眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30在抗水产动物致病菌中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30在抗水产动物致病菌中的应用。
背景技术：
2.目前，抗生素的滥用问题极其严重，抗生素的残留以及耐药性的问题非常突出，养殖业也同样是抗生素滥用的重灾区。水产养殖行业滥用抗生素，不仅会给动物性食品的安全带来潜在隐患，也会对人类的健康及生存环境造成危害。因此，寻找高效广谱且不易产生耐药性的抗细菌和病毒的药物替代抗生素在水产养殖方面应用成为一项紧迫的任务。
3.抗菌肽是存在于生物体内能抵抗外界微生物侵害的一类小分子多肽，它是先天免疫系统的重要组成部分，具有抗微生物活性的作用，对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、真菌和病毒都有抑杀作用。与抗生素相比，抗菌肽不易产生耐药性，在农业、医疗、畜牧、食品及保健品等领域的开发研究与应用方面均有广泛的前景和价值。
4.眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30由34个氨基酸序列组成，目前研究发现对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等人体病原菌具有抑菌效果。
5.水产养殖十大病原菌之一的嗜水气单胞菌是为革兰氏阴性短杆菌，广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌，具传染性，可以产生毒性很强的外毒素。由嗜水气单胞菌感染的疾病一般病势较猛，多为恶性传染病，死亡率很高。
6.本发明以眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30为研究对象，研究其对嗜水气单胞菌、蜡状芽孢杆菌、铜绿假单胞菌等多种细菌的抑菌活性，明确了眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30在抗水产动物致病菌中的应用。
技术实现要素：
7.本发明的目的在于提供一种眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30。
8.本发明的另一个目的在于提供眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30在抗水产动物致病菌中的应用。
9.本发明是通过以下技术方案实现的：眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30，所述眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30由34个氨基酸序列组成；其分子量为4693.71da，等电点为12.08，氨基酸序列为krfkkffkklknsvkkrakkffkkprvigvsipfhhhhhh。
10.进一步的，所述眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30采用毕赤酵母发酵的方法获得。
11.本发明提供眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30在抗水产动物致病菌中的应用。
12.本发明的优点：制得眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30基因工程表达产物，对其抑菌活性进行鉴定，实验表明，眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30发挥抑制/杀灭致病菌作用，对嗜水气单胞菌、蜡状芽孢杆菌、铜绿假单胞菌等多种细菌具有显著的抑菌活性，明确在制备细菌生长抑制剂中的应用。眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30对水产致病菌如嗜水气单胞菌具有显著的抑菌活性，明确在抗水产动物致病菌中的应用。
具体实施方式
13.1.眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30，来自眼镜王蛇（ophiophagus hannah）的毒腺。
14.2.载体及宿主细胞：ppic9k质粒和毕赤酵母gs115菌株均购自于淼灵质粒平台。
15.3.细菌菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
16.除非特别指明，本发明以下实施例所用的试剂均为分析纯试剂，且可从常规渠道商购获得。
17.下面对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：实施例1：眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30的制备s01.眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30表达载体ppic9k-oh-cath30的构建，具体操作如下：pcr扩增眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30基因，获得抗菌肽oh-cath30的目的基因片段，将oh-cath30基因片段与ppic9k载体连接，得到ppic9k-oh-cath30重组载体；s02.将步骤s01获得的重组载体转化入宿主细胞毕赤酵母gs115，并对宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；s03.对步骤s02获得的表达产物进行分离纯化，具体操作为：先对表达产物进行离心，收集上清液，进行透析后，最后进行亲和层析法纯化，获得重组融合多肽oh-cath30。
18.实施例2：眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30的抑菌试验，具体如下：（1）将由按实施例1中的方法所获得的眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30多肽样品过滤除菌后，以眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30的合成肽为标准品应用绘制蛋白浓度标准曲线，根据公式计算出oh-cath30重组多肽的浓度。
19.（2）将多肽溶液倍比稀释至1-32μg/ml。
20.（3）进行mic（minimum inhibitory concentration，最小抑菌浓度）的测定，所述mic测定在96孔细胞培养板上进行。具体操作如下：
①
革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌，革兰氏阴性菌如铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌四种菌悬液的准备：取被测细菌划线于mh平板，培养12个小时；
②
调整菌浓度至6
×
cfu/ml备用。
21.③
每种被测菌按照以下操作设置空白对照组、阳性对照组和待测样品实验组，每组设置2个平行样，每种菌重复3次：ⅰ阳性对照组：加入50μl磷酸钠盐缓冲液和50μl菌悬液；ⅱ空白对照组：加入50μl待测蛋白样品和50μl磷酸钠盐缓冲液；ⅲ样品实验组：加入50μl待测蛋白样品和50μl菌悬液；
④
细菌培养24~48h后，观察mic结果。
22.抑菌实验结果显示，眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30具有广谱的抑菌活性，能够有效的抑制革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌（mic 2~4μg/ml）和蜡状芽孢杆菌（mic 2~4μg/ml），革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌（mic 2~4μg/ml）和嗜水气单胞菌（mic 4~8μg/ml）的生长。结果如表1表1 眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30的抑菌活性
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cgmcc no.：中国微生物菌种保藏编号；mic：最小抑菌浓度，用(a)-(b)表示，(a)表示肉眼可见菌体生长的最高浓度，(b)表示不见菌体生长的最小浓度。
23.从表1数据可知，重组表达获得的眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌均具有较好的抑菌效果。
24.实施例3：眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30在抗水产动物致病菌中的应用（1）.选取恩诺沙星为对照抗生素，进行本抗菌肽制剂与恩诺沙星的对比研究。
25.（2）.以暗纹东方鲀为养殖实验对象，对比抗菌肽与恩诺沙星在抗水产动物致病菌中的抑菌效果养殖实验室中，取12组50g
±
5g的暗纹东方鲀各50尾，放养在12个形态、大小一样的1m
³
实验池中，分别为实验组、空白对照组、对照组1和对照组2，每组为3个实验池，每天7时、10时、16时饱食投喂3次，投喂7天后停喂1天并进行攻毒实验。攻毒实验采用腹腔注射法，注射1.0
×
108cfu/ml浓度的嗜水气单胞菌液0.1ml。
26.完成攻毒实验后，以7天为1个疗程，实验组全程添加4.3mg/kg抗菌肽制剂组，空白对照组不添加任何抗菌肽或抗生素，对照组1全程添加0.5mg/kg恩诺沙星，对照组2全程添加5mg/kg恩诺沙星。
27.疗程结束后，统计每组实验池内鱼的存活率，结果显示：
实验组较空白对照组成活率增加33.7%，实验组较对照组1成活率增加20.2%，实验组较对照组2成活率增加13.2%。
28.结果表明：眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30能显著提高暗纹东方鲀的成活率。