一种从血浆中提取免疫球蛋白IgG的方法与流程

一种从血浆中提取免疫球蛋白igg的方法
技术领域
1.本发明属于血浆的化学提取领域，尤其涉及一种从血浆中提取免疫球蛋白igg的方法。


背景技术：

2.我国一直以来就是一个农业大国，每年都会有大量的家畜出栏，而血液是畜禽生产的副产品，但我国对于血液并没有深层次的开发和利用。研究表明，血液由血浆和血细胞组成，而血浆中含有复杂的蛋白质混合物，典型的成分是50-60％的白蛋白、40-50％的球蛋白和1-3％的纤维蛋白原。
3.球蛋白以免疫球蛋白igg为主，其次还包括iga、igm、igd和ige。igg是机体免疫蛋白中起主要作用的免疫球蛋白，占血液总免疫球蛋白的75％。在临床应用当中，igg能够与病原体或毒素结合，激活抗体，加强吞噬作用的杀伤作用，启动过敏反应和减轻移植器官排斥的能。在饲养方面，发现口服igg可以改善生长性能，调节肠道菌群。
4.传统工艺通常采用乙醇、聚乙二醇等有机溶剂，或是硫酸铵、辛酸、硫酸钠等盐析法提取，但是采用乙醇提取容易造成蛋白质变质，而聚乙二醇提取免疫球蛋白igg，反应后不易将聚乙二醇从所得蛋白质中分离出来，选择盐析法提纯免疫球蛋白igg，会有反应复杂、成本高、污染大等缺点。因此，实际生产需要一种高效、操作简单、污染低、能够适用于大规模工业化生产的血浆中免疫球蛋白igg的提取方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种从血浆中提取免疫球蛋白igg的方法，该提取方法工艺简单、污染低、免疫球蛋白igg纯度高，适用于大规模工业化生产。
6.为了实现本发明的目的，本发明提供了一种从血浆中提取免疫球蛋白igg的方法，具体包括以下步骤：
7.(1)将血浆置于离心机内，进行离心沉淀，收集血浆上清液；
8.(2)将三氯化铁溶液加入到上述血浆上清液中，进行沉淀反应，然后将反应产物置于离心机中，离心收集上清液；
9.(3)将所得上清液与单宁酸进行反应，取沉淀物；
10.(4)将步骤(3)中获得沉淀物依次进行浓缩、干燥，即得免疫球蛋白igg。
11.进一步的，所述三氯化铁溶液是由无水三氯化铁或六水三氯化铁中一种配制而成。无水三氯化铁是一种共价无机化合物，为黑棕色结晶，薄片状，易溶于水且具有强烈的吸水性，已广泛应用于金属蚀刻、污水处理、金、银的氯化提取，而本发明中利用无水三氯化铁或六水三氯化铁配制成的三氯化铁溶液来提取免疫球蛋白igg，并利用单宁酸与免疫球蛋白的结合特性进行纯化。
12.进一步的，所述三氯化铁溶液的浓度为4.5mmol/l。
13.进一步的，所述单宁酸溶液浓度为5-20％。
14.进一步的，所述步骤(2)中血浆上清液与所述三氯化铁溶液的体积比值为10:1。
15.进一步的，所述步骤(2)中沉淀反应时的ph值为4.5-5.5。
16.进一步的，所述步骤(2)中沉淀反应的温度为25-50℃。
17.进一步的，所述步骤(2)中沉淀反应的温度为40℃。
18.进一步的，所述步骤(2)中沉淀反应的温度为50℃。
19.进一步的，所述步骤(2)中沉淀反应的时间为1h。
20.进一步的，所述步骤(3)中反应温度为常温，反应时间为1h。
21.本发明取得了以下有益效果：
22.1、本发明在沉淀反应过程中，反应过程温和，免疫球蛋白igg的活性损失很少；相比有机溶剂、其它有机盐提纯所需的实际用量，本发明中三氯化铁的用量很少，成本较低；并且利用单宁酸与免疫球蛋白的结合特性进行纯化，绿色环保。
23.2、本发明的提取工艺简单、低污染、无需复杂的设备即可实现大规模工业化生产，应用前景广泛。
具体实施方式
24.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
25.本发明下面实施例中，三氯化铁溶液是采用六水三氯化铁(cas no.10025-77-1)配制而成，浓度为4.5mol/l；单宁酸溶液为单宁酸水溶液，浓度为5-20％(m/v)，单宁酸(别名鞣酸)分子量为1701.20，单宁酸结构式如下所示。
[0026][0027]
本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
[0028]
实施例1
[0029]
从血浆中提取免疫球蛋白igg的方法包括以下步骤：
[0030]
(1)将血浆置于4℃冰箱解冻，溶解后血浆置于离心机内，以4000r/min离心20min，弃去沉淀取血浆上清液。
[0031]
(2)配置4.5mmol/l的三氯化铁溶液50ml备用。
[0032]
(3)取5ml离心后血浆上清液和0.5ml三氯化铁溶液加入定容瓶中，用0.1mol/l的盐酸溶液调整ph值为4.5，将容量瓶置于恒温水浴锅中，温度调节为50℃，反应时间为1h。
[0033]
(4)将步骤(3)中得到的样品以4000r/min离心20min，弃去沉淀取上清液。
[0034]
(5)取上述上清液与20％的单宁酸水溶液按5:1体积比进行反应1h，取沉淀物，然后将获得的沉淀物依次进行浓缩、干燥，得免疫球蛋白igg。
[0035]
经检测，免疫球蛋白igg纯度为78.8％，回收率为84.8％。
[0036]
实施例2
[0037]
(1)将血浆置于4℃冰箱解冻，溶解后血浆置于离心机内，以4000r/min离心20min，弃去沉淀取血浆上清液。
[0038]
(2)配置4.5mmol/l的三氯化铁溶液50ml备用。
[0039]
(3)取5ml离心后的血浆上清液和0.5ml三氯化铁溶液加入定容瓶中，用0.1mol/l的盐酸溶液调整ph值为4.5，将容量瓶置于恒温水浴锅中，温度调节为30℃，反应时间为1h。
[0040]
(4)将步骤(3)中得到的样品以4000r/min离心20min，弃去沉淀取上清液。
[0041]
(5)取上述上清液与20％的单宁酸水溶液按5:1体积比进行反应1h，取沉淀物，然后将获得的沉淀物依次进行浓缩、干燥，得免疫球蛋白igg。
[0042]
经检测，免疫球蛋白igg纯度为65.7％，回收率为77.3％。
[0043]
实施例3
[0044]
(1)将血浆置于4℃冰箱解冻，溶解后血浆置于离心机内，以4000r/min离心20min，弃去沉淀取血浆上清液。
[0045]
(2)配置4.5mmol/l的三氯化铁溶液50ml备用。
[0046]
(3)取5ml离心后的血浆上清液和0.5ml三氯化铁溶液加入定容瓶中，用0.1mol/l的盐酸溶液调整ph值为5.5，将容量瓶置于恒温水浴锅中，温度调节为40℃，反应时间为1h。
[0047]
(4)将步骤(3)中得到的样品以4000r/min离心20min，弃去沉淀取上清液。
[0048]
(5)取上述上清液与20％的单宁酸水溶液按5:1体积比进行反应1h，取沉淀物，然后将获得的沉淀物依次进行浓缩、干燥，得免疫球蛋白igg。
[0049]
经检测，免疫球蛋白igg纯度为82.8％，回收率为93.4％。
[0050]
对比试验
[0051]
本对比试验测试了免疫球蛋白igg提纯过程中，不同ph值和温度对血浆中免疫球蛋白igg提纯的效率，将血浆按照实施例1中步骤(1)处理后得到的血浆上清液，按照以下分组进行提纯和检测，各组的实验方法参照实施例1，不同的是反应过程中的ph值和温度。下表1为沉淀反应过程中水浴温度40℃时，不同ph值的免疫球蛋白igg的提纯效率检测结果。
[0052]
表1不同ph值的免疫球蛋白igg的提纯效率检测表
[0053]
组别反应条件纯度回收率1ph值3.5，水浴温度40℃59.9％66.6％2ph值4.5，水浴温度40℃66.7％68.0％3ph值5.5，水浴温度40℃82.8％93.4％4不调ph值，水浴温度40℃58.5％95.1％
[0054]
从上表1的结果可知，按照免疫球蛋白igg提取纯度，由高到低排序为a3组＞a2组
＞a1组＞a4组，相比各组可知，在一定的范围内，ph值越高，免疫球蛋白igg的提纯效率越高。
[0055]
下表2为沉淀反应过程中ph值4.5时，不同沉淀反应温度的免疫球蛋白igg的提纯效率检测结果。
[0056]
表2不同沉淀反应温度的免疫球蛋白igg的提纯效率检测表
[0057]
组别反应条件纯度回收率b1ph值4.5，水浴温度30℃65.7％77.3％b2ph值4.5，水浴温度40℃66.7％68.0％b3ph值4.5，水浴温度50℃78.8％84.8％
[0058]
由上表2可知，免疫球蛋白igg的提取纯度，由高到低依次排列为：b3组＞b2组＞b1组，在相同ph值的情况下，低温会降低免疫球蛋白igg的提取纯度，将b1组、b2组与b3组相比，在ph值相同的基础上，一定温度范围内水浴加热的提纯效率要高。
[0059]
尽管对其中的原理不完全清楚，但可以提出一种合理的假设，蛋白质空间结构中有亲水基团和疏水基团，在水中溶解的时候，蛋白质的亲水基团在结构外围，在加入了三氯化铁过后，蛋白质的结构发生改变，疏水基团暴露在外围，从而沉淀下来。
[0060]
而调整溶液中的ph值，是为了靠近蛋白质的等电点，减弱蛋白质分子之间同性相斥的作用力，破坏原来蛋白质溶液中由于带电荷相互排斥而稳定的溶液状态，从而使蛋白质分子相互凝聚沉淀。
[0061]
值得注意的是，本发明从血浆中提取免疫球蛋白igg的方法采用三氯化铁对蛋白质沉淀作用，通过不同浓度的三氯化铁溶液具有沉淀不同蛋白质的功能，不限于本发明实施例中提供的三氯化铁溶液浓度，进而本发明实现了免疫球蛋白igg的高效提取，并结合单宁酸与免疫球蛋白的结合能力进行纯化，形成高效、环保、成本低廉的提取纯化工艺。
[0062]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。