀释的冠状病毒m抗原多肽抗血清中和sars-cov-2(wt)后细胞中荧光强度的变化和本发明实施例5中梯度稀释的冠状病毒m抗原多肽抗血清中和sars-cov-2(wt)细胞中荧光强度相比阴性对照组降低比例的变化；
[0064]
图7是本发明实施例6中冠状病毒m抗原多肽抗血清和sars-cov-2 rbd抗血清的混合血清中和sars-cov-2后，细胞中病毒rdrp基因拷贝数的变化。
具体实施方式
[0065]
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
[0066]
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
[0067]
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
[0068]
本发明针对现有的问题，提供了冠状病毒m蛋白胞外域多肽及其应用。
[0069]
实施例1
[0070]
sars-cov-2 m蛋白3d结构的预测
[0071]
本实施例根据ncbi网站提供的sars-cov-2 m蛋白氨基酸序列(genbank:uic73806.1)，通过alphafold deepmind vesion 3蛋白质结构预测系统生成了sars-cov-2 m蛋白的3d结构模型图；根据uniprot网站提供的sars-cov-2 m蛋白表位(uniprot:p0dtc5)信息，并结合预测模型分析推断：m蛋白n端1-19aa和74-77aa位于病毒囊膜的表面，其余部分由3个跨膜域和两个胞内域构成。图1展示了alphafold deepmind预测的sars-cov-2 m蛋白3d结构模型图，图中标注了m蛋白的三种结构域，n端胞外域结构进行着色突出显示。
[0072]
按照本实施例相同的方法，推断出sars-cov和mers-cov m蛋白胞外域主要位于n端1-18aa。
[0073]
实施例2
[0074]
冠状病毒m蛋白胞外域保守性分析
[0075]
本实施例根据ncbi(2021年11月7日登录查询)提供的210条sars-cov、634条mers-cov和2000条sars-cov-2的m蛋白氨基酸序列，采用bioedit软件中的clustalw程序以渐进比对方法进行多重序列比对，并将比对数据上传至weblogo网站(https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)，生成了冠状病毒m蛋白1-30aa氨基酸序列的保守性分析图，如图2所示。根据氨基酸化学性质进行着色：极性氨基酸(g，s，t，y，c，q，n)为绿色，碱性氨基酸(k，r，h)为蓝色，酸性氨基酸(d，e)为红色以及疏水性氨基酸(a，v，l，i，p，w，f，m)为黑色。字母的相对大小表示其出现的频率。
[0076]
从图2保守性分析图中可，包含m蛋白胞外域在内的1-30aa氨基酸序列在不同冠状病毒之中高度保守。依据图2中的通识序列，本技术设计了表1所示的五种多肽，并由上海淘普生物科技有限公司进行合成及纯化，其纯度》95％。
[0077]
实施例3
[0078]
冠状病毒m多肽在检测临床血清样品中的应用
[0079]
多肽的包被
[0080]
用碳酸钠-碳酸氢钠(ph＝9.6)包被液稀释本技术表1中各多肽粉末，使终浓度为1
μg/ml，再向96孔酶标板(corning，货号：3369)中加入100ul/孔的多肽稀释液，使每孔含有100ng多肽抗原。37℃过夜孵育，使水分完全挥发，包被效果更佳。
[0081]
封闭与洗涤
[0082]
次日，向每孔加入250μl的5％脱脂牛奶封闭液(溶于pbs+0.05％吐温20)，37℃孵育1h，每孔加入250μl的pbst，进行洗涤，每次5min，洗涤3～5次，甩干每孔中多余的水分。
[0083]
血清样品的稀释
[0084]
本实施例中选取了三种血清样品进行检测：covid-19大流行之前健康者血清样品12份、covid-19康复者血清样品10份、接种sars-cov-2灭活疫苗者血清样品10份。血清样品用5％脱脂牛奶封闭液进行稀释，初始稀释度为1:100，进行3倍梯度连续稀释，共8个稀释梯度。将100μl各稀释梯度的血清加入到对应的酶标孔中，37℃孵育1h，每孔加入250μl的pbst，进行洗涤，每次5min，洗涤3～5次，甩干每孔中多余的水分。
[0085]
酶标二抗的稀释
[0086]
用5％脱脂牛奶封闭液稀释辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗人igg二抗，稀释比例为1:5000。将100μl稀释后的酶标二抗加入到对应的酶标孔中，37℃孵育1h，每孔加入250μl的pbst，进行洗涤，每次5min，洗涤3～5次，甩干每孔中多余的水分。
[0087]
显色与读板
[0088]
向酶标板各孔中加入50μl abts显色试剂，37℃避光反应10～15min，再向每孔加入50μl 1％sds终止反应，最后用酶标仪检测405nm处的吸光度a值(a405)。结果判定方法：若血清样品吸光值大于covid-19大流行之前健康者血清样品组(平均吸光值+两倍标准差)则判定为阳性，否则为阴性。
[0089]
结果与分析
[0090]
本实施例中的elisa检测结果如图3所示，图中p值表示covid-19康复者血清样品终点滴度处与接种sars-cov-2灭活疫苗者血清样品的t值检验；p》0.05，表示无显著差异；0.01《p《0.05，表示有统计学差异；p《0.01，表示差异显著；p《0.001表示差异极显著。本实施例中将covid-19大流行之前健康者血清样品设为阴性对照组，根据阳性样品的判定标准，康复者血清样品和本专利申请表1所示的五种冠状病毒m抗原多肽均产生了较强的反应，抗体滴度分别为900、8100、2700、900和2700；接种sars-cov-2灭活疫苗者血清样品也和五种冠状病毒m抗原多肽产生了不同程度的反应，抗体滴度分别为300、小于100、300、300和小于100。
[0091]
根据本实施例中的结果可知，感染过sars-cov-2的康复者和接种sars-cov-2灭活疫苗者的体内不仅产生了针对sars-cov-2 m蛋白胞外域(靶向s2m2-20、s2m11-30或s2m2-30)的特异性血清抗体，而且也产生了针对sars-cov m蛋白胞外域(靶向s1m2-19)交叉反应性抗体，并且感染过sars-cov-2的康复者的体内也产生了针对mers-cov m蛋白胞外域(ms2-19)的交叉反应性抗体，表明sars-cov-2m蛋白胞外域存在着b细胞表位，而且该表位能够诱导产生针对sars-cov和mers-cov m蛋白胞外域的交叉反应性抗体。
[0092]
根据本实施例中的结果，covid-19康复者血清样品针对五种冠状病毒m抗原多肽的抗体效价均在900以上，而接种sars-cov-2灭活疫苗者血清样品针对五种冠状病毒m抗原多肽的抗体的最高效价介于300～900，因此在临床检测中可将血清样品分别稀释300倍和900倍后和五种多肽冠状病毒m抗原多肽进行反应，检测结果可用于区分covid-19康复者血
清样品和接种两针sars-cov-2灭活疫苗者的血清样品。
[0093]
为了提高本实施例结果的可靠性，本实施例共收集了25份covid-19大流行之前健康者血清样品、53份covid-19康复者血清样品、35份接种sars-cov-2灭活疫苗者血清样品，并在1:300的血清稀释度下重复检测了各组血清针对冠状病毒m多肽的结合能力，汇总结果如图4所示。在1:300的血清稀释度下covid-19康复者血清样品组针对五种冠状病毒m抗原多肽的吸光值均极显著大于接种sars-cov-2灭活疫苗者血清样品组(p《0.0001)和covid-19大流行之前健康者血清样品组(p《0.0001)；接种sars-cov-2灭活疫苗者血清样品组除了针对s2m11-30多肽以及s2m-30多肽的吸光值和covid-19大流行之前健康者血清样品组无明显差异(p》0.05)外，接种sars-cov-2灭活疫苗者血清样品组针对其他三种m多肽的吸光值均大于covid-19大流行之前健康者血清样品组(0.0001《p《0.05)。该结果反映了本实施例基于冠状病毒m多肽设计的elisa试剂盒具有较好的灵敏度和可重复性，适用于区分covid-19康复者血清样品和接种两针sars-cov-2灭活疫苗者的血清样品。
[0094]
实施例4
[0095]
冠状病毒m抗原多肽疫苗的制备与免疫
[0096]
用pbs(先加入50μl dmso助溶)将本技术表1中五种多肽抗原以及klh稀释成1mg/ml，按照质量比1:1混合两种溶液(500μg多肽与500μgklh混合，此时多肽过量)，向混合溶液中加入25μl 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)溶液，室温下静置偶联2h；多肽-klh偶联物经脱盐柱处理或者透析方式去除未偶联的多肽和其他盐离子成分。使用bca蛋白定量试剂盒测定偶联物的浓度，并于-80℃保存备用。用pbs将多肽-klh偶联物稀释成200μg/ml，取50μl(10μg)稀释偶联物与等体积的不完全弗氏佐剂进行充分的乳化，制备成免疫原组合物。免疫前1～2天，采集balb/c小鼠血液，37℃静置20min，2000g离心15min，收集免疫前血清作为阴性对照；免疫原组合物按照100μl/只(6只/组)的剂量对balb/c小鼠进行免疫，采用腹腔注射方式(或皮下多点注射方式)，同时设置klh(空载体)免疫对照组和sars-cov-2 rbd-mfc免疫对照组，每次免疫间隔三周，共免疫三次，sars-cov-2 rbd免疫对照组免疫两次；分别在每次免疫两周后采集小鼠血液，37℃静置20min，2000g离心15min，收集血清。按照实施例3中提供的elisa检测方法，测定各免疫组的血清抗体效价，酶标二抗为hrp标记的羊抗鼠igg(1:5000稀释)，显色底物为tmb，终止液为2m硫酸，用酶标仪检测450nm处的吸光度a值(a450)。结果判定方法：若免疫后血清样品吸光值大于免疫前血清对照组(平均吸光值+两倍标准差)则判定为阳性，否则为阴性。
[0097]
结果与分析
[0098]
本实例中冠状病毒m抗原多肽免疫原组合物免疫小鼠后的elisa检测结果如图5所示。sars-cov-2 rbd-mfc蛋白在免疫小鼠两次后，产生了较高滴度的特异性血清抗体，抗体滴度达大于218700；含有s2m11-30、s2m2-30和msm2-19三种多肽的免疫原组合物在免疫三次后，均产生了较高滴度的特异性血清抗体，抗体滴度分别为24300～72900、72900～218700和大于218700；而含有s2m2-20和s1m2-19的免疫原组合物在三次免疫后均未诱导产生特异性抗体。
[0099]
实施例5
[0100]
冠状病毒m抗原多肽抗血清体外中和sars-cov-2
[0101]
vero e6细胞以20,000个细胞/孔的密度接至96孔细胞板(corning，货号：3904)
中，细胞培养箱中过夜孵育；次日，血清样品以1:2的起始稀释度进行测试，2倍梯度稀释，共6个稀释梯度。将野生型sars-cov-2病毒稀释液(103pfu/ml)与等体积连续稀释的血清样品混合，37℃细胞培养箱中孵育1h；将病毒-血清复合物添加到对应的细胞板孔中(并设置一个复孔)，每个中和测定细胞板中设置仅添加病毒对照组；细胞培养箱中过夜孵育24h；移去上清，加入4％多聚甲醛溶液固定细胞；加入pbs洗涤细胞3次，然后每孔加入100μl的0.5％的triton x-100(溶于pbs)，并在室温下放置透化细胞15分钟；加入pbs洗涤细胞3次，加入兔抗sars-cov-2n igg(1:4000稀释于0.2％triton x-100)孵育1小时；加入pbs洗涤细胞3次，然后加入alexa fluor 488山羊抗兔igg(h+l)交叉吸附二抗(1:100稀释于0.2％triton x-100，life technologies)室温下孵育1小时；使用sapphire biomolecular imager(azure biosystems)读取细胞板每孔中的荧光强度。最后用imagej软件中的readplate 3.0做该微中和实验的定量分析。中和滴度定义为相对于病毒对照孔的平均值，观察到荧光强度降低50％的样品稀释度。
[0102]
实施例4中经免疫小鼠收集的冠状病毒m多肽抗血清及sars-cov-2 rbd抗血清可用于本实施例中的病毒中和试验。
[0103]
本实施例中血清样品分别为：s2m11-30抗血清、s2m2-30抗血清、msm2-19抗血清和klh抗血清，阳性对照血清为sars-cov-2 rbd抗血清。
[0104]
结果与分析
[0105]
本实施例中冠状病毒m抗原多肽抗血清中和sars-cov-2的结果如图6a和图6b所示。sars-cov-2 rbd抗血清从1:2稀释到1:64时几乎都能完全中和sars-cov-2；而s2m11-30、s2m2-30和msm2-19抗血清在1:2的稀释比例时，中和了90％左右的sars-cov-2，随着血清稀释比例升高，几乎观察不到中和作用(相比于klh抗血清对照组)，这表明高浓度的s2m11-30、s2m2-30和msm2-19抗血清(抗体滴度大于24300，血清稀释比例不超过1:2)具有中和sars-cov-2的能力。
[0106]
实施例6
[0107]
冠状病毒m多肽抗血清与sars-cov-2 rbd抗血清协同中和sars-cov-2
[0108]
vero e6细胞以20,000个细胞/孔的密度接至96孔细胞板(corning，货号：3904)中，细胞培养箱中过夜孵育；次日，m多肽抗血清样品以1:8的起始稀释度进行测试，2倍梯度稀释，共2个稀释梯度，sars-cov-2 rbd抗血清分别进行1:200、1:400和1:800稀释，各稀释梯度的两种血清等体积混合，并设置单血清对照组和无血清对照组；将sars-cov-2(wt)病毒稀释液(103pfu/ml)与血清样品混合，细胞培养箱中孵育1h；去除96孔细胞板中的培养基，并将病毒-血清复合物添加到对应的细胞板孔中；细胞培养箱中孵育1h，使病毒吸附；移去每孔中的病毒-血清复合物，再加入新鲜培养基，细胞培养箱中孵育48小时；收集每孔上清液，每100μl上清液中加入400μl avl缓冲液裂解病毒，使用病毒rna提取试剂盒提取病毒总rna；根据sars-cov-2的rna依赖性rna聚合酶(rdrp)基因区域，设计引物和探针，使用qrt-pcr方法检测rdrp的拷贝数，确定病毒载量实施例4中经免疫小鼠收集的冠状病毒m多肽抗血清及sars-cov-2 rbd抗血清可用于本实施例中的病毒中和试验。
[0109]
本实施例中血清样品分别为：s2m11-30抗血清、s2m2-30抗血清、msm2-19抗血清和klh抗血清，阳性对照血清为sars-cov-2 rbd抗血清。
[0110]
结果与分析
[0111]
本实施例中冠状病毒m抗原多肽抗血清和sars-cov-2 rbd抗血清协同中和sars-cov-2的结果如图7所示，图中p值表示不同稀释度的rbd抗血清+m多肽抗血清(1:8稀释度)组与抗rbd单血清组的t值检验；p》0.05，表示无显著差异；0.01《p《0.05，表示有统计学差异；p《0.01，表示差异显著；p《0.001表示差异极显著。当加入抗sars-cov-2 rbd单血清时，随着血清稀释比例的升高，rdrp的拷贝数逐渐增高，代表中和作用逐渐降低；当抗sars-cov-2 rbd单血清稀释至1:800时，此时rdrp的拷贝数几乎和不加血清对照组相同，表明此稀释度下，抗sars-cov-2 rbd单血清已无中和作用。当klh抗血清(1:16稀释或1:8稀释)与sars-cov-2 rbd抗血清混合加入时，随着sars-cov-2 rbd抗血清稀释比例的升高，rdrp的拷贝数变化趋势和仅加入抗sars-cov-2 rbd单血清时的变化趋势几乎相同，各个稀释度下的拷贝数无显著差异，表明klh对照抗血清几乎不影响sars-cov-2 rbd抗血清发挥作用。
[0112]
当s2m11-30或s2m2-30抗血清(1:16稀释)与sars-cov-2 rbd抗血清混合加入时，随着sars-cov-2 rbd抗血清稀释比例的升高，rdrp的拷贝数变化趋势和仅加入抗sars-cov-2 rbd单血清时的变化趋势几乎相同，各个稀释度下的拷贝数无显著差异，表明1:16稀释度下，s2m11-30或s2m2-30抗血清和sars-cov-2 rbd抗血清无协同中和作用；但当s2m11-30或s2m2-30抗血清(1:8稀释)与sars-cov-2 rbd抗血清混合加入时，各个稀释度下的rdrp拷贝数相比抗sars-cov-2 rbd单血清组相比均明显下降1个数量级左右，表明1:8稀释度下，s2m11-30或s2m2-30抗血清和sars-cov-2 rbd抗血清有协同中和作用。
[0113]
当msm2-19抗血清(1:16稀释)与sars-cov-2 rbd抗血清混合加入时，各个稀释度下的rdrp拷贝数相比抗sars-cov-2 rbd单血清组相比均明显下降1个数量级左右，表明1:16稀释度下，msm2-19抗血清和sars-cov-2 rbd抗血清有协同中和作用；当msm2-19抗血清(1:8稀释)与sars-cov-2 rbd抗血清混合加入时，各个稀释度下的rdrp拷贝数相比抗sars-cov-2 rbd单血清组相比均明显下降2个数量级左右，表明1:8稀释度下，msm2-19抗血清和sars-cov-2 rbd抗血清有更强的协同中和作用；当在单独加入msm2-19抗血清(1:16稀释或1:8稀释)时，rdrp拷贝数相比不加血清对照组均下降了1个或2个数量级，表明1:16或1:8稀释度下，msm2-19抗血清也具有一定中和sars-cov-2的能力。
[0114]
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。