水稻OsBBR3基因及其编码的蛋白与应用

水稻osbbr3基因及其编码的蛋白与应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及水稻osbbr3基因及其编码的蛋白与应用。


背景技术：

2.水稻白叶枯病是全球稻作栽培中一种重要的细菌性病害，利用抗性基因培育抗病品种是目前防治水稻白叶枯病最经济有效的措施。迄今，国内外已报道46个水稻白叶枯病抗性基因(http://www.shigen.nig.ac.jp/rice/oryzabase/gene/list)。然而，来源于野生稻的抗病基因难以利用；部分抗性基因仅具有成株期抗性；大多抗性基因的抗谱较窄。水稻白叶枯病菌具有复杂的多样性和高度的变异性，生产实践表明携带单一主效基因的抗病品种大面积推广种植后，潜在的毒性小种上升为优势小种或病菌变异出现新的毒性小种，极易导致品种抗性丧失。
3.随着分子生物学技术的发展，可以将抗病基因通过杂交或转基因导入感病品种，可以提高改良植物抗病性。因此，鉴定水稻白叶枯病抗病或感病基因，对于改良水稻抗性具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的问题是如何提高或改良植物白叶枯病抗性。
5.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物抗病性中的应用，所述应用可为下述任一种：
6.p1)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物对白叶枯病抗性中的应用，
7.p2)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育抗白叶枯病植物中的应用，
8.p3)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在改良植物抗病性种质资源中的应用，所述抗病性为对白叶枯病的抗性；
9.所述蛋白质可为如下任一所示蛋白质：
10.(a1)氨基酸序列为seq id no.6的蛋白质；
11.(a2)将seq id no.6所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物抗病性功能的蛋白质，例如本领域技术人员可根据如seq id no.6所示的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，通过取代、缺失和/或增加一个以上氨基酸，得到与如seq id no.6所示的氨基酸序列具有80％以上的同一性且具有调控植物抗病性功能的osbbr3蛋白突变体；
12.(a3)在(a1)-(a2)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。
13.上述(a2)所述蛋白质的氨基酸序列可为seq id no.3。
14.上述(a1)所述蛋白质的名称为osbbr3。(a2)所述蛋白质为osbbr3突变体。
15.为了使(a1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中seq id no.6所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
16.所述标签蛋白包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、his6标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、egfp(增强型绿色荧光蛋白)、ecfp(增强型青色荧光蛋白)、eyfp(增强型黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。
17.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质osbbr3的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质osbbr3的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质osbbr3且具有蛋白质osbbr3功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
18.上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
19.本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
20.本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
21.本文中，所述90％以上的同一性可为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
22.上述应用中所述的蛋白质来源于水稻(oryza sativa l.)。
23.本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质osbbr3。
24.上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的rna转运进行的调控(也就是对所述基因的mrna由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mrna降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
25.上述应用中，所述提高、增加或上调所述基因表达的物质和所述调控所述蛋白质活性或含量的物质可为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料可为下述b1)至b7)中的任一种：
26.b1)编码所述蛋白质的核酸分子；
27.b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；
28.b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体、或含有b2)所述表达盒的重组载体；
29.b4)含有b1)所述核酸分子的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或
含有b3)所述重组载体的重组微生物；
30.b5)含有b1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有b2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
31.b6)含有b1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有b2)所述表达盒的转基因植物组织；
32.b7)含有b1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有b2)所述表达盒的转基因植物器官。
33.上述应用中，b1)所述核酸分子可为下述任一种：
34.c1)核苷酸序列是seq id no.4的dna分子；
35.c2)核苷酸序列是seq id no.5的cdna分子；
36.c3)编码序列是序列表中seq id no.5的第1-126位的cdna分子或dna分子；
37.c4)与c1)、c2)或c3)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于水稻且编码上述蛋白质的dna分子；
38.c5)在严格条件下与c1)、c2)或c3)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的dna分子。
39.seq id no.5所示的dna分子(调控植物抗病性的osbbr3基因)编码氨基酸序列是seq id no.6的蛋白质osbbr3。
40.本发明所述的osbbr3基因可以为任意能够编码蛋白质osbbr3的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。
41.b1)所述核酸分子还可包括在seq id no.5所示核苷酸序列基础上经密码子偏好性改造得到的核酸分子。
42.所述核酸分子还包括与seq id no.5所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。
43.本文所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如grna、mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反义rna。
44.本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、ti质粒或病毒载体。具体可为载体pgwc或载体pmdc43。
45.可用现有的植物表达载体构建含有osbbr3基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂合成酶nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。
46.使用osbbr3基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增
强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
47.为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
48.利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的osbbr3基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得抗病性提高的转基因细胞系及转基因植株。携带osbbr3基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
49.可选地，b3)所述重组载体为具有seq id no.4或seq id no.5所示dna分子的质粒，例如下述实施例制备的pmdc43-osbbr3。
50.可选地，根据上述的应用，所述抗病性为植物对白叶枯病的抗性。
51.上述调控植物抗病性可为提高植物抗病性，例如表现为水稻白枯病的病斑长度缩短。
52.本发明还提供了增强植物对白叶枯病抗性的方法，包括提高和/或增加目的植物中上述蛋白质的编码基因的表达量，或/和提高和/或增加上述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，来增强植物的抗病性。
53.本发明还提供了培育抗白叶枯病植物的方法，包括提高和/或增加出发植物中上述蛋白的编码基因的表达和/或上述蛋白的含量和/或活性，或/和提高和/或增加上述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到抗白叶枯病植物。
54.上述提高和/或增加目的植物中上述蛋白质的编码基因的表达量，或/和提高和/或增加上述蛋白质的编码基因的活性和/或含量是通过将上述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现的。
55.作为本发明的一种实施方案，所述培育抗白叶枯病植物的方法包括如下步骤：
56.(1)构建含有如seq id no.4所示的osbbr3基因或含有如seq id no.5所示的osbbr3基因编码序列的表达载体；
57.(2)将步骤(1)构建的表达载体导入植物中；
58.(3)经筛选和鉴定获得抗白叶枯病植物。
59.本发明还提供了制备提高白叶枯病抗性的植物的方法，可为用序列如seq id no.4或seq id no.5所示dna替换植物基因组dna中的loc_os05g26630
hap1
编码基因中的seq id no.1或seq id no.2所示dna，得到白叶枯病抗性提高的植物。
60.所述植物可为e1)或e2)或e3)或e4)或e5)：e1)单子叶植物或双子叶植物，e2)禾本目植物，e3)禾本科植物，e4)稻属植物，e5)水稻。
61.上述osbbr3蛋白、或所述生物材料也属于本发明保护范围。
62.上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
63.上述蛋白质中，所述标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
64.本文中，所述导入可为通过化学转化法或电击转化法等任何已知的转化方法将携带本发明dna分子的载体转化宿主菌。导入的dna分子可以是单拷贝也可以是多拷贝。所述导入可以是将外源基因整合到宿主染色体中，也可以是由质粒在染色体外表达。
65.本发明实施例克隆了osbbr3基因，通过转基因过表达该基因，显著提高水稻对白叶枯病的抗性。
66.本发明发现水稻osbbr3基因具有正向调控水稻抗白叶枯病的功能，通过在水稻中过表达osbbr3基因的编码序列能够显著提高水稻对白叶枯病的抗性。osbbr3基因可用于改良水稻对白叶枯病的抗性，对于培育抗白叶枯病水稻新品种具有重要意义。
附图说明
67.图1为本发明实施例2中构建的osbbr3基因表达载体图谱。
68.图2为本发明实施例4中osbbr3基因过表达转基因植株的pcr鉴定结果；其中，m为dna分子量标准(dl2000 dna marker)，v为阳性对照，ck为阴性对照，oe-1、oe-2为osbbr3基因过表达转基因植株。
69.图3为本发明实施例4中osbbr3基因过表达转基因植株的相对表达水平分析结果。
70.图4为本发明实施例5中日本晴(nip)和osbbr3基因过表达转基因株系接种白叶枯病菌菌株gd1358的病斑长度。
具体实施方式
71.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
72.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
73.以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
74.下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna的5’末端核苷酸，末位均为相应dna的3’末端核苷酸。
75.载体pgwc：来自biovector ntcc典型培养物保藏中心。
76.载体pmdc43：来自biovector ntcc典型培养物保藏中心。
77.根癌农杆菌eha105：来自biovector ntcc典型培养物保藏中心。
78.白叶枯病菌菌株gd1358，记载在“方中达,许志刚,过崇俭,殷尚智,伍尚忠,徐羡明,章琦.中国水稻白叶枯病菌致病型的研究.植物病理学报,1990,20(2):81-88”一文中，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得。
79.水稻品种日本晴、iris_313-11058(wang w,mauleon r,hu z,et al.genomic variationin 3010diverse accessions of asian cultivated rice,nature,2018,557
(7703):43-49.)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
80.loc_os05g26630在3k种质资源中主要存在2种编码蛋白长度不同的单倍型，分别为loc_os05g26630
hap1
和loc_os05g26630
hap2
。loc_os05g26630
hap1
序列(基因组序列)如seq id no.1所示，第1-271位为5’utr序列，272-523位为外显子序列，524-759位为3’utr序列，编码序列如seq id no.2所示，编码的蛋白序列如seq id no.3所示。loc_os05g26630
hap2
序列如seq id no.4所示，第1-271位为5’utr序列，272-523位为外显子序列，524-759位为3’utr序列，编码序列如seq id no.5的第1-126位所示，编码的蛋白序列如seq id no.6所示。将loc_os05g26630
hap2
命名为osbbr3。
81.实施例1、水稻loc_os05g26630基因的克隆
82.1.水稻loc_os05g26630基因的基因组序列的获得
83.提取水稻品种日本晴和iris_313-11058的叶片dna，以此dna为模板，利用引物osbbr3-f：5
’‑
accaaactccctcgagtctctcc-3’和osbbr3-r：5
’‑
ccacaatgatggttcgatcaag-3’，采用primestar gxl dna polymerase(code：r050a，takara)进行pcr扩增，得到扩增产物(即loc_os05g26630基因的基因组序列)。loc_os05g26630基因在hap1代表品种日本晴的基因组序列如seq id no.1所示的核苷酸序列；在hap2代表品种iris_313-11058中的基因组序列如seq id no.4所示的核苷酸序列。
84.2.水稻loc_os05g26630基因的编码序列的获得
85.提取水稻品种日本晴和iris_313-11058的叶片总rna，采用fastking gdna dispelling rt supermix(code:kr118，tiangen)合成cdna，以此cdna为模板，利用引物osbbr3-cds-f：5
’‑
atgagggagagggtggctgc-3’和osbbr3-cds-r：5
’‑
tcacccaaggctcgtc-3’，采用primestar gxl dna polymerase(code：r050a，takara)进行pcr扩增，得到扩增产物(即loc_os05g26630基因的编码区)。loc_os05g26630基因在hap1代表品种日本晴的编码序列如seq id no.2所示的核苷酸序列，编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示；在hap2代表品种iris_313-11058中的编码序列如seq id no.5的第1-126位所示的核苷酸序列，编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.6所示。
86.实施例2、水稻抗病基因osbbr3代表品种表达载体的构建
87.将iris_313-11058中osbbr3基因的cds序列(seq id no.5的第1-126位所示的核苷酸序列)通过gateway系统将目的基因osbbr3从入门载体pgwc转移到表达载体pmdc43上，得到含有osbbr3基因的表达载体pmdc43-osbbr3。操作步骤如下：
88.(1)提取水稻品种iris_313-11058的总rna，反转录得到cdna，以该cdna为模板，利用正向引物osbbr3-cds-f：5
’‑
atgagggagagggtggctgc-3’(seq id no.9)和反向引物osbbr3-cds-r：5
’‑
tcacccaaggctcgtc-3’，进行pcr扩增，得到扩增产物(序列是seq id no.5，含有osbbr3的编码序列(cds))，并进行切胶回收。
89.(2)将步骤(1)得到的切胶回收产物进行加a处理，具体步骤为：将20μl回收产物和20μl pcr supermix(code：as111-11，transgen biotech)进行混合，进行pcr反应。反应程序：95℃5min，72℃20min，4℃保存。随后对pcr产物用普通dna产物纯化试剂盒(code：dp204-02，tiangen)纯化回收。
90.(3)将步骤(2)得到的回收产物与入门载体pgwc经eam1105酶切得到的载体骨架进
37.3mg，feso4·
7h2o 27.8mg，vb1 0.1mg，vb6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，2，4-d 2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，去离子水加至1l。
107.侵染培养基：配制方法参见参考文献：hiei y,ohta s,komari t,et al.efficient transformation of rice(oryza sativa,l.)mediated by agrobacterium,and sequence analysis of the boundaries of the t-dna[j].plant journal,1994,6(2):271-282.。将参考文献中乙酰丁香酮的浓度替换为200μm。
[0108]
共培养培养基：在诱导培养基中加入乙酰丁香酮和葡萄糖，使乙酰丁香酮在培养基中的终浓度为200μm，葡萄糖在培养基中的终浓度为10g/l。
[0109]
抑菌培养基：在诱导培养基中加入头孢霉素，使头孢霉素在培养基中的终浓度为500mg/l。
[0110]
筛选培养基：在诱导培养基中加入潮霉素和头孢霉素，使潮霉素在培养基中的终浓度为65mg/l，头孢霉素在培养基中的终浓度为500mg/l。
[0111]
预再生培养基：cacl2·
2h2o 440mg，kh2po
4 170mg，mgso4·
7h2o 370mg，nh4no
3 1650mg，kno
3 1900mg，ki 0.83mg，cocl2·
6h2o 0.025mg，h3bo
3 6.2mg，na2moo4·
2h2o 0.25mg，mnso4·
4h2o 22.3mg，cuso4·
5h2o 0.025mg，znso4·
7h2o 8.6mg，na
2-edta
·
2h2o 37.3mg，feso4·
7h2o 27.8mg，vb1 0.1mg，vb6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂3g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1l；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/l。
[0112]
再生培养基：cacl2·
2h2o 440mg，kh2po
4 170mg，mgso4·
7h2o 370mg，nh4no
3 1650mg，kno
3 1900mg，ki 0.83mg，cocl2·
6h2o 0.025mg，h3bo
3 6.2mg，na2moo4·
2h2o 0.25mg，mnso4·
4h2o 22.3mg，cuso4·
5h2o 0.025mg，znso4·
7h2o 8.6mg，na
2-edta
·
2h2o 37.3mg，feso4·
7h2o 27.8mg，vb1 0.1mg，vb6 0.5mg，烟酸0.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，水解酪蛋白2g，麦芽糖30g，琼脂6g，激动素2mg，萘乙酸1mg，去离子水加至1l；倒平板之前加入潮霉素并使其浓度为50mg/l。
[0113]
实施例4、转基因水稻的鉴定
[0114]
1、阳性osbbr3转基因植株的筛选与鉴定
[0115]
待测植株：日本晴(ck)以及实施例3得到的osbbr3转基因植株。
[0116]
提取待测植株基因组dna，以基因组dna为模板，利用pmdc43-tf(序列是：5
’‑
ggagacaccctcgtcaacag-3’，对应于pmdc43-osbbr3的1151-1170位片段)和osbbr3-cds-r(序列是5
’‑
tcacccaaggctcgtc-3’，对应于序列5的第237-252位序列)组成的引物对进行pcr扩增，用pmdc43-osbbr3质粒作为阳性对照(v)，用受体品种日本晴作为阴性对照(ck)。
[0117]
将pcr扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，阳性对照(v)和阳性osbbr3过表达转基因植株均显示743bp的条带，阴性对照(ck)不能扩增出任何条带。部分样品的电泳图见图2。选取两株阳性osbbr3转基因植株分别记为oe-1、oe-2。
[0118]
2、阳性osbbr3转基因植株在rna水平上的鉴定
[0119]
提取阳性osbbr3转基因植株oe-1、oe-2以及野生型日本晴的总rna，并进行反转录，采用qrt-pcr检测osbbr3基因在rna水平上的表达情况，所用引物osbbr3-qf：5
’‑
aatccttccttacctcgtgttt-3’和osbbr3-r：5
’‑
ccacaatgatggttcgatcaag-3’。采用引物ubq-f：5
’‑
acctactgcccaccaaactccc-3’和引物ubq-r：5
’‑
gccctctagccaccagcgaaa-3’检测内参
基因(ubq)。
[0120]
结果如图3所示，oe-1、oe-2中osbbr3基因的表达量相对于野生型日本晴(nip)均显著上调，表达量为野生型的3倍以上。
[0121]
将阳性osbbr3过表达转基因植株oe-1、oe-2移植至温室栽培，分别单株收种，得到t1代转基因种子，之后繁殖得到纯合t3代种子，分别得到阳性osbbr3过表达转基因株系oe-1、oe-2，进行下述实验。
[0122]
实施例5、转基因株系的抗白叶枯病鉴定
[0123]
待测植株为：日本晴(nip)，阳性osbbr3转基因株系oe-1、oe-2。
[0124]
1、将各待测株系在温室中培养约25天后移栽至网室中进行种植，单株种植，每种株系种植20株。
[0125]
2、在步骤1水稻植株的分蘖盛期，用中国白叶枯病菌菌株gd1358进行接种，采用剪叶法对水稻植株进行人工接种，每株接种5片叶片(菌液浓度为1
×
109cfu/ml)，每个叶片的接种量均相等，均为40μl。
[0126]
3、接菌约14天后测量各植株叶片的病斑长度，每个叶片沿叶脉有一个病斑，每个植株测量3片接种叶片的病斑长度，计算平均值。
[0127]
统计结果如图4所示。日本晴(nip)的平均病斑长度为3.9cm，osbbr3过表达转基因株系oe-1、oe-2的平均病斑长度分别为1.3cm、2.7cm，均显著短于日本晴的病斑长度，表明osbbr3基因能够提高水稻对白叶枯病的抗病性。以上结果表明，osbbr3基因能正向调控水稻对白叶枯病的抗性。
[0128]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。