一种鸽轮状病毒A型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒

一种鸽轮状病毒a型环介导等温扩增检测引物组及其试剂盒
技术领域
1.本发明属于禽病学检测领域，具体涉及一种鸽轮状病毒a型环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。


背景技术：

2.人类养鸽历史悠久，鸽经驯化成观赏鸽、赛鸽和肉鸽，拥有较强的免疫系统，加上鸽舍多采用开放式或半开放式，空气流通好，空气新鲜，相比较其他畜禽，鸽生病较少。然而，随着养鸽业规模化、集约化的迅速发展，饲养总量、饲养密度的增加，鸽的饲养方式发生了改变，由于饲养管理水平低，疫病防治意识差，加上鸽的贸易流通频繁(包括信鸽的比赛)，鸽病也越来越多，越来越严重，越来越复杂。近年来鸽病毒性传染病严重威胁着养鸽业，据国内外研究，已经报道的鸽病毒性传染病有鸽新城疫、鸽轮状病毒感染、鸽腺病毒感染、鸽圆环病毒感染、鸽疱疹病毒感染、鸽痘和h9亚型低致病性禽流感等。
3.轮状病毒(rotavirus，rv)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，病毒粒子无囊膜，呈正二十面体，分3层壳体，直径约75nm，在电镜下呈车轮状，由此得名。轮状病毒基因组由11节段双链rna构成，各段长663～3302bp。根据国际病毒分类委员会(international committee on taxonomy of viruses，ictv)的最新分类，轮状病毒属包括a～j共10个病毒种。至今轮状病毒a型、d型、f型和g型均能感染禽类，截至目前轮状病毒a型、d型和g型均能感染鸽子。轮状病毒同一病毒种的不同宿主的毒株之间的基因序列往往差异明显。轮状病毒a型(rotavirus a，rva)一般感染特定种群的动物，此类病毒称为同源株，但偶尔也存在跨种传播现象。轮状病毒a型宿主广泛，广泛存在于哺乳动物和禽类，禽类感染后临床症状主要表现为严重腹泻、脱水、发育不良和死亡率增加。鸽感染轮状病毒a型以呕吐、腹泻、脱水和泄殖腔炎为特征。病鸽在病初精神差，食欲减退，消化功能紊乱。继而萎靡、嗜睡、不食和剧烈腹泻，粪便呈水样，严重脱水，体瘦，贫血，最后因衰竭而死亡。剖检病变主要表现为肝脏坏死和肠道黏膜充血、出血和水肿，另外机体脱水，泄殖腔发炎。轮状病毒a型感染已严重影响了养鸽业的健康发展。
4.病毒分子生物学检测主要有常规pcr方法和实时荧光定量pcr方法，但由于实验设备要求比较高，在基层的检验检疫部门推广应用难。环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是应用4-6条特异性引物，通过bst dna聚合酶，对靶基因进行的一种恒温扩增技术，该技术具有扩增特异性强、灵敏度高、操作快速简便、检测简单等特点，摆脱了对pcr仪、实时荧光定量pcr仪等昂贵仪器的依赖，在基层单位的检测更加方便。相对于现有的其他核酸扩增技术，lamp具有许多独特的优点：
①
lamp检测技术扩增的特异性很高，其特异性引物可以准确识别目的序列，对靶序列具有高度的选择性，减少了非特异性的扩增。
②
lamp技术可以在等温条件下实现扩增，减少了对昂贵、精密实验仪器的要求，同时扩增效率高，仅需要普通水浴锅调节温度(60℃～65℃)，大大降低了检测的费用，特别适合基层和现场使用。
③
lamp检测技术在阳性扩增反应中会产生大量的双链dna混合物和白色焦磷酸镁沉淀，其扩增产物有多种检测方法，双链dna产物可以通过琼脂糖凝胶电
泳检测，白色焦磷酸镁沉淀可通过浊度仪测定，也可以在反应体系中加入金属离子络合剂或金属离子指示剂，然后直接根据颜色的变化或者进行紫外线照射进行分析。目前，还未见针对鸽轮状病毒a型环介导等温扩增反应方法的相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种鸽轮状病毒a型环介导等温扩增检测引物组及试剂盒。
6.本发明的目的通过如下技术方案实现：
7.一种鸽轮状病毒a型环介导等温扩增检测引物组，是由1对外引物pirva-f3和pirva-b3、1对内引物pirva-fip和pirva-bip、1条环引物pirva-lb组成，上述引物序列如下：
8.pirva-f3：5
’‑
aaatcacgcaacagtcgg-3’，
9.pirva-b3：5
’‑
agttatcttctctagatgctgaa-3’，
10.pirva-fip：5
’‑
gacaaatatggctcatttgcatctg-ctgacactaaaaattgaatccg-3’，
11.pirva-bip：5
’‑
acaggtttgagacaggaatacgc-aattattaagcaactcagtcca-3’，
12.pirva-lb：5
’‑
gattccagtaggaccagtatttcc-3’。
13.一种含所述引物组的鸽轮状病毒a型检测试剂盒。
14.所述的鸽轮状病毒a型检测试剂盒的lamp反应体系20μl：溶解后的lamp og reagent 15μl、lamp primer mix 2μl、模板rna 1μl、ddh2o 2μl；其中lamp primer mix浓度：pirva-fip和pirva-bip分别为8μm、pirva-lb为4μm、pirva-f3和pirva-b3分别为1μm；反应条件为：63℃30min。
15.所述鸽轮状病毒a型环介导等温扩增检测引物组在制备鸽轮状病毒a型检测试剂盒中的应用。
16.所述鸽轮状病毒a型环介导等温扩增检测引物组在制备鸽轮状病毒a型快速诊断试剂中的应用。
17.较之现有技术而言，本发明的优点在于：
18.本发明根据鸽轮状病毒a型的基因序列，并进行全基因的比较分析，选择鸽轮状病毒a型的vp6基因设计特异性的lamp引物，根据所设计的lamp引物，建立一种检测鸽轮状病毒a型的环介导等温扩增方法。该方法仅能与鸽轮状病毒a型发生特异性反应(仅鸽轮状病毒a型呈现肉眼可见绿色)，不与其他常见传染病(piadvb、picv、pindv、pihv和h9 aiv)发生特异性反应(其他病原均呈现肉眼可见橙色)，说明本方法特异性强，准确度高，适用性好。
19.敏感性实验表明，本发明所建立的检测方法能检测出浓度低至0.184ng/μl的病毒核酸，说明该该lamp方法的敏感性较高。
20.本发明建立的lamp反应结束后，无需开盖，将ep反应管正置，并轻甩反应液到ep管底部，直接根据颜色变化进行结果判定，这极大的降低了污染的可能性，提高该方法的使用性。
附图说明
21.图1为本发明建立的lamp检测方法的特异性试验结果图，其中，1-2为鸽轮状病毒a型(pirva)；3为鸽腺病毒b型(piadvb)；4为鸽圆环病毒(picv)；5为鸽副黏病毒(pindv)；6为鸽疱疹病毒(pihv)；7为h9亚型禽流感病毒(h9 aiv)；8为ddh2o。
22.图2为本发明建立的lamp检测方法的敏感性试验结果图。其中，1为1.84
×
101ng/μl；2为1.84
×
100ng/μl；3为1.84
×
10-1
ng/μl；4为1.84
×
10-2
ng/μl；5为1.84
×
10-3
ng/μl；6为1.84
×
10-4
ng/μl；7为1.84
×
10-5
ng/μl；8为ddh2o。
具体实施方式
23.下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。
24.本发明提供一种鸽轮状病毒a型环介导等温扩增检测引物组，所述的引物由1对外引物pirva-f3和pirva-b3、1对内引物pirva-fip和pirva-bip、1条环引物pirva-lb组成，上述引物序列如下：
25.pirva-f3：5
’‑
aaatcacgcaacagtcgg-3’，
26.pirva-b3：5
’‑
agttatcttctctagatgctgaa-3’，
27.pirva-fip：5
’‑
gacaaatatggctcatttgcatctg-ctgacactaaaaattgaatccg-3’，
28.pirva-bip：5
’‑
acaggtttgagacaggaatacgc-aattattaagcaactcagtcca-3’，
29.pirva-lb：5
’‑
gattccagtaggaccagtatttcc-3’。
30.本发明所述引物组可用于制备鸽轮状病毒a型检测试剂盒和/或快速诊断试剂。
31.所述的鸽轮状病毒a型检测试剂盒的环介导等温扩增检测方法，其反应体系为20μl，每20μl反应体系中含有：溶解后的lamp og reagent 15μl、lamp primer mix 2μl、模板rna 1μl、ddh2o 2μl；其中lamp primer mix浓度：pirva-fip和pirva-bip分别为8μm、pirva-lb为4μm、pirva-f3和pirva-b3分别为1μm；
32.建立的环介导等温扩增检测方法的反应条件为：63℃30min。
33.下面结合具体实施例，对本发明作更细致的阐述：
34.实施例1
35.一、实验方法
36.1.试验毒株
37.试验用病原鸽轮状病毒a型(pirva)、鸽腺病毒b型(piadvb)、鸽圆环病毒(picv)、鸽副黏病毒(pindv)、鸽疱疹病毒(pihv)、h9亚型禽流感病毒(h9 aiv)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。
38.2.核酸的制备
39.用商品化核酸提取试剂盒说明书提取相关病毒核酸。其中，pirva、pindv、h9 aiv提取病毒核酸rna；piadvb、picv、pihv提取病毒核酸dna。
40.3.lamp的引物设计
41.根据genbank中登录的所有鸽轮状病毒a型的基因序列，并进行全基因的比较分
析，选择鸽轮状病毒a型的vp6基因设计引物，包括1对外引物(pirva-f3和pirva-b3)、1对内引物(pirva-fip和pirva-bip)和1条环引物(pirva-lb)，具体序列见seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4和seq id no.5。
42.4.lamp反应的建立
43.按照冻干lamp橙绿变色扩增试剂盒(该试剂含bst4.0 dna聚合酶，既可以扩增dna，也可以直接扩增rna)说明书在0.2ml ep反应管中配置lamp试验反应液，反应体系为20μl，每20μl反应体系中含有：溶解后的lamp og reagent 15μl、lamp primer mix 2μl、模板rna或dna 1μl、ddh2o 2μl。全部试剂加入完毕后，轻弹ep管底部后，再盖上含og染料的ep管盖(盖上管盖后务必不能再剧烈混合与倒置，以防止将管盖上的og染料溶解，og染料一旦混入反应液中将会终止lamp反应)。反应体系配好后，置于60～65℃进行反应20～45min。反应结束后，将反应的ep管倒置，静置30s。再将ep反应管正置，并轻甩反应液到ep管底部，此时阳性扩增样品将变为肉眼可见绿色，而阴性未发生扩增的管将为橙色。
44.4.1lamp方法的优化
45.本发明通过对lamp primer mix的浓度进行优化，优化后的最佳lamp primer mix浓度如下：pirva-fip/pirva-bip分别为8μm、pirva-lb为4μm、pirva-f3/pirva-b3分别为1μm。
46.本发明通过实验不同温度(60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃)、不同时间(20min、25min、30min、35min、40min、45min)检测引物组反应性能，对反应温度、时间进行优化。结果发现，优化后最佳反应条件为63℃反应30min。
47.5.lamp检测方法的特异性试验
48.取鸽轮状病毒a型(pirva)、鸽腺病毒b型(piadvb)、鸽圆环病毒(picv)、鸽副黏病毒(pindv)、鸽疱疹病毒(pihv)和h9亚型禽流感病毒(h9 aiv)的核酸dna或rna，分别用建立的lamp方法(采用优化后的lamp条件进行反应)进行检测。结果表明，仅鸽轮状病毒a型(pirva)呈现肉眼可见绿色，其他病原(piadvb、picv、pindv、pihv、h9 aiv)均呈现肉眼可见橙色(见图1)。本发明建立的lamp检测方法在自然光条件下可以通过明显的颜色区别进行判定，表明建立的lamp方法具有很好的特异性以及适用性。
49.6.lamp检测方法的敏感性试验
50.利用nanodrop 2000分光光度计测定提取的鸽轮状病毒a型(pirva)的rna浓度为18.4ng/μl，将该rna溶液进行10倍倍比稀释，包括原液在内共设置7个稀释梯度，分别以该7个稀释梯度的rna为模板，用建立的lamp方法(采用优化后的lamp条件进行反应)进行检测。结果显示(如图2所示)，建立的lamp方法可以检测至样本102稀释度，即0.184ng/μl的rna。表明该lamp方法的敏感性较高。
51.7.临床检测应用
52.对收集的33份鸽组织病料经研磨处理后，按照商品化试剂盒提取病毒核酸，利用建立的lamp方法进行检测。结果有6份样品检测后呈现肉眼可见绿色(即为鸽轮状病毒a型感染阳性)，阳性率为18.18％(6/33)。
53.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。