一种富含碱基和碱基衍生物的酵母浸出物及其制备方法与流程

1.本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种富含碱基和碱基衍生物的酵母浸出物及其制备方法。


背景技术：

2.酵母浸出物(yeast extract)，是采用新鲜酵母为原料，利用现代生物技术手段或通过改变介质环境来诱导酵母自身体内多种酶系，利用某些外源酶类在适宜的条件下促使胞内蛋白质、核酸类物质进行降解，再经过一些精制工序得到的粉状、膏状或液体状的产品。富含蛋白质、氨基酸类、肽类、核苷酸、b族维生素、微量元素，主要作用是补充氮源和提供微生物生长的各种维生素及氨基酸及生长因子，广泛用于发酵培养基行业，是一种促生长能力强的培养基原料。
3.碱基(nucleobase)和碱基衍生物(nucleobase derivatives)与核苷酸不同，是核苷酸进一步降解的产物，是酵母核酸的组成单元，在酵母自溶过程中可由酵母核酸降解得到，碱基衍生物是碱基进一步降解的产物。酵母自溶过程中，可以激活降解酵母核酸的酶，使酵母核酸降解成碱基和碱基衍生物。


技术实现要素：

4.酵母浸出物中富含碱基和碱基衍生物可以为微生物提供特殊的生长因子，可以显著促进微生物的生长。同时还能促进微生物代谢生产一些医药中间体，例如腺苷、肌苷等。
5.目前现有的酵母浸出物中，酵母核酸只降解到核苷酸的水平，没有降解成碱基和碱基衍生物，故现有的酵母浸出物中碱基和碱基衍生物含量很低，不能满足微生物发酵企业高效生产的要求。
6.为了解决现有技术中的酵母浸出物中碱基和碱基衍生物含量低的技术问题，本发明提供一种富含碱基和碱基衍生物的酵母浸出物。
7.本发明提供的酵母浸出物中碱基和碱基衍生物含量大于20000mg/kg。
8.第一方面，本发明提供一种富含碱基和碱基衍生物的酵母浸出物，所述酵母浸出物含有碱基和碱基衍生物20000-40000mg/kg。
9.优选地，所述酵母浸出物含有碱基和碱基衍生物22000-39000mg/kg；
10.优选地，所述碱基和碱基衍生物选自腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤中的一种或两种以上的组合；
11.优选地，所述酵母浸出物含有腺嘌呤2000-5000mg/kg；
12.和/或，优选地，所述酵母浸出物含有鸟嘌呤3000-6000mg/kg；
13.和/或，优选地，所述酵母浸出物含有尿嘧啶4000-7000mg/kg；
14.和/或，优选地，所述酵母浸出物含有胞嘧啶1500-5000mg/kg；
15.和/或，优选地，所述酵母浸出物含有黄嘌呤8000-11000mg/kg；
16.和/或，优选地，所述酵母浸出物含有次黄嘌呤2000-5000mg/kg。
17.优选地，以质量百分比计，所述酵母浸出物含有总氮10-12％；优选地，以质量百分比计，所述酵母浸出物含有总氮10.5-11.8％；
18.优选地，以质量百分比计，所述酵母浸出物含有氨基酸态氮3.5-5.5％，优选地，以质量百分比计，所述酵母浸出物含有氨基酸态氮4-5％。
19.第二方面，本发明提供所述的酵母浸出物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤；
20.将酵母乳加热至40-60℃，调节ph 5.0-6.0，按照酵母乳干重添加质量百分比为0.1-1％的酶制剂，按照酵母乳干重添加质量百分比为1-5％的前体物质，自溶15-24h后得到。
21.本发明中所述的前体物质在自溶过程中转化成碱基和碱基衍生物。
22.优选地，所述的酶制剂为核酸酶、腺嘌呤脱氨酶和鸟嘌呤脱氨酶中的一种或两种以上的组合，
23.优选地，所述酶制剂为核酸酶、腺嘌呤脱氨酶和鸟嘌呤脱氨酶的组合；
24.优选地，所述核酸酶、腺嘌呤脱氨酶和鸟嘌呤脱氨酶的质量比为2.5-5:1:1。
25.优选地，所述的前体物质为酵母rna或呈味核苷酸二钠中的一种或两种以上的组合。
26.优选地，所述制备方法还包括，自溶后灭酶，固液分离后，取液体浓缩，得到酵母浸出物；
27.优选地，在65-75℃条件下灭酶；
28.优选地，所述浓缩方式为减压蒸发。
29.优选地，所述的酵母选自酿酒酵母、假丝酵母和毕赤酵母中的一种或两种以上的组合。
30.优选地，所述的酵母乳的制备方法包括如下步骤：
31.将酵母菌种子接入培养基，在ph4.0-6.0，温度为30-33℃条件下，培养12-24h，收集酵母细胞，得到酵母乳。
32.优选地，所述的酵母乳中，以干物质含量计，酵母细胞的含量为10-15wt％，其余为水。
33.优选地，接种量为1-5wt％，
34.优选地，所述培养基，每100ml水中加入碳源3-10g、酵母浸出物0.5-1g、硫酸铵2-5g、硫酸镁1-2g、磷酸二氢钾0.5-1g、硫酸锌0.1-0.5g，
35.优选地，所述碳源选自甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜或者水解糖中的一种或多种进行组合。
36.第三方面，本发明还提供所述的制备方法制备得到的酵母浸出物。
37.第四方面，本发明还提供所述的酵母浸出物或所述的制备方法制备得到的酵母浸出物在食品、饲料、培养基中的应用。
38.酵母浸出物是一种营养非常全面的有机氮源，为微生物的生长提供氮源的同时还提供微量元素，维生素等生长因子。传统的酵母浸出物中富含核苷酸，而本发明提供的酵母浸出物富含碱基和碱基衍生物，碱基和碱基衍生物比核苷酸更容易被微生物吸收，故本发明提供的产品比传统酵母浸出物促微生物生长能力更强，品质更好。本发明提供的制备方法可显著提高酵母浸出物中碱基和碱基衍生物的含量。
具体实施方式
39.本发明的目的是提供一种富含碱基和碱基衍生物的酵母浸出物。现有的酵母浸出物中碱基和碱基衍生物的含量低，对微生物的促生长能力和促进微生物代谢生产产物的能力不够，不能满足微生物发酵企业高效生产的要求。本发明提供的酵母浸出物富含碱基和碱基衍生物，具有较强的促进微生物生长及代谢性能。运用本发明提供的方法，在酵母乳中添加酶制剂和底物，通过温度、ph等条件的控制，促进酵母自溶，同时促进酵母核酸降解转化成碱基和碱基衍生物，得到富含碱基和碱基衍生物的酵母浸出物。
40.本发明提供的酵母浸出物中碱基和碱基衍生物含量大于20000mg/kg，所述碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶中的一种或两种以上的组合；所述碱基衍生物为次黄嘌呤、黄嘌呤中的一种或两种。
41.本发明提供的酵母浸出物的制备方法包括，将酵母乳经自溶酶解后，向酵母乳中添加酶制剂，在40-60℃，ph 5.0-6.0条件下，自溶15-24h后得到；在本发明的优选实施方式中，还包括将自溶得到的产物分离纯化，优选地，将酵母自溶液经过固液分离，将液体浓缩后得到酵母浸出物，优选地，减压蒸发得到膏状酵母浸出物或者喷雾干燥得到粉状酵母浸出物，在本发明的一种具体实施方式中减压蒸发在92-95kpa、80℃条件下进行。
42.本发明提供的一种具体实施方式中，所述酵母浸出物的制备方法包括如下步骤，
43.1)酵母乳获得：发酵条件ph4.0-6.0，培养温度为30-33℃，培养时间为12-24h。发酵培养基配方如下：碳源3-10％、酵母浸出物0.5-1％、硫酸铵2-5％、硫酸镁1-2％、磷酸二氢钾0.5-1％、硫酸锌0.1-0.5％(以上均为质量体积比w/v)。其中碳源是甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜或者水解糖中的一种或多种进行组合。发酵结束后，将发酵液在5000-7000rpm条件下离心，弃上清，向重相中加入纯水后再次离心分离得到洗涤的酵母，再用纯水将酵母稀释成干物质含量为10-15％的酵母乳。
44.2)酵母自溶过程：将酵母乳加热至40-60℃，并维持这一温度。调节ph 5.0-6.0，按照酵母乳干重添加酶制剂0.1-1％，按照酵母乳干重添加底物1-5％，自溶15-24h。所述的酶制剂为核酸酶、腺嘌呤脱氨酶，鸟嘌呤脱氨酶，所述的底物为酵母rna或呈味核苷酸二钠。
45.3)分离纯化：上述酵母自溶后得到自溶液，经过65-75℃灭酶处理，离心机5000-7000rpm，离心5-10min收集上清液，上清液通过减压蒸发，得到富含碱基和碱基衍生物的酵母抽提物膏体(水分含量30-35％)，或者经过喷雾干燥得到粉体(水分《5％)。
46.实施例中所用试剂具体来源列于下面的表1中。
47.表1本发明所用试剂及仪器来源信息
48.物质性能指标出售厂家或公开来源核酸酶8万u/g安琪酵母股份有限公司酵母浸出物试剂级酵母浸出物fm888安琪酵母股份有限公司鸟嘌呤脱氨酶5万u/g安琪酵母股份有限公司腺嘌呤脱氨酶5万u/g安琪酵母股份有限公司枯草芽孢杆菌cctcc 131157中国典型培养物保藏中心
49.本发明实施例中所用酿酒酵母fx-2(saccharomyces cerevisiae fx-2)于2016年8月1日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2016418。该菌株在公开号为cn108220175a的专利公开文本中已有记载。
50.本发明实施例中所用假丝酵母c1.7(wickerhamomyces anomalus c1.7)于2017年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2017782。该菌株在公开号为cn110959853a的专利公开文本中已有记载。
51.本发明实施例中所用毕赤酵母c1.8(cyberlindnerafabianii c1.8)于2017年12月11日保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m2017780。该菌株在公开号为cn110959853a的专利公开文本中已有记载。
52.实施例1一种酵母浸出物
53.一种酵母浸出物，其制备方法如下：
54.1.酵母培养基配制：取纯水100l，按如下各原料与水的质量比配制培养基：甘蔗糖蜜3％，酵母浸出物0.8％，硫酸铵2％，硫酸镁1％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸锌0.1％，调节ph4.5。
55.2.酿酒酵母fx-2酵母培养：酿酒酵母fx-2接种量1％(w/v)，培养温度30℃，通气量50l/min，搅拌速度300rpm/min，培养12h。
56.3.离心机5000rpm，离心5min，收集重相，向重相中加入纯水，搅拌均匀后5000rpm离心5min，重新收集重相，加入纯水至酵母细胞干重10％(w/v)。
57.4.将上述酵母乳加热至50℃，调节ph5.0，按照酵母乳干重加腺嘌呤脱氨酶0.1％，添加底物呈味核苷酸二钠1％，自溶期间保持温度和ph不变，自溶20h。
58.5.将自溶液升温至65℃，维持30min。离心机5000rpm，离心5min。收集上清液，在92-95kpa、80℃条件下减压蒸发浓缩，喷雾干燥得到粉状成品，水分含量3.5％。
59.实施例2一种酵母浸出物
60.一种酵母浸出物，其制备方法如下：
61.1.酵母培养基配制：取纯水100l，按如下各原料与水的质量比配制培养基：甘蔗糖蜜5％，酵母浸出物0.5％，硫酸铵4％，硫酸镁1.5％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸锌0.3％，调节ph5.0。
62.2.假丝酵母c1.7酵母培养：假丝酵母c1.7酵母接种量1％(w/v)，培养温度30℃，通气量50l/min，搅拌速度300rpm/min，培养20h。
63.3.离心机6000rpm，离心5min，收集重相，向重相中加入纯水，搅拌均匀后6000rpm离心5min，重新收集重相，加入纯水至酵母细胞干重12％(w/v)。
64.4.将上述酵母乳加热至40℃，调节ph5.5，按照酵母乳干重加入添加核酸酶0.25％，鸟嘌呤脱氨酶0.1％，添加底物酵母rna 3％，自溶期间保持温度和ph不变，自溶15h。
65.5.将自溶液升温至65℃，维持30min。离心机5000rpm，离心5min。收集上清液，在92-95kpa、80℃条件下减压蒸发浓缩，喷雾干燥得到粉状成品，水分含量3.7％。
66.实施例3一种酵母浸出物
67.一种酵母浸出物，其制备方法如下：
68.1.酵母培养基配制：取纯水100l，按如下各原料与水的质量比配制培养基：甘蔗糖蜜10％，酵母浸出物1％，硫酸铵5％，硫酸镁2％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸锌1％，调节ph6.0。
69.2.毕赤酵母c1.8酵母培养：毕赤酵母c1.8接种量1％(w/v)，培养温度33℃，通气量50l/min，搅拌速度300rpm/min，培养24h。
70.3.离心机6000rpm，离心5min，收集重相，向重相中加入纯水，搅拌均匀后6000rpm离心5min，重新收集重相，加入纯水至酵母细胞干重15％(w/v)。
71.4.将上述酵母乳加热至60℃，调节ph 6.0，按照酵母乳干重加入添加核酸酶0.5％、腺嘌呤脱氨酶0.1％、鸟嘌呤脱氨酶0.1％、添加底物酵母rna 3％、添加底物呈味核苷酸二钠2％，自溶期间保持温度和ph不变，自溶24h。
72.5.将自溶液升温至70℃，维持30min。离心机5000rpm，离心5min。收集上清液，在92-95kpa、80℃条件下减压蒸发浓缩，喷雾干燥得到粉状成品，水分含量3.0％。
73.对比例1酶对酵母浸出物性能的影响
74.一种酵母浸出物，其制备方法如下：
75.1.酵母培养基配制：取纯水100l，按如下各原料与水的质量比配制培养基：甘蔗糖蜜6％，酵母浸出物0.8％，硫酸铵3.5％，硫酸镁1％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸锌0.6％，调节ph5.5。
76.2.酵母培养：酿酒酵母fx-2接种量1％(w/v)，培养温度30℃，通气量50l/min，搅拌速度300rpm/min，培养20h。
77.3.离心机6000rpm，离心5min，收集重相，向重相中加入纯水，搅拌均匀后6000rpm离心5min，重新收集重相，加入纯水至酵母细胞干重13％(w/v)。
78.4.将上述酵母乳加热至55℃，调节ph 5.5，按自溶期间保持温度和ph不变，自溶20h。
79.5.将自溶液升温至65℃，维持30min。离心机5000rpm，离心5min。收集上清液，在92-95kpa、80℃条件下减压蒸发浓缩，喷雾干燥得到粉状成品，水分含量4.0％。
80.对比例2酶的用量对酵母浸出物性能的影响
81.一种酵母浸出物，其制备方法如下：
82.1.酵母培养基配制：取纯水100l，按如下各原料与水的质量比配制培养基：甘蔗糖蜜10％，酵母浸出物1％，硫酸铵5％，硫酸镁2％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸锌1％，调节ph6.0。
83.2.毕赤酵母c1.8酵母培养：毕赤酵母c1.8酵母接种量1％(w/v)，培养温度33℃，通气量50l/min，搅拌速度300rpm/min，培养24h。
84.3.离心机6000rpm，离心5min，收集重相，向重相中加入纯水，搅拌均匀后6000rpm离心5min，重新收集重相，加入纯水至酵母细胞干重15％(w/v)。
85.4.将上述酵母乳加热至60℃，调节ph 6.0，按照酵母乳干重加入添加核酸酶0.05％、腺嘌呤脱氨酶0.03％、鸟嘌呤脱氨酶0.03％、添加底物酵母rna3％、添加底物呈味核苷酸二钠2％，自溶期间保持温度和ph不变，自溶24h。
86.5.将自溶液升温至70℃，维持30min。离心机5000rpm，离心5min。收集上清液，在92-95kpa、80℃条件下减压蒸发浓缩，喷雾干燥得到粉状成品，水分含量3.2％。
87.对比例3前体物质用量对酵母浸出物性能的影响
88.一种酵母浸出物，其制备方法如下：
89.1.酵母培养基配制：取纯水100l，按如下各原料与水的质量比配制培养基：甘蔗糖蜜3％，酵母浸出物0.8％，硫酸铵2％，硫酸镁1％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸锌0.1％，调节ph4.5。
90.2.酿酒酵母fx-2酵母培养：酿酒酵母fx-2接种量1％(w/v)，培养温度30℃，通气量
50l/min，搅拌速度300rpm/min，培养12h。
91.3.离心机5000rpm，离心5min，收集重相，向重相中加入纯水，搅拌均匀后5000rpm离心5min，重新收集重相，加入纯水至酵母细胞干重10％(w/v)。
92.4.将上述酵母乳加热至50℃，调节ph5.0，按照酵母乳干重加入添加核酸酶0.5％、腺嘌呤脱氨酶0.1％、鸟嘌呤脱氨酶0.1％、添加底物酵母rna0.5％、添加底物呈味核苷酸二钠0.2％，自溶期间保持温度和ph不变，自溶22h。
93.5.将自溶液升温至65℃，维持30min。离心机5000rpm，离心5min。收集上清液，在92-95kpa、80℃条件下减压蒸发浓缩，喷雾干燥得到粉状成品，水分含量3.8％。
94.检测实施例1-3和对比例1-3制备得到的酵母浸出物中总氮、氨基酸态氮、水分、碱基和碱基衍生物以及各碱基和碱基衍生物的含量，各理化指标检测方法如下所示。结果如表2和表3中所示。
95.(1)水分的测定
96.采用国家标准gb/t 23530-2009中6.2的方法，取一定质量的样品，在103℃下烘干4小时至恒重，称重计算水分的含量，结果如表2中所示。
97.(2)总氮的测定
98.采用国家标准gb/t 23530-2009中6.4的凯式定氮法：取样品(相当于总氮30-440mg)，在混合催化剂a(硫酸钾与五水硫酸铜按97:3比例混合)5g和催化剂b(硒粉与硫酸钾按0.1:100比例混合)2.5g作用下，加入20ml浓硫酸进行消煮；再进行蒸馏，用硼酸吸收产物氨；再用0.1mol/l的盐酸滴定，读取数据，计算总氮含量，结果如表2中所示。
99.(3)氨基酸态氮的测定
100.采用国家标准gb/t 23530-2009中6.5所述的氨基酸态氮的检测方法：
101.取5g样品，稀释后用0.5mol/l的氢氧化钠溶液滴定至ph为8.2，并保持1min。缓慢加入36％的甲醛溶液10ml，与中性氨基酸中的非解离型氨基反应，生成单羟甲基和二羟甲基诱导体，此反应完全定量进行。此时放出的氢离子用上述氢氧化钠滴定，根据碱液的消耗量，计算出氨基酸态氮的含量，结果如表2中所示。
102.(4)ph的测定
103.采用国家标准gb/t 35536-2017中7.2.1所述的ph的检测方法：配置一定重量百分比浓度水溶液，采用玻璃电极测定灭菌后的ph值。同一样品两次测定值之差应不应超过0.04。
104.(5)碱基和碱基衍生物测定
105.采用高效液相色谱法对各种碱基和碱基衍生物含量测定。
106.高效液相色谱仪：带紫外检测器和scx柱250mm*4.6mm 5um
107.流动相：0.1％磷酸
108.柱温：35℃
109.检测波长：267nm
110.将各种碱基和碱基衍生物配制成一定浓度的标准溶液，在高效液相色谱仪中进样，并检测绘制成标准曲线。待测样品用谁溶解后，过0.22um膜，进样进行高效液相色谱分析，根据标准曲线计算样品中各个碱基和碱基衍生物的浓度，结果如表2和表3中所示。
111.表2理化指标检测结果
[0112] 总氮氨基酸态氮碱基和碱基衍生物水分实施例110.5％4.0％22000mg/kg3.5％实施例211.2％4.3％25000mg/kg3.7％实施例311.8％5.0％39000mg/kg3.0％对比例111.0％4.2％3000mg/kg4.0％对比例211.1％4.1％3300mg/kg3.8％对比例310.9％4.2％4500mg/kg3.9％
[0113]
表3碱基和碱基衍生物含量
[0114][0115]
如上表2和表3所示，实施例1-3制备得到的酵母浸出物中碱基和碱基衍生物含量达到22000-39000mg/kg，而对比例1-3制备得到的酵母浸出物中碱基和碱基衍生物含量为3000-4500mg/kg，以本发明提供的制备方法制备得到的酵母浸出物碱基和碱基衍生物含量较高。
[0116]
实验例1
[0117]
将上述实施例1-3，对比例1-3以及现有技术cn106282242a的酵母浸出物用于培养枯草芽孢杆菌cctcc 131157，测定菌体od600和最终腺苷产量，具体实验操作如下：
[0118]
1.发酵培养基配制：取纯水1l，按如下各原料与水的质量比配制培养基：葡萄糖150g/l，酵母浸粉(实施例1-3、对比例1-3和cn106282242a的酵母浸出物)35g/l，硫酸镁10g/l，磷酸二氢钾10g/l，硫酸锰0.05g/l，硫酸铜0.01g/l，配制好后121℃灭菌20min。
[0119]
2.枯草芽孢杆菌cctcc 131157接种至上述培养基中培养48h，测定od600和腺苷产量。检测结果如下表4所示。
[0120]
表4
[0121] od600腺苷产量实施例15034g/l实施例25440g/l实施例36245g/l对比例13720g/l对比例23620g/l对比例33723g/lcn106282242a的酵母浸出物4226g/l
[0122]
从上表4中可以看出，本发明实施例1-3提供的酵母浸出物应用于微生物培养基能够更好的促进微生物生长。
[0123]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。