一种乳酸片球菌及其在降解赭曲霉毒素A中的应用

一种乳酸片球菌及其在降解赭曲霉毒素a中的应用
技术领域
1.本发明涉及微生物及饲料添加剂的技术领域，尤其涉及一种乳酸片球菌及其在降解赭曲霉毒素a中的应用。


背景技术：

2.霉菌毒素是由寄生在上面的真菌所产生的结构各异的次级代谢产物，在食品和饲料的加工、运输和贮存过程中都会产生，广泛存在于食品、动物饲料及其原料中。据联合国粮食及农业组织统计，全世界约25％的粮食作物受霉菌毒素污染，严重威胁人类和动物健康。
3.赭曲霉毒素是曲霉属(aspergillus)和青霉属(penicillium)的某些菌种产生的一组有毒代谢产物，是l-β-苯基丙氨酸与异香豆素的联合，是继黄曲霉毒素b1后被确定为又一类具有很强毒性的霉菌毒素。依其发现顺序分别称为赭曲霉毒素a(ochratoxin a，ota)、赭曲霉毒素b(otb)和赭曲霉毒素c(otc)，其中ota生物半衰期最长，毒性最大。ota主要污染粮食、花生、蔬菜等农作物。动物摄食含ota的饲料后会导致ota在体内蓄积，引起动物的急性和慢性毒性。人们通过进食被ota污染的农作物和动物组织受到危害。现有研究发现ota的危害主要表现为：
①
降低采食量和生产性能；
②
降低机体的免疫力和抗氧化能力；
③
引起肾脏病变和坏死；
④
可视黏膜出血，
⑤
肠炎，脱水多尿，伴随蛋白尿和糖尿；
⑥
妊娠母畜子宫黏膜出血，发生流产。hamilton等于1982年首次报道了大规模的火鸡赭曲霉毒素中毒，此后，在美国、加拿大、欧洲各国及我国均有大量动物赭曲霉毒素中毒的报道，给畜牧业造成了严重的经济损失，给人类健康也带来了潜在的危害。
4.目前，在实际生产中采取了一些措施来防控霉菌毒素污染，取得了一定的效果。农作物霉菌毒素的脱毒方法主要包括三种，分别是物理、化学和生物脱毒法。物理脱毒法主要是通过干燥、吸附等措施去除饲料中的霉菌毒素，但人力物力投入成本较高，影响饲料产品的外观，且效果一般。化学脱毒法通过化学反应将霉菌毒素转变成其他物质或用化学试剂对霉菌毒素进行萃取，来达到脱毒的目的，但同时会破坏饲料的营养特性。生物脱毒法则是近年来兴起的方法，其是利用某些酶或者能产生毒素降解酶的微生物，将霉菌毒素进行生物降解，以去除毒性。与物理和化学脱毒法相比，生物脱毒法具有不添加有害化学物质，实施条件温和，不会造成营养价值的丢失，操作简单方便等有点，是目前霉菌毒素降解的重要研究方向。
5.益生菌是指“当摄入一定量时能对宿主的健康有作用的微生物活体”，主要包括乳酸菌类、双歧杆菌类、芽孢杆菌类、光合细菌类和酵母类等。研究表明，益生菌能通过竞争性排斥病原、增强肠道屏障功能来防止肠道感染，维持肠道菌群平衡，提高免疫机能。近年来有研究报道益生菌具有降解霉菌毒素的作用，比如枯草芽孢杆菌可降解伏马毒素，乳酸菌可降解黄曲霉毒素或呕吐毒素。目前也有益生菌降解赭曲霉毒素a的报道，比如有研究者从泰国豆酱中分离出一株地衣芽孢杆菌，可降解黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a，降解率分别为74％和92.5％，且能够抑制产毒真菌的生长，但该研究未对地衣芽孢杆菌的动物安全性进
行评价，菌株安全性未知。有研究者从猪的肠道内容物中分离出一株对ota具有降解能力的双形真杆菌(eubacterium biforme)，降解率达75％以上，然而目前针对该菌株的相关研究较少，临床应用时缺乏足够的理论支撑，暂无法将其应用于生产。目前已知的具有ota降解能力的菌株中，只有极少数进行了动物安全性评估，菌株安全性未知，且大部分未研究菌株在动物体内的保护作用，限制了其在实际生产中的应用。因此，对安全高效ota降解菌的筛选研究极为重要。


技术实现要素：

6.为了克服现有技术中存在的至少一个问题，本发明通过收集大量自然界样品，筛选分离出一株能够降解赭曲霉毒素a(ota)的乳酸片球菌，其通过动物实验验证其安全性和有效性。
7.理论上，ota是由异香豆素、苯丙氨酸及不同结构基团(主要是甲基、乙基)组成的衍生物，能够降解香豆素、苯丙氨酸的菌株大概率也能降解ota，已有多个研究表明，香豆素、异香豆素作为ota的替代物来筛选ota降解菌是可行的。且香豆素相较于ota，更加的安全、廉价、对环境的污染程度也更小，所以初期需要进行大量筛选工作时，选用香豆素来替代ota进行初步筛选。本发明通过收集大量自然界样品，将样品稀释后加到以香豆素为唯一碳源的基础培养基中，筛选出能够降解香豆素作为碳源生长的菌株。在香豆素预实验的基础上，进行形态学、生理生化、分子学鉴定，从初筛得到的菌株挑选出益生菌，再应用ota筛选出能降解ota的益生菌，具体为采用加了一定浓度ota的mrs培养基进行复筛，从而从水牛粪便中筛选到能够降解ota的益生菌，其为乳酸片球菌，命名为njb421。本发明还对该菌株进行生物学特性研究和安全性评价，进一步将该菌饲喂ota处理下的小鼠，其能有效减轻ota引起的脏器损伤，提高小鼠的抗氧化能力。
8.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.本发明的第一个方面是提供一种乳酸片球菌，其16srdna序列如seq id no.1所示。
10.进一步地，所述乳酸片球菌的名称为njb421，其分类命名为pediococcus acidilactici，其保藏编号为cgmcc no.23554，保藏日期为2021年10月09日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
11.进一步地，所述乳酸片球菌njb421的微生物学特性为：革兰氏阳性菌，过氧化氢酶试验阴性，细胞形态为球状，在mrs培养基上单菌落大小约为1～3mm，颜色呈白色，不透明，菌落表面光滑，略向上凸起，边缘整齐；乳酸片球菌njb421在57℃下处理2小时后的活菌数大于107cfu/ml；乳酸片球菌njb421可在ph值2.0以上的酸性环境生长，耐胆盐能力强。更进一步地，所述乳酸片球菌njb421具有良好生长特性，对46℃、ph＝3.0的酸性环境、0.3％胆盐、1.4％胰蛋白酶具有较好耐受性，且用该菌株饲喂老鼠21天，对小鼠安全无害。
12.进一步地，所述乳酸片球菌njb421具有降解香豆素和ota的能力。在一具体实施方案中，乳酸片球菌njb421在ph 6.8～7.0，37℃下处理2mg/l的ota毒素24h、48h和72h后对ota的降解率分别为21.58％、48.53％、48.52％；更进一步地，乳酸片球菌njb421可缓解ota引起的肠道、肝脏和肾脏损伤，提高小鼠的抗氧化性能。
13.本发明的第二个方面是提供一种微生物菌剂，其包含如本发明的第一个方面中任一所述的乳酸片球菌；或由所述乳酸片球菌培养制备获得。
14.进一步地，所述微生物菌剂的活菌浓度为2
×
108～2
×
10
10
cfu/ml。优选，1
×
109～5
×
109cfu/ml，更优选2
×
109cfu/ml。在实际应用时，上述微生物菌剂可稀释至预定浓度进行使用。
15.本发明的第三个方面是提供一种本发明的第一个方面中任一所述的乳酸片球菌、或本发明的第二个方面中任一所述的微生物菌剂在降解香豆素和/或赭曲霉毒素a中的应用。
16.进一步地，所述应用包括：将所述乳酸片球菌或微生物菌剂制备成缓解由赭曲霉毒素a引发的症状的产品。
17.进一步地，所述产品包括饲料、食品、药品及添加剂。
18.进一步地，所述症状包括：脏器损伤、食量下降、抗氧化能力降低，其中所述脏器损伤包括：肠道损伤、肝脏损伤和肾脏损伤。
19.在一具体实施方案中，灌喂乳酸片球菌njb421对小鼠体重、脏器指数、血清丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、碱性磷酸酶(alp)活力及尿素氮(bun)、肌酐(crea)、总蛋白(tp)含量、肝、肾、回肠组织总抗氧化能力(t-aoc)及丙二醛(mda)含量均未出现异常，对肝脏、肾脏和回肠均未出损伤，这表明乳酸片球菌njb421安全无害。
20.在一具体实施方案中，灌喂乳酸片球菌njb421可改善ota引起的下述指标的变化，所述指标包括由ota引起的小鼠体重下降，脏器指数降低，血清cr、bun、ast和alt含量上升，肾脏、肝脏和肠道明显的病理学变化，肾脏和肝脏α-sma、vimentin和tgf-β的转录水平升高，回肠zo-1、occludin和claudin-1的转录水平下降，肾脏、肝脏和肠道促炎细胞因子il-6、il-1β和tnf-α的转录水平及mda含量升高，t-aoc下降。
21.本发明的第四个方面是提供一种降解香豆素和/或赭曲霉毒素a的方法，其包括步骤：将本发明的第一个方面中任一所述的乳酸片球菌的菌液活化、培养，获得微生物菌剂，将所述微生物菌剂以预定剂量施用于待处理对象，进行香豆素和/或赭曲霉毒素a的降解。
22.进一步地，所述微生物菌剂的具体制备步骤包括：将保存在-80℃超低温冰箱中的乳酸片球菌njb421，快速解冻后，接种于斜面活化培养基(即mrs固体培养基)上，37℃，培养48h；如此连续活化3次后，再接种于1l mrs液体培养基中，37℃，培养24h，得到乳酸片球菌菌剂；后调整菌剂的cfu以获得所述微生物菌剂。
23.进一步地，所述微生物菌剂的活菌浓度为2
×
108～2
×
10
10
cfu/ml。优选，1
×
109～1
×
10
10
cfu/ml，更优选2
×
109cfu/ml。在实际应用时，上述微生物菌剂可稀释至预定浓度进行使用。
24.进一步地，所述mrs液体培养基的组成为：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉10.0g、酵母浸粉5.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温80 1.0g、蒸馏水1000ml，ph为6.8
±
0.2，115℃高压蒸汽灭菌30min，分装备用。
25.进一步地，所述赭曲霉毒素a的降解率为5～50％，优选20～50％。在一具体实施方案中，乳酸片球菌njb421在ph 6.8～7.0，37℃下处理2mg/l的ota毒素24h、48h和72h后对ota的降解率分别为21.58％、48.53％、48.52％。
26.进一步地，所述待处理对象为动物，所述动物包括但不限于：猪、鸡、鸭、鼠等。
27.进一步地，在一具体实施方案中，所述待处理对象为小鼠，所述微生物菌剂的剂量为108～5
×
108cfu/只，所述施用频率为连续灌服14～28天。优选所述微生物菌剂的剂量为2
×
108cfu/只，所述施用频率为连续灌服21天。上述条件适用于本发明具体实施例中安全性和减缓ota损伤的试验中。
28.与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
29.本发明首次发现乳酸片球菌njb421具有降解赭曲霉毒素a的能力。上述乳酸片球菌njb421具有良好生长特性，本发明对其益生效果进行了体外法鉴定，乳酸片球菌njb421对46℃、ph＝3.0的酸性环境、0.3％胆盐、1.4％胰蛋白酶具有较好耐受性，在ph 6.8～7.0，37℃下处理2mg/l的ota毒素48h后对ota的降解率达到48.53％，结果显示乳酸片球菌njb421能够耐酸、耐胆盐，抵抗胃肠道的内环境，具备益生菌的潜力。本发明还对乳酸片球菌njb421对ota诱发小鼠机体损伤的保护作用进行了体内试验，采用本发明的乳酸片球菌njb421饲喂老鼠21天后，结果表明对小鼠安全无害，乳酸片球菌njb421对ota诱发小鼠机体损伤有一定的保护作用，可缓解ota引起的肠道、肝脏和肾脏损伤，提高小鼠的抗氧化性能，其可广泛在饲料、食品、药品及相关添加剂中进行应用。
附图说明
30.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明仅用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
31.图1为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421的菌落形态图。
32.图2为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421的革兰氏染色图。
33.图3为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421的进化树。
34.图4为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421对ota的体外降解率的示意图。
35.图5为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421的生长曲线图。
36.图6为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421菌液od600值与活菌数之间关系的直线回归方程。
37.图7为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421的耐热性试验结果示意图。
38.图8为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421的耐酸性试验结果示意图。
39.图9为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421的耐胆盐试验结果示意图。
40.图10为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici i)njb421的耐胰蛋白酶试验结果示意图。
41.图11为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421对正
常小鼠体重及采食量的影响示意图。
42.图12为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421对正常小鼠脏器指数及小肠长度的影响示意图。
43.图13为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421移位试验结果示意图。
44.图14为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421对正常小鼠血清生化指标的影响示意图。
45.图15为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421对正常小鼠抗氧化能力的影响示意图。
46.图16为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421对正常小鼠脏器病理学变化的影响示意图。
47.图17为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421对ota处理小鼠体重及采食量的影响示意图。
48.图18为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421对ota处理小鼠脏器指数及小肠长度的影响示意图。
49.图19为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421对ota处理小鼠肾脏病理学变化及血清肌酐和尿素氮含量的影响示意图。
50.图20为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421对ota处理小鼠肾脏纤维化指标和促炎细胞因子mrna水平的影响示意图。
51.图21为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421对ota处理小鼠肝脏病理学变化及血清ast和alt含量的影响示意图。
52.图22为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421对ota处理小鼠肝脏纤维化指标和促炎细胞因子mrna水平的影响示意图。
53.图23为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421对ota处理小鼠肠道病理学变化、肠道屏障功能和促炎细胞因子mrna水平的影响示意图。
54.图24为本发明一实施例中乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421对ota处理小鼠抗氧化能力的影响示意图。
具体实施方式
55.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
56.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
57.在下述实施例中，使用的培养基及相关试剂如下：
58.lb固体培养基：胰蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、氯化钠10.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000ml，ph为7.0
±
0.1，121℃高压蒸汽灭菌15min，分装备用。
59.lb液体培养基：胰蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、氯化钠10.0g、蒸馏水1000ml，ph为7.0
±
0.1，121℃高压蒸汽灭菌15min，分装备用。
60.mrs固体培养基：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉10.0g、酵母浸粉5.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、琼脂20.0g、吐温80 1.0g、蒸馏水1000ml，ph为6.8
±
0.2，115℃高压蒸汽灭菌30min，分装备用。
61.mrs液体培养基：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉10.0g、酵母浸粉5.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、吐温80 1.0g、蒸馏水1000ml，ph为6.8
±
0.2，115℃高压蒸汽灭菌30min，分装备用。
62.以香豆素为唯一碳源的营养缺陷型固体培养基：硫酸铵2.0g、硫酸镁0.2g、氯化钙0.01g、硫酸亚铁0.001g、磷酸氢二钠1.5g、磷酸二氢钾1.5g、香豆素1.7g、琼脂20.0g、蒸馏水1000ml，ph为7.0
±
0.1，121℃高压蒸汽灭菌15min，分装备用。
63.实施例1-乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421的分离与鉴定
64.本实施例采用下述方法获得具有降解ota的乳酸片球菌：
65.(1)菌株njb421的分离
66.1)菌株的分离培养
67.分别收集牛、羊、犬的新鲜粪便、鸡的肠道内容物、发霉的土壤，及酸奶、乳酸菌饮料等样品用于筛选。方法参考《伯杰细菌鉴定手册》，具体操作如下：按照样品和无菌生理盐水为1：10的比例充分震荡混匀(具体为：称取0.5g固体样品或用移液器取0.5ml液体样品，加至5ml灭菌生理盐水中，充分震荡混匀，分别取0.1ml混悬液与0.9ml的灭菌生理盐水于无菌ep管中混匀，再从该混悬液中取0.1ml与0.9ml灭菌生理盐水充分混匀，重复多次)，后将样品进行十倍倍比稀释数次，后从稀释倍数为105、106、107的混悬液中取0.1ml混悬液，均匀涂布在lb固体培养基表面，并做好标记，于37℃恒温培养箱中倒置培养48小时。观察lb固体培养基上菌落形态，从稀释倍数适中的培养基表面分别挑选形态、大小不尽相同的细菌单菌落，分别接种于5ml lb液体培养基中，做好标记，于37℃恒温培养箱中静置培养48小时。观察细菌培养液是否浑浊，将其充分混匀后分别取0.01ml培养液，用接种环在lb固体培养基表面进行分区划线，并标记，于37℃恒温培养箱中倒置培养48小时。观察培养基表面的细菌菌落形态，从每个培养基上挑选若干个(例如2-3个)形态规则的单菌落，分别接种于5ml lb液体培养基中，做好标记，于37℃恒温培养箱中静置培养48小时。重复以上划线和挑单菌落接种步骤至少三次，直至lb固体培养基表面的单菌落形态、大小相同，为同一细菌，这表明菌株纯化完成。
68.取上述纯化的细菌培养液0.1ml，使用灭菌玻璃涂布器将其均匀涂布在以香豆素为唯一碳源的营养缺陷型固体培养基表面，做好标记，于37℃恒温培养箱中倒置培养1-7天。每日观察各培养基表面细菌菌落生长情况，并记录，若7天后无菌落生长或菌落数量极少，则该菌株无法降解香豆素或降解香豆素的能力极差，将其弃去。选择培养基表面菌落生
长较多且生长速度较快的菌株，接种5ml lb液体培养基中，做好标记，于37℃恒温培养箱中静置培养48小时，用于后续试验。
69.然后将上述筛选出的菌株培养液100微升涂布在mrs固体培养基上，做好标记，37℃培养24-48小时，再从每个平板上分别随机挑选15-20个外观不一的单菌落，在mrs平板上划线纯化至少三次，获得纯化的可降解香豆素的菌株。观察并记录菌落形态。
70.2)菌株的革兰氏染色
71.取一干净的载玻片，在其上滴加0.01ml细菌培养液，并使菌液在载玻片上尽量铺开，避免涂片过厚。以载玻片背面快速通过酒精灯外焰数次，固定涂片(避免载玻片过热，以不烫手为宜)。滴加结晶紫染色液完全覆盖菌液所在区域，染1min，水洗，自然晾干；滴加碘液完全覆盖菌液所在区域，媒染1min，水洗，自然晾干；滴加碱性品红乙醇溶液50s，水洗，自然晾干；在载玻片上滴加番红染色液完全覆盖菌液所在区域，染色1min，水洗，自然晾干。在普通光学显微镜上观察，若菌体呈紫色为阳性，菌体呈红色为阴性。上述初次筛选得到的香豆素降解菌进行革兰氏染色、过氧化氢酶试验后，挑选出革兰氏阳性菌。
72.3)16s dna序列同源性分析
73.对筛选出的革兰阳性菌进行微量生化鉴定，初步筛选出可能为益生菌的菌株。用北京索莱宝科技有限公司的细菌基因组dna提取试剂盒提取菌株的总dna，后测定其dna浓度，并进行pcr扩增。然后分别取5微升pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，验证pcr是否成功。并将条带单一清晰明亮的菌株扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测序所得16srdna序列拼接结果在ncbi genbank数据库中与相关序列进行相似性比对，利用blast程序进行多重比对，确定菌株的种属，采用mega x软件(mega 5.0软件)以邻接法构建菌株系统进化树。
74.上述pcr体系为25微升(12.5微升master mix，1.25微升上游引物，1.25微升下游引物，适量dna模板，加双蒸水至25微升)，pcr扩增参数：预变性，94℃，4min，1次循环；变性，94℃，10s，34次循环；退火，55℃，20s，34次循环；延伸，72℃，30s，34次循环；末端延伸，72℃，5min，1次循环。使用细菌16srdna扩增引物上游引物27f：5-agagtttgatcctggctcag-3(seq id no.2)和下游引物1492r：5-ggttacctttgttacgactt-3(seq id no.3)。
75.(2)菌株njb421对赭曲霉毒素a的体外降解效果
76.选择测序比对结果为乳酸菌的菌株，将其分别接种于mrs液体培养基，在37℃厌氧环境下培养48h至生长对数期，利用分光光度计将各细菌培养液od600值调至0.8左右，保证菌液浓度相同，分别取0.5ml各细菌培养液，加至含有2μg/ml ota的液体培养基中，混匀，每组三个重复，37℃静置培养72小时，每隔24小时用ota酶联免疫检测试剂盒测定培养液中的ota含量，以不接菌的含ota液体培养基作为对照，计算菌株对ota的降解率。
77.(3)实施结果
78.1)形态学鉴定结果
79.对处于对数生长期且菌落大小稳定的菌株njb421在营养缺陷型培养基上的单菌落形态进行描述，包括菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态及菌落边缘状态。所得单菌落大小约为1～2mm，颜色呈白色，不透明，菌落表面光滑，边缘整齐(见图1)。其次对分离并筛选到的菌株njb421进行革兰氏染色后，采用光学显微镜观察菌体形态。革兰氏染色呈阳性，细胞形态为圆球状，直径不超过2μm，不呈链状排列(见图2)。
80.2)分子生物学鉴定结果
[0081][0082][0083]
将测序的结果在genbank数据库中与相关序列进行相似性比对，后并用mega x软件构建系统发育树，结果显示菌株njb421与乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)属于同一发育分支(见图3)。
[0084]
3)菌株njb421对ota的降解能力
[0085]
将乳酸片球菌njb421接种于含ota的培养基中培养24h、48h和72h，对其降解ota的能力进行测定，结果见图4。结果显示：ota浓度由2.00g/ml分别降至1.57g/ml、1.03g/ml、1.03g/ml，乳酸片球菌njb421对ota的降解率分别为21.58％、48.53％、48.52％。结果表明，随着时间的延长，njb421对ota的降解能力在48h达到峰值，且48h后ota未重新释放到培养基中。
[0086]
上述乳酸片球菌(pediococcus acidilactici)njb421已进行保藏，其保藏编号为cgmcc no.23554，保藏日期为2021年10月09日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0087]
实施例2-乳酸片球菌njb421的生长曲线测定
[0088]
将乳酸片球菌njb421的菌液活化后，按照5％的接种量接种于mrs液体培养基中，37℃厌氧环境下静置培养48h，每3小时吸取震荡混匀的菌液4ml置于玻璃吸光皿中，培养24小时后，每隔6小时吸取菌液4ml置于玻璃吸光皿中，使用分光光度计测定其od600值，用等体积mrs液体培养基进行分光光度计调零，重复三次。横坐标为njb421培养时间(小时)，纵坐标为对应od600的平均值，绘制njb421的生长曲线。通过生长曲线可以看出，乳酸片球菌njb421培养48h，能够直观清晰地看出菌株出现迟缓期、对数期和稳定期，其中迟缓期为0～
3h，对数期为3～30h，稳定期为30～48h(见图5)。
[0089]
将乳酸片球菌njb421活化后，以5％的比例接种于mrs液体培养基，37℃厌氧环境下静置培养48小时，在培养时间内选取5个时间点吸取震荡混匀的菌液4ml置于玻璃吸光皿中，使用分光光度计测定其od600值，用等体积mrs液体培养基进行分光光度计调零，重复三次，取平均值。同时于每个时间点吸取震荡混匀的菌液1ml置于ep管中，使用无菌生理盐水进行十倍倍比稀释，各取100μl稀释液均匀涂布于mrs平板上，37℃静置培养48h，选择菌落个数位于30-300范围内的平板，使用平板直接计数法进行菌落计数，重复三次，取平均值，并计算出活菌数(cfu/ml)。以od600为横坐标，对应活菌数为纵坐标，绘制njb421菌液od600值与活菌数之间关系的直线回归方程(见图6)。
[0090]
实施例3-乳酸片球菌njb421的生物学特性研究
[0091]
(1)耐热性试验
[0092]
为了了解乳酸片球菌njb421对不同高温的耐受性，便于日后优化加工条件，对乳酸片球菌njb421进行耐高温试验，其步骤简述如下：
[0093]
调节电热水浴锅水温至37、40、43、46℃，使用温度计测量5min确保水温保持恒定。将乳酸片球菌njb421的菌液活化后按5％接种量接种至mrs液体培养基中，37℃厌氧环境下下静置培养48h，使其复壮。取5ml菌液于4个灭菌ep管中，分别于37、40、43、46℃下水浴处理10、20、30min，以37℃水浴处理的菌液作为对照，使用分光光度计测定其od600值，带入od600值与活菌数的标准曲线计算，将od600换算为活菌数，重复三次。
[0094]
实验结果(见图7)发现：在40、43、46℃下作用30分钟后，乳酸片球菌njb421菌液中活菌数与37℃作用30分钟没有差异，仍可达107cfu/ml以上，说明乳酸片球菌n421对40、43、46℃有较好的耐受性。
[0095]
(2)耐酸性试验
[0096]
为了验证乳酸片球菌njb421对不同ph值酸性环境的耐受性，对乳酸片球菌njb421进行耐酸性试验，其步骤简述如下：
[0097]
将乳酸片球菌njb421的菌液活化后按5％接种量接种至mrs液体培养基中，37℃厌氧环境下下静置培养48h后，振荡混匀。取1ml菌液接种至20ml不同ph值(ph为2.0、3.0、4.0、5.0和6.0)的mrs液体培养基中，同时接种1ml菌液于mrs液体培养基(ph＝6.8)中作为对照。37℃厌氧环境下静置培养3h，每隔1h吸取4ml混匀的菌液，使用分光光度计测定其od600值，带入od600值与活菌数的标准曲线计算，将od600换算为活菌数，重复三次。
[0098]
实验结果(见图8)发现：与对照组相比，乳酸片球菌njb421培养1小时后，在各ph值的培养基中，活菌数未出现明显差异；2小时后，ph＝2.0培养基中菌液浓度极显著下降(p＜0.01)；3小时后，ph＝2.0培养基中菌液浓度下降极显著(p＜0.01)，ph＝3.0培养基中菌液浓度下降显著(p＜0.05)，同时发现与培养0小时相比，ph＝3.0培养基中菌液浓度明显增加，这表明乳酸片球菌njb421可耐受ph＝3.0的酸性环境。
[0099]
(3)耐胆盐试验
[0100]
为了验证乳酸片球菌njb421对不同浓度胆盐的耐受能力，对乳酸片球菌njb421进行耐胆盐试验，其步骤简述如下：
[0101]
将乳酸片球菌njb421的菌液活化后按5％接种量接种至mrs液体培养基中培养48h，振荡混匀后，取1ml菌液分别接种至20ml不同胆盐浓度(0.1％、0.3％和0.5％)的mrs液
体培养基中，同时接种1ml菌液于20ml mrs液体培养基(未添加猪胆盐)中作为对照。37℃厌氧环境下静置培养3小时，每隔1小时吸取4ml培养液，使用分光光度计测定其od600值，带入od600值与活菌数的标准曲线计算，将od600换算为活菌数，重复三次。
[0102]
实验结果(见图9)发现：培养1、2、3小时后，与不添加胆盐的mrs液体培养基相比，乳酸片球菌njb421在胆盐浓度为0.1％、0.2％、0.3％的mrs液体培养基中的菌液浓度均未出现明显差异，这说明乳酸片球菌njb421可耐受0.3％胆盐浓度。
[0103]
(4)耐胰蛋白酶试验
[0104]
为了验证乳酸片球菌njb421对不同浓度胰蛋白酶的耐受能力，对乳酸片球菌njb421进行耐胰蛋白酶试验，其步骤简述如下：
[0105]
将乳酸片球菌njb421的菌液活化后按5％接种量接种至mrs液体培养基中培养48h，振荡混匀后，取1ml菌液分别接种至20ml不同胰蛋白酶浓度(1.0％、1.2％和1.4％)的mrs液体培养基中，同时接种1ml菌液于20ml mrs液体培养基(未添加胰蛋白酶)中作为对照，37℃厌氧环境下静置培养3小时，每隔1小时吸取4ml培养液，使用分光光度计测定其od600值，带入od600值与活菌数的标准曲线计算，将od600换算为活菌数，重复三次。
[0106]
实验结果(见图10)发现：培养1、2、3小时后，与不添加胰蛋白酶的mrs液体培养基相比，乳酸片球菌njb421在胰蛋白酶浓度为1.0％、1.2％、1.4％的mrs液体培养基中的菌液浓度均未出现明显差异，这说明乳酸片球菌njb421可耐受1.4％胰蛋白酶浓度。
[0107]
实施例4-乳酸片球菌njb421的安全性评价
[0108]
本实施例以正常小鼠为实施对象，采用灌喂的方法，评估乳酸片球菌的安全性。
[0109]
(1)乳酸片球菌制剂的生产
[0110]
将保存在-80℃超低温冰箱中的乳酸片球菌njb421，快速解冻后，接种于斜面活化培养基上，37℃，培养32h；如此连续活化3次后，再接种于1l mrs液体培养基中，37℃，培养24h，得到乳酸片球菌菌剂；后调整菌剂的cfu到2
×
109/ml，用于灌胃小鼠。
[0111]
(2)实施动物与分组
[0112]
选取18-20g的spf级c57bl/6小鼠12只，随机分为2组，每组6只鼠。a组为对照组灌服无菌生理盐水；b组为灌喂乳酸片球菌njb421，灌服2
×
108cfu/只的量菌液，每天上午九点灌胃一次，连续灌服21天。实验鼠房控制温度湿度恒定，自然光照，小鼠自由采食、饮水，每7天清扫鼠笼一次。实验过程中，每天观察并记录小鼠的状态，存活情况，有无临床异常症状等。
[0113]
(3)样品采集与测定
[0114]
在正式试验的第21天，禁食24h，将小鼠称重后眼球取血，室温静置30min，于3000r/min，4℃离心10min，收集血清，分装于1.5ml离心管中，在-80℃保存，用于测定血清中总蛋白(tp)、天冬氨酸氨基转移酶(ast)、丙氨酸氨基转移酶(alt)、碱性磷酸酶(alp)、肌酐(cr)和尿素氮(bun)的含量。
[0115]
采血结束后，处死小鼠，解剖分离肝脏、肾脏、回肠、心脏和脾脏，分别拍照，观察有无明显病变，并称重计算脏器指数(脏器指数以脏器重量/体重
×
100％表示)，然后将肝脏、肾脏和回肠组织纵向切成大小约为0.5cm
×
0.5cm
×
0.5cm的小块，立即将其放入中性4％的甲醛固定液中固定保存，用于制作组织病理切片；剩余组织迅速分离并用冷的平衡盐溶液清洗，后液氮冷冻，保存于-70℃，用于检测总抗氧化能力(t-aoc)和丙二醛(mda)含量。
[0116]
(4)测定指标及方法
[0117]
1)ast、alt、alp和tp活性分析
[0118]
ast、alt、alp和tp试剂盒购自南京建成生物工程研究所，按说明书进行检测。
[0119]
2)cr和bun含量分析
[0120]
cr用肌氨酸氧化酶法分析，bun用脲酶法分析。试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
[0121]
3)t-aoc和mda含量分析
[0122]
t-aoc采用abts法分析，mda含量采用tba法分析。试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
[0123]
4)乳酸片球菌njb421的移位试验
[0124]
无菌取出肾脏、肝脏、回肠，以组织与生理盐水1：1(m/v)的比例加入适量灭菌生理盐水，用组织匀浆仪研磨后，分别取100μl各组织的匀浆液，用灭菌涂布器涂布于含1％(w/v)香豆素的mrs琼脂平板表面，37℃厌氧环境下静置培养48小时，观察是否有菌落生长。
[0125]
5)组织病理学检查
[0126]
浸泡于通用型组织固定液中的肾脏、肝脏和回肠送至南京烁朴生物科技有限公司进行常规石蜡包埋及染色，其中肾脏用he及masson染色，肝脏用he及天狼星红染色，回肠用he染色。
[0127]
(5)实施结果
[0128]
1)乳酸片球菌njb421对小鼠生长状况的影响
[0129]
试验过程中小鼠未出现腹泻、死亡等情况，精神状况良好。连续灌胃njb421菌液21天后，与对照组相比，试验组小鼠体重正常增长，采食量无明显异常(见图11)；试验组小鼠的肾脏、肝脏、心脏和脾脏指数及小肠长度均无显著差异(见图12)。细菌易位试验显示njb421在肾脏、肝脏的培养基上未见菌落生长，小肠的培养基上大量生长，表明乳酸片球菌njb421在小鼠体内只定植于肠道，未发生细菌移位现象(见图13)。
[0130]
2)乳酸片球菌njb421对小鼠血清生化指标的影响
[0131]
连续灌胃njb421菌液21天后，试验组及对照组的tp、alt、ast、alp、bun及crea的含量均在标准范围内，且试验组与对照组相比无显著差异(见图14)。
[0132]
3)乳酸片球菌njb421对小鼠抗氧化指标的影响
[0133]
连续灌胃njb421菌液21天后，与对照组相比，试验组小鼠肾脏、肝脏、回肠组织的t-aoc和mda含量未出现明显差异(见图15)。
[0134]
4)乳酸片球菌njb421对小鼠脏器病理变化的影响
[0135]
本次试验的肾脏组织切片采用苏木精-伊红染色法(he染色)及masson染色，肝脏组织切片采用苏木精-伊红染色法(he染色)及天狼星红染色，回肠组织切片采用苏木精-伊红染色法(he染色)。光学显微镜观察结果如下图16所示：与对照组相比，乳酸片球菌njb421实验组的肾脏、肝脏、回肠组织未出现明显病理变化，表明乳酸片球菌njb421对小鼠肾脏、肝脏、回肠安全无损伤。
[0136]
实施例5-乳酸片球菌njb421的应用
[0137]
本实施例将乳酸片球菌njb421应用于ota处理小鼠，验证其实际应用效果。
[0138]
(1)乳酸片球菌菌剂的生产
no.23)，引物送invitrogen合成。组织中总rna的提取采用trizol试剂盒(takara，china)按照说明书操作进行提取，最后通过1.5％琼脂糖凝胶电泳和蛋白核酸测定仪检测所提取的rna的质量。相关基因mrna水平采用sybr green i染料，参照文献方法在abi prism step one plus detection system(applied biosystems,usa)荧光定量pcr仪上进行扩增和相对定量的数据分析。相关基因相对mrna水平均以β-actin为内参基因按δδct法进行分析比较，结果用2-δδct表示。
[0159]
表3荧光定量pcr引物序列
[0160][0161]
5)实施结果
[0162]
①
乳酸片球菌njb421对小鼠生长状况的影响
[0163]
试验期间小鼠体重和采食量的测定结果见图17。结果显示，每组小鼠在第1-14天精神状态良好，体重增长、采食、粪便及体态特征均正常。从第15天开始灌胃ota，与空白对照组相比，ota组和njb421+ota组小鼠都出现精神沉郁、被毛杂乱、体重下降，经过3天的灌胃菌液后njb421+ota组小鼠精神状况和体重下降有所改善。在第21天试验期满，与对照组相比，ota组和njb421+ota组小鼠体重和采食量下降；与ota组相比，njb421可改善ota引起的小鼠体重和采食量下降。
[0164]
②
乳酸片球菌njb421对ota引起小鼠脏器指数变化的影响
[0165]
剖检观察小鼠，各脏器未出现明显肉眼可见病变。取小鼠肾脏、肝脏、小肠进行称重并计算各脏器指数，结果如图18所示：与对照组相比，ota组肾脏、肝脏、小肠指数明显下降，小肠萎缩，长度显著缩短。与ota组相比，njb421+ota组的肾脏指数显著上升(p＜0.05)，肝脏和小肠指数上升，小肠长度增加。
[0166]
③
乳酸片球菌njb421对ota诱发小鼠肾脏损伤的影响
[0167]
乳酸片球菌njb421对ota诱发小鼠肾脏损伤的影响结果如图19-20所示。肾脏he染色及masson染色结果显示ota组小鼠肾小球边界不清、肾小管内有絮状渗出物、管腔狭窄、存在大量炎性细胞浸润、大量胶原纤维沉积，njb421+ota组小鼠肾小管内有絮状渗出物，管腔狭窄、少量胶原纤维沉积(图19)。与对照组相比，ota组小鼠血清肌酐含量显著增加、尿素氮含量极显著增长(图19)，肾脏α-sma、vimentin、tgf-β及il-6、il-1β、tnf-α的相对表达量增长极显著(图20)。与ota组相比，njb421+ota组小鼠血清尿素氮含量显著下降、肌酐含量下降(图19)，肾脏中α-sma、vimentin、tgf-β、il-6、tnf-α的mrna表达量极显著下降、il-1β的表达量显著下降(图20)。试验结果表明连续7天灌胃0.8mg/kg
·
dw的ota可引起小鼠出现
肾功能异常、肾脏出现纤维化损伤及严重的炎症反应，灌喂乳酸片球菌njb421对ota引起的小鼠肾脏损伤有一定的保护作用。
[0168]
④
乳酸片球菌njb421对ota诱发小鼠肝脏损伤的影响
[0169]
乳酸片球菌njb421对ota诱发小鼠肝脏损伤的影响结果如图21-22所示。肝脏he染色及天狼星红染色结果显示ota组肝索紊乱、肝小叶结构及肝细胞界限不清、炎性细胞浸润、存在明显胶原纤维沉积，njb421+ota组肝索排列较规则，部分肝小叶结构及肝细胞界限不清、少量炎性细胞浸润(图21)。与对照组相比，ota组小鼠血清ast及alt活力增长极显著(图21)，肝脏α-sma、vimentin、tgf-β及il-6、il-1β、tnf-α的相对表达量极显著上升(图22)。与ota组相比，njb421+ota组小鼠血清alt活力显著下降、ast活力下降(图21)，肝脏中α-sma、vimentin、tgf-β、tnf-α的mrna表达量极显著下降，il-6、il-1β的表达量显著下降(图22)。试验结果表明连续7天灌胃0.8mg/kg
·
dw的ota可引起小鼠出现肝功能异常、肝脏出现纤维化损伤及严重的炎症反应，灌喂乳酸片球菌njb421对ota引起的小鼠肝脏损伤有一定的保护作用。
[0170]
⑤
乳酸片球菌njb421对小鼠肠道损伤的影响
[0171]
乳酸片球菌njb421对ota诱发小鼠肠道损伤的影响结果如图23所示。回肠he染色结果显示ota组小鼠回肠肠绒毛严重断裂溶解、肠壁受损，njb421+ota组小鼠回肠肠绒毛极少数出现断裂(图23)。与对照组相比，ota组回肠组织的zo-1、occludin、claudin-1相对表达量极显著下降，il-6、il-1β、tnf-α的相对表达量极显著上升(图23)。与ota组相比，njb421+ota组小鼠回肠组织的occludin、claudin-1的相对表达量显著上升，il-6、il-1β、tnf-α的mrna 表达量极显著下降。试验结果表明连续7天灌胃0.8mg/kg
·
dw的ota可引起小鼠肠道黏膜损伤、肠道屏障功能障碍及炎症反应，灌喂乳酸片球菌njb421对ota引起的小鼠肠道损伤有一定的保护作用。
[0172]
⑥
乳酸片球菌njb421对小鼠机体抗氧化能力的影响
[0173]
乳酸片球菌njb421对小鼠机体抗氧化能力的影响结果如图24所示。与对照组相比，ota组肾脏及回肠的t-aoc显著下降，肝脏的t-aoc极显著下降；肾脏、肝脏、回肠mda含量极显著上升。与ota组相比，回肠njb421+ota组t-aoc极显著上升，肾mda含量显著下降，肝、回肠mda含量极显著下降。结果表明连续7天灌胃0.8mg/kg
·
dw的ota可降低小鼠肾脏、肝脏、回肠的抗氧化能力，灌喂乳酸片球菌njb421可缓解ota引起的抗氧化能力下降，在一定程度上增强了小鼠抗氧化能力。
[0174]
由上述实施例可知，本发明的乳酸片球菌njb421具有较好的ota毒素降解能力，具有良好生长特性，对46℃、ph＝3.0的酸性环境、0.3％胆盐、1.4％胰蛋白酶具有较好耐受性；且其对小鼠安全无害，可缓解ota引起的肠道、肝脏和肾脏损伤，提高小鼠的抗氧化性能，可广泛应用于饲料、食品、药品及相关添加剂中。
[0175]
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围。