水稻OsNAC129在负调控粒形和淀粉合成上的应用

水稻osnac129在负调控粒形和淀粉合成上的应用
技术领域
1.本发明涉及水稻调控领域，主要是一种水稻osnac129在负调控粒形和淀粉合成上的应用。


背景技术：

2.水稻籽粒大小是影响水稻的产量的重要因素之一，而表观直链淀粉含量则对稻米品质具有决定性影响，通常表观直链淀粉含量偏高的稻米品质相对较差，其中osgbssi是水稻胚乳中唯一负责直链淀粉合成的酶。
3.籽粒大小和胚乳中淀粉含量对稻米的产量和品质具有决定性影响，然而它们的相关调控机制仍然不是很清楚。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种水稻osnac129在负调控粒形和淀粉合成上的应用。
5.本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。一种水稻osnac129在负调控粒形和淀粉合成上的应用，所述水稻osnac129的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.4所示。
6.所述的水稻osnac129在负调控粒形和淀粉合成上的应用，包括osnac129的突变体功能缺失突变导致籽粒大小、表观直链淀粉含量都显著增加，过表达osnac129导致籽粒减小，表观直链淀粉含量显著降低。
7.所述osnac129的突变体的核苷酸序列如seq id no.5所示，其编码的蛋白序列如seq id no.9所示。
8.本发明的有益效果为：本发明中osnac129是一个nac家族转录因子，通过对其功能缺失突变体和过表达转基因植株的全面表型分析发现，它同时参与粒形和表观直链淀粉含量的调控，这表明osnac129能够同时参与水稻产量和品质的调控。另外通过精细的实验设计，我们发现osnac129同时参与br信号和aba信号通路，而已有的大量研究表明br可以通过调控水稻株型，穗型和粒形促进产量的提升，aba则主要参与胁迫应答以及种子灌浆和萌发。
附图说明
9.图1.osnac129在未成熟种子中高表达。(a)osnac129在日本晴不同发育时期和组织部位中的表达谱。从萌发后7天的根和芽，开花前的叶片、叶鞘、茎和幼穗，不同发育时期的种子中提取总rna。actin1被用作内参对照。数据为4次生物重复的均值
±
sd。(b)转基因植株中osnac129pro::-gus的染色分析。萌发后7天的根(a)和芽(b)、旗叶(c)、叶鞘(d)、茎(e)、抽穗期茎横切面(f)、幼穗(g)、老穗(h)、开花小穗(i)中的gus表达量；3daf(j)、5daf(k)、7daf(l)、10daf(m)、15daf(n)和25daf(o)的胚乳。
10.图2.osnac129突变体籽粒大小和表观直链淀粉含量增加。(a)osnac129籽粒成熟
期表型观察。(b)、(c)、(d)和(e)成熟种子的粒长、粒宽、粒厚和千粒重检测。数据均为均值
±
sd,3个重复，**p《0.01，***p《0.001；t-test检验。(f)野生型和osnac129突变体的糙米籽粒及其横截面(上图)和淀粉粒(下图)。蓝框表示成熟胚乳中心扫描电镜分析淀粉颗粒的区域。(g)和(h)分别检测表观直链淀粉含量(aac)和总淀粉含量(tsc)。数据为均值
±
sd,5个重复，***p《0.001；t-test检验。
11.图3.osnac129-oe过表达植株导致籽粒减小，表观直链淀粉含量降低。(a)wt和oe植物成熟种子的表型观察。(b)、(c)和(d)成熟种子的粒长、粒宽和千粒重检测。数据为均值
±
sd,3个重复，***p《0.001；t-test检验。(e)和(f)分别检测表观直链淀粉含量(aac)和总淀粉含量(tsc)。数据为平均
±
sd,5个重复，**p《0.01，***p《0.001；t-test检验。
12.图4.osnac129同时调控细胞扩展和胚乳淀粉合成。(a)wt和osnac129突变体外稃外表皮细胞的扫描电镜观察。(b)、(c)、(d)外稃外表皮细胞长度、细胞宽度和细胞数量的测量。(b)和(c)有3个重复(每个重复至少包含30个细胞)，(d)有4个重复，数据为平均值
±
sd，**p《0.01，***p《0.001；t-test检验。(e)和(f)qrt-pcr检测wt、osnac129突变体和oe植株7daf种子中报道的控制细胞伸长的粒级相关基因。ubq10被用作内部控制。数据为平均
±
sd,4个重复，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001；t-test检验。(g)和(h)wt、osnac129和oe植物7daf种子中淀粉合酶编码基因的qrt-pcr检测。ubq10被用作内部控制。数据为平均
±
sd,4个重复，*p《0.01，**p《0.01，***p《0.001；t-test检验。
13.图5.osnac129受aba诱导，并且还是br信号转导通路相关基因。(a)osnac129仅受aba诱导。分别用iaa、6ba、ga3、aba和bl(每种激素浓度为50μm)处理2周龄nip幼苗，以不含激素的灭菌水处理为空白对照。收集处理后的样品，采用qrt-pcr检测osnac129的表达情况。数据为均值
±
标准差，有4个重复。nd,未检测到。(b)wt和oe植株两周龄的幼苗分别用一系列浓度的bl处理24小时，然后进行叶角成像。(c)bl处理后wt和oe幼苗叶片角的图像统计。数据采用均数
±
标准差，共10次重复。***p《0.001；t-test检验。
14.图6.osnac129相关转基因材料的制备与鉴定。(a)osnac129的示意图及t-dna插入位点。黑框代表外显子，p1、p2、p3和p4是用于插入位点鉴定的引物。(b)纯合突变体的pcr筛选。(c)t-dna插入拷贝数的southern blot检测。以pcr获得的潮霉素b磷酸转移酶(hpt)片段为阳性对照。hindiii,sali,sphi和xhol，限制性内切酶消化osnac129突变体的基因组dna。然后用生物素标记的hpt探针进行检测。(d-e)osnac129突变体和过表达植株的qrt-pcr检测。内参采用ubq10。数据为均值
±
标准差，有4个重复。***p《0.001；t-test检验。图7.osnac129突变体幼苗生长加快，并且这种加速生长持续到抽穗期。(a)wt和osnac129突变体两周龄的幼苗。(b)和(c)萌发两周后wt和osnac129突变体的苗长和根长测量。数据为平均值
±
sd,10个重复，**p《0.01，***p《0.001；t-test检验。(d)野生型(wt)和osnac129突变体在灌浆期的植株株型。(e)和(f)灌浆期wt和osnac129突变体的株高和分蘖数。数据为平均
±
sd,12个重复，**p《0.01；t-test检验。
15.图8.osnac129的过表达抑制植株的生长。(a)wt和oe植株两周龄的幼苗。(b)和(c)萌发两周后wt和oe植株的苗长和根长测定。数据为平均
±
sd,10个重复，***p《0.001；t-test检验。(d)wt和oe植株在灌浆阶段的株型。(e)和(f)灌浆期wt和oe植株株高和分蘖数。数据为平均
±
sd,12个重复，*p《0.01，**p《0.01，***p《0.001；t-test检验。
具体实施方式
16.下面将结合附图对本发明做详细的介绍：
17.本发明所述的一种水稻osnac129在负调控粒形和淀粉合成上的应用，所述水稻osnac129的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.4所示。
18.所述的水稻osnac129在负调控粒形和淀粉合成上的应用，包括osnac129的突变体功能缺失突变导致籽粒大小、表观直链淀粉含量都显著增加，过表达osnac129导致籽粒减小，表观直链淀粉含量显著降低。
19.所述osnac129的突变体的核苷酸序列如seq id no.5所示，其编码的蛋白序列如seq id no.9所示。
20.序列说明：
21.1、过量表达株系的亲本是日本晴，转入的dna也是日本晴osnac129的基因组dna。
22.2、osnac129突变体为dongjin背景的t-dna插入突变体，基因组序列(seq id no.5，1587-9861)和cds序列中表示插入的t-dna序列，seq id no.8为dongjin突变体的cds序列。
23.3、dongjin背景的osnac129基因组序列与日本晴背景的基因组序列(seq id no.1或seq id no.4)存在一个碱基的差异(日本晴为t，dongjin为g)，差异碱基位置在357。因为这个碱基位于内含子中，不影响cds序列，所以两个水稻品种编码区序列(seq id no.2或seq id no.6)和蛋白序列(seq id no.3或seq id no.8)是一样的。
24.4、osnac129基因组dna长1900bp，cds长723bp，蛋白长240个氨基酸。突变体因t-dna插入，蛋白翻译提前终止，产生143个氨基酸的蛋白(seq id no.9)，其n端137个氨基酸与野生型相同，最后6个氨基酸由t-dna编码。
25.1.osnac129在水稻未成熟胚乳中高量表达
26.之前有转录组学研究报导表明水稻中有9个种子特异表达的nac转录因子，osnac129就是其中之一。为了全面解析osnac129的生物学功能，我们首先通过qrt-pcr技术对osnac129在野生型日本晴水稻中的时空表达谱进行了更加详细的研究。检测结果表明，在营养组织中如萌发后7天的根和芽，-灌浆期的茎，叶片，叶鞘，以及幼穗中，osnac129的表达水平极低，几乎检测不到(图1a)。在灌浆早期的种子中表达量也极低，然而随着种子的发育和灌浆过程，osnac129的表达水平迅速提升，并在受精后7天的种子中达到表达高峰，随后逐渐降低(图1a)，这一表达模式与水稻胚乳的灌浆过程高度吻合。此外通过更细致的分析发现，osnac129主要集中在胚乳中表达(图1a)。此外，我们在颖壳，种皮和胚中也检测到了osnac129的表达，虽然不是很高，这些结果暗示了osnac129在种子发育中具有重要作用。
27.为了更精确的反映osnac129的表达模式，我们还制备了osnac129 pro：：gus的转基因植株，并对转基因植株不同发育时期和组织部位进行了gus染色观察。结果发现，在发育的早期，7天的幼根和芽以及叶片叶鞘中几乎没有信号，但是在某些特殊部位，如叶枕和茎节部位存在较强的gus染色信号(figure 1ba-f)。发育早期的幼穗也几乎没有染色，但是，随着幼穗的发育，gus染色信号出现，并逐渐加深，颖壳和雄蕊都有染色(图1bg-i)。开花和灌浆后，胚和胚乳逐渐形成，但是5天之前的种子种还没有出现gus信号，5天之后，gus信号迅速增强，并且染色信号首先出现在胚与胚乳的交界处，随后充满整个胚乳(图1bk-o)。总之，上述结果充分证实，osnac129并非是一个完全种子特异表达的转录因子，在其他组织
部分也有表达，而在未成熟胚乳中表达量最高，表明osnac129可能不仅参与种子发育调控，还会参与植株生长发育调控。
28.2.osnac129的功能缺失突变导致籽粒大小、表观直链淀粉含量、株高都显著增加
29.随后，我们从韩国突变体库中获得了一个osnac129的t-dna插入突变体(pfg-3a60140)，该t-dna插入在osnac129基因的第三个外显子前端(图6a)，该插入突变导致osnac129的移码和提前终止。我们通过分别在t-dna上以及插入位点两端设计引物进行pcr验证了该突变体是正确的，并且从分离的后代种得到了纯合突变体(图6a和b)。此外，我们通过southern blot杂交实验证实该突变体中只有一个t-dna插入片段(图6c)，因此，证实该突变体是osnac129的特异突变体。另外，荧光定量pcr检测表明osnac129在突变体osnac129中表达水平极显著降低(图6d)，上述结果综合表明osnac129是一个功能缺失突变体。然后我们分析了osnac129的成熟种子表型，结果表明，osnac129突变体粒长和千粒重显著增加，而粒宽和粒厚没有显著变化(图2a-d)，这些结果表明osnac129负调控粒形。此外，osnac129突变体成熟胚乳外观半透明，没有垩白，与野生型之间没有显著差异，扫描电镜观察也表明，突变体和野生型胚乳中淀粉颗粒形状规则排列紧密，没有显著差异(图2f)。随后我们检测了突变体和野生型成熟种子的淀粉，结果发现突变体中表观直链淀粉含量显著升高，总淀粉含量显著降低(图2g和h)。这些结果表明osnac129同时参与了粒形和胚乳的淀粉合成调控。
30.t-dna突变体鉴定引物使用说明：
31.首先在基因的插入位点两侧设计一对引物p1(tcattttccgacatcaggaag)和p2(acgcacacacacacacacac)(引物位置如下图所示)进行pcr扩增，野生型和杂合突变体可以得到正常的扩增条带，而纯合突变体由于存在t-dna大片段的插入，导致无法得到扩增条带。
32.随后，在t-dna左右两端设计引物p3(ctagagtcgagaattcagtaca)和p4(ttggggtttctacaggacgtaac)，分别与osnac129基因上插入位点两端的引物组合进行pcr检测：p1+p3组合，或者p4+p2组合。野生型植株由于没有t-dna序列，故两组引物都无法得到扩增条带，而纯合突变体和杂合突变体则可以得到扩增条带。
33.三组引物配合使用可以方便的分辨出野生型、纯合突变体、杂合突变体。
34.考虑到osnac129在茎中以及叶枕等部位也有表达，因此我们想知道它在水稻营养生长和发育过程中是否也有作用。结果我们发现，osnac129突变体幼苗生长比野生型快，并且这种快速生长状态延续到成熟期，导致突变体株高显著高于野生型(图7a-d)。然而分蘖数并未受到影响。这些结果表明osnac129对株高具有负调控功能。
35.3.过表达osnac129导致籽粒减小，表观直链淀粉含量和株高显著降低
36.为了进一步验证osnac129在种子发育和植株生长过程中的生物学功能，随后我们在日本晴背景下制备了osnac129全基因的过表达转基因植株(包含起始密码子atg上有约2kb的启动子区，orf区，以及终止密码子下游约1kb的终止子区)。荧光定量pcr检测显示osnac129的表达水平得到了显著提高(图6e)，表明过表达转基因植株制备成功。随后我们对过表达转基因植株的表型进行了全面的分析。结果发现，相比于野生型植株，过表达转基因植株的粒宽和千粒重显著降低，粒长没有显著变化(图3a-d)，这些结果进一步证实，osnac129负调控水稻粒形。此外，表观直链淀粉含量显著降低，总淀粉含量没有显著差异
(图3e和f)，这些结果表明osnac129的确同时参与水稻粒形和胚乳淀粉的合成调控。
37.此外，我们同样检测了osnac129过表达转基因植株的营养生长情况。结果发现，和突变体相反，过表达转基因植株生长速度显著慢于野生型，导致苗长和株高都显著低于野生型植株(图8a-d)。综上所述，osnac129负调控水稻粒形，表观直链淀粉含量以及株高。
38.4.osnac129突变体和osnac129-oe过表达转基因植株中粒长相关基因以及淀粉合成酶编码基因的表达水平都发生了改变
39.上述研究结果表明osnac129负调控粒形，表观直链淀粉含量以及株高。为了进一步研究调控机制，我们首先对osnac129突变体的颖壳细胞进行了观察。结果发现，突变体颖壳细胞长度显著大于野生型，细胞宽度没有变化，而纵向细胞数目则略低于野生型(图4a-d)，这些结果表明osnac129主要是通过影响细胞扩展来参与粒形调控的。目前已经有一些通过调控细胞扩展影响籽粒大小的基因被克隆和报导了，为了验证osnac129是否通过这些已知的基因参与粒形调控，我们对osnac129突变体以及过表达转基因植株中的相关粒形基因(如ossrs1,ossrs3,ossrs5,ospgl1,ospgl2)进行了荧光定量检测。结果发现，在这些被检测的基因中ospgl1和ospgl2分别在突变体中被上调而在过表达转基因植株被下调了(图4e和f)。这些结果表明osnac129很可能是通过负调控ospgl1和ospgl2来参与粒形调控的。ospgl1和ospgl2是两个非典型的bhlh家族转录因子，已经被证实是粒长的正调控因子，它们通过正调控细胞扩展来影响水稻的粒形，并且它们都是br信号转导通路相关基因。
40.此外，我们还检测了突变体和过表达转基因植株中的淀粉合成酶编码基因。结果发现，许多淀粉合成酶编码基因如osagps2b,osagpl2,osagpl3,ossiia,osssivb,osgbssi,and ossbeiib等在突变体中都发生显著上调(图4g)。而在过表达转基因植株中，一些淀粉合酶编码基因如osagpl3,ossiia,osgbssi,osbeiib,and osphoi都发生了显著下调(图4h)。上述结果进一步证实了osnac129确实是负调控水稻淀粉合成的。但是突变体和过表达转基因植株胚乳中总淀粉含量没有发生相应的升高和降低的变化，暗示了胚乳中淀粉合成的调控网络非常复杂。
41.5.osnac129的表达仅受aba的诱导，同时又参与br信号转导通路
42.上述结果都表明，osnac129同时参与种子发育和植株生长调控，而大量已有的研究表明植物激素在植物的整个生长发育过程中都发挥着重要的调节作用。因此，为了进一步研究osnac129是受到何种上游信号诱导来参与上述调控过程的，我们首先对osnac129的表达水平进行了多种外源激素的诱导实验。结果发现在使用的5种激素(iaa，6ba，ga3，aba，bl)诱导处理的野生水稻幼苗中，只有aba能够显著诱导osnac129的表达，而其他几种激素均对osnac129无诱导作用(图5a)。这表明aba是osnac129的上游信号。
43.此外，我们前面的结果证实，osnac129在叶枕处局部表达，这与br相关基因的表达模式非常吻合，而调控作物类植株叶倾角是br典型的生理反应。另外，osnac129负调控ospgl1和ospgl2，而这两个基因都是br信号转导相关基因，尽管ospgl1并不受br的诱导，但是其过表达转基因植株对br的敏感度显著增加。因此我们怀疑，osnac129虽然不受bl(br的最强活性形式)诱导，但也和可能参与br信号转导通路。为了验证这一疑问，我们对osnac129的过表达转基因植株幼苗对外源br敏感度进行了检测。结果发现，相比于野生型幼苗，过表达转基因植株幼苗的叶倾角对外源bl的敏感度显著降低(图5b和c)，这充分证实osnac129参与br信号通路，并负调控br信号转导。
44.结论：
45.1.本发明证实osnac129并不是一个胚乳特异表达的基因，而是一个普遍表达的基因，只是在未成熟胚乳中表达量最高。
46.2.osnac129同时负调控水稻的粒形，表观直链淀粉含量表型。并且主要通过调控细胞扩展来调控粒形。对粒形相关基因ospgl1，ospgl2，以及直链淀粉合成酶编码基因osgbssi都具有显著的负调控作用。
47.3.osnac129通过多种途径如br信号转导途径以及aba途径参与水稻籽粒发育和植株生长调控。
48.材料和方法：
49.1.植物材料和生长条件
50.为了过表达osnac129，将全基因片段(包括2kb启动子序列的长度在起始密码子面前,开放阅读框(orf)从起始密码子到终止密码子和终止密码子背后1kb)从日本晴基因组dna中进行pcr扩增,然后用重组酶将pcr片段重组连接入pcambia 1300载体。为了进行启动子驱动的gus报告基因转基因植株，采用pcr方法从基因组dan中扩增出起始密码子前2kb长的序列，然后用重组酶将该片段导入pcambia 1300-gn中。将上述构建正确的转基因质粒导入农杆菌菌株eha105并侵染粳稻品种日本晴的愈伤组织，获得转基因植株。粳稻(oryza sativa l.)品种dongjin和osnac129(pfg_3a60140)突变体是从韩国浦项科技大学获得的(jeong et al.，2002)。水田条件:夏季在上海试验基地种植，冬季在海南陵水试验基地(中国南部的海南岛)种植，在自然条件下种植，主要用于表型分析、基因表达检测和留种。温室生长条件:28℃，11h日/13h夜，主要用于幼苗的培养和基因表达的检测。
51.2.dna和rna提取以及荧光定量pcr(qrt-pcr)检测
52.水稻基因组dna使用植物dna分离试剂盒(天根生物技术)，质粒dna提取使用质粒dna提取试剂盒(天根生物技术)，按照生产厂家的操作规程进行植物dna和质粒dna的分离。提取rna时，使用植物总rna分离试剂盒(天根生物技术)提取总rna，所有组织必须新鲜采集或液氮冷冻，并按照生产厂家的操作说明。反转录采用逆转录试剂盒(takara)，按照生产厂家的操作说明进行反转录。qrt-pcr检测以2μl cdan为模板，20μl反应体系，采用lightcycler 480(biorad)进行qpcr检测。水稻泛素10(osubq10)或actin1作为内参。本发明所用的引物均列在补充表s1中。
53.3.gus染色分析
54.按照先前发明中描述的方法进行了gus活性的组织化学分析(edwards et al.，1990)。简单来说，将表达osnac129 pro::gus的转基因植株组织收集，用90％丙酮水溶液浸泡，冰上固定15min。然后弃去丙酮水溶液，用去离子水冲洗两次。将组织浸泡在gus染色液中，37℃染色过夜。次日弃去gus染色液，加入乙醇溶液，将组织脱色至无绿色，使用体式显微镜观察染色信号并成像。
55.4.胚乳淀粉含量检测
56.表观直链淀粉含量和总淀粉含量的检测按照本实验室先前发表文献中的方法进行操作(wang et al.,2013).
57.5.种子表型观察以及颖壳表皮细胞统计分析
58.粒形分析采用万深籽粒分析系统，按照生产厂家的操作规程，对转基因植株成熟
种子的籽粒大小进行测定。每个样品设置3个生物重复，每个重复包含不少于300粒种子。外颖表皮细胞测量按照之前发表的文献描述进行(heang和sassa,2012a)。淀粉粒形态观察按前线已发表的文献方法进行(fu and xue,2010)。
59.6.植物激素诱导分析
60.采集2周龄野生型日本晴幼苗，浸泡在含有不同植物激素的蒸馏水中，以不含植物激素的蒸馏水为阴性对照。然后在不同的时间点采集处理后的样品，立即冷冻于液氮中。然后将所有采集的样本用qrt-pcr检测osnac129的表达。rna分离、逆转录、qrt-pcr均按上述方法进行。
61.7.br敏感度分析
62.分别用1μm、5μm、50μm浓度的bl处理2周龄野生型日本晴和osnac129-oe过表达植株幼苗24h，以无菌水处理作为模拟对照。然后收集幼苗，拍照，并使用imagej软件的指令对叶角进行统计和计算。
63.表s1.本发明中所使用的引物。
[0064][0065]
可以理解的是，对本领域技术人员来说，对本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。