一种物理刺激控制可生成细菌纤维素细菌裂解和胞内物质释放的制备方法和应用

本发明属于生物，具体涉及一种蓝光控制的可生成纤维素膜的木醋杆菌裂解死亡和胞内物质释放系统。

背景技术：

1、细菌生长速度快，便于大规模培养，因此早就被研究者们用来生产各种药物。随着合成生物学地发展，利用工程化后的细菌作为药物输送系统具有传统给药方法无比比拟的优点[1]。比如，细菌可以保护药物的活性，增加药物的半衰期；更重要的是，细菌可以将药物输送到注射或口服难以到达的身体部位。

2、相比其他细菌，木醋杆菌等微生物可以生产一种强壮和超纯的天然细菌纤维素(bc)。而bc具有良好的生物相容性、能够为细胞附着提供最佳的三维基质、对多种细胞无毒性、能够提供灵活性、高保水能力和气体交换[2][3]。虽然bc膜已经被广泛的应用于食品，医疗等领域，但是对木醋杆菌菌株本身的改造却少之又少，使得其功能较为单一。近年来，也有研究者尝试利用木醋杆菌来表达一些外源蛋白，但是胞内表达的蛋白等物质的可控释放问题并仍未解决[4]。

3、[1]kang m,choe d,kim k,et al.synthetic biology approaches in thedevelopment of engineered therapeutic microbes[j].int j mol sci,2020,21(22):

4、[2]picheth gf,pirich cl,sierakowski mr,et al.bacterial cellulose inbiomedical applications:a review[j].int.j.biol.macromol,2017,104(pt a):97-106.

5、[3]barja f.bacterial nanocellulose production and biomedicalapplications[j].j biomed res,2021,35(4):310-317.

6、[4]florea m,hagemann h,santosa g,et al.engineering control ofbacterial cellulose production using a genetic toolkit and a new cellulose-producing strain[j].proc.natl.acad.sci.u.s.a,2016,113(24):e3431-3440.

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明构建了一种物理激活的裂解系统来控制可生成细菌纤维素膜的细菌自我清除以及胞内物质的释放。本发明通过合成生物学的方法，在可生成细菌纤维素的细菌内构建一套受物理刺激调控的裂解系统来远程控制可生成细菌纤维素的细菌裂解和胞内物质释放。工程化后的可生成细菌纤维素的细菌在黑暗条件下可以正常生长和生成bc膜，但当使用物理刺激后可生成细菌纤维素的细菌发生裂解同时释放出胞内生成的物质。

2、本发明一个方面提供了一种物理控制细菌裂解用质粒，所述质粒中具有物理激活启动子以及受物理激活启动子调控扩增的裂解蛋白的编码基因，所述裂解蛋白的编码基因上游还具有核糖体结合位点，所述核糖体结合位点(ribosome binding site，rbs)具有如seq id no.3所述的序列。

3、进一步地，所述物理激活启动子为能够由于光、温度、压力、渗透压变化引发启动的启动子。

4、进一步地，所述光优选为蓝光。

5、进一步地，所述物理激活启动子选自蓝光启动子pdawn，优选地，其序列如seq idno.1所示。

6、进一步地，所述裂解蛋白选自能够导致细菌裂解的蛋白，优选为噬菌体φ174的裂解蛋白e、lkd16噬菌体裂解蛋白，λ噬菌体裂解蛋白。

7、进一步地，所述噬菌体φ174的裂解蛋白e的编码序列如seq id no.2所示。

8、进一步地，质粒选自在可生成细菌纤维素的细菌中可复制的任意质粒，例如以pseva331作为载体质粒。

9、本发明另一个方面提供了一种可生成细菌纤维素膜(bc)工程菌，所述可生成细菌纤维素膜工程菌具有本发明上述物理控制裂解用质粒，能够被物理刺激激活裂解。

10、进一步地，所述生产细菌纤维素膜工程菌的宿主菌选自木醋杆菌、巴氏醋杆菌、木葡糖酸醋杆菌、汉氏葡糖醋杆菌、醋化醋杆菌、产醋醋杆菌、气杆菌、根瘤杆菌、无色杆菌、土壤杆菌、假单胞杆菌、产碱杆菌、八叠球菌、动胶菌中的至少一种。

11、进一步地，所述可生成细菌纤维素膜的工程菌的基因组或质粒可表达外源活性物质的编码基因。

12、进一步地，所述活性物质选自蛋白质、rna、多肽。

13、本发明又一个方面提供了可生成细菌纤维素膜工程菌的构建方法，所述构建方法包括：

14、s11)构建物理控制细菌裂解用质粒，所述质粒中具有物理激活启动子以及受物理激活启动子调控扩增的裂解蛋白的编码基因，所述裂解蛋白的编码基因上游还具有核糖体结合位点，所述核糖体结合位点具有如seq id no.3所述的序列；

15、s12)将所述物理控制细菌裂解用质粒转入可生成细菌纤维素膜的野生型细菌中，获得能够以物理条件控制裂解的生产细菌纤维素膜工程菌。

16、本发明再一个方面提供了本发明所述的物理控制裂解用质粒在制备能够受物理刺激裂解的细菌中的用途。

17、本发明再一个方面提供了一种调控细菌裂解以及释放细菌所产胞内物质的方法，所述方法包括：

18、s01)构建上述可生成细菌纤维素膜的工程菌；

19、s02)启动物理刺激激活上述可生成细菌纤维素膜工程菌裂解。

20、本发明再一个方面提供了一种能够被物理刺激诱导裂解的工程菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：

21、s1)根据物理刺激种类选择对应的启动子，并根据细菌种类选择裂解蛋白；

22、s2)采用随机引物法构建混合的质粒连接液，所述混合的质粒连接液中包含步骤s1)选择的启动子、由随机引物法设计获得的一系列不同的核糖体结合位点以及由步骤s1)选择的裂解蛋白的编码基因序列；

23、s3)将步骤s2)获得的混合的质粒连接液转入大肠杆菌中，获得待筛选大肠杆菌工程菌；

24、s4)将待筛选大肠杆菌工程菌分别在步骤s1)所述物理刺激下，以及非所述物理刺激条件下分别进行培养，筛选能够获得能够在非所述物理刺激条件下正常生长，而在所述物理刺激条件下全部裂解的大肠杆菌菌株；

25、s5)从步骤s4)筛选获得的大肠杆菌工程菌中提取对应的重组质粒并进行测序，获得其对应的核糖体结合位点序列，并将该重组质粒分别导入步骤s1)所述野生型细菌中，获得能够被物理刺激诱导裂解的工程菌。

26、进一步地，所述细菌为可以生成外源蛋白或目标成分的可生成纤维素膜的细菌

27、进一步地，所述物理刺激为光、温度、压力、渗透压的变化。

28、有益效果

29、1、本发明提供了一种使用非侵入型诱导方式来控制工程菌裂解的方式，避免了化学诱导剂的侵入以及在细菌纤维素膜中扩散问题，同时这种调控方式不受时间和空间限制。

30、2、本发明通过特殊方法解决了裂解蛋白漏表达，导致在未受到物理刺激时，工程菌不会因为裂解蛋白的漏表达而裂解，进而无法得到足够的纤维素膜或期望的蛋白，或者并未在希望裂解的时间实现裂解宿主菌的效果。同时本发明还解决了裂解蛋白在受到物理刺激启动后无法达到裂解最低阈值水平，而无法实现宿主菌的裂解。

31、3、通过本发明的方法可以制备得到细菌纤维素膜，且生产这些细菌纤维素膜的细菌无需添加额外的试剂就能通过裂解实现自我清除，因此，获得的细菌纤维素末更干净，无污染，无有机物等的残留，有望实现更多用途。

32、4、本发明通过在宿主菌内构建裂解系统实现了其自我清除和所生产胞内物质释放问题，条件可控、准确度高，通过调节rbs位点实现裂解蛋白更加精准的调控。