一种用于脑动脉瘤早期诊断或检测的ceRNA调控网络及其应用的制作方法

一种用于脑动脉瘤早期诊断或检测的cerna调控网络及其应用
技术领域
1.本发明涉及脑动脉瘤的辅助诊断技术领域，尤其涉及一种用于脑动脉瘤早期诊断的cerna调控网络及其应用。


背景技术：

2.脑动脉瘤(intracranial aneurysm，ia)是一种常见的脑血管疾病，具有很高的致残率和死亡率。ia破裂是其致死的主要原因，致死率达到了35%，致残率约30%，仅不到30%的ia破裂患者可恢复独立生活。脑动脉瘤的传统诊断都是基于影像学手段进行检查，而病人往往都是出现相关症状才到医院就诊。ia在未破裂之前通常无明显症状，并且受影像诊断技术和成本的限制，患者主动检查意识薄弱，80%-90%的未破裂动脉瘤是在偶然情况下被发现。ia也被称为脑部的“定时炸弹”，它极易在偶发的紧张、用力、疲劳等血压升高时突然发生破裂，一旦破裂常会危及生命或留下严重后遗症，给人们的生活带来巨大的威胁。脑动脉瘤破裂前没有任何征兆，其死亡率极高，大概1/3的脑动脉瘤患者都是发病后送往医院救治的过程中死亡。因此，脑动脉瘤早期预测的分子标记物的研发，将该疾病的预防和治疗有着重要的意义。
3.随着转录组测序和微阵列技术的成熟，诸多rna被鉴定并证实在ia中有着重要作用。近年来，研究者发现竞争性内源rna（cerna）对疾病的有着独特作用。cerna假说主要是长链非编码rna (lncrnas) 充当分子海绵吸引微小rna (mirnas)，通过竞争与共享 mirnas 的结合从而间接对信使rna (mrna)进行调控，mirna在cerna中起到连接作用，并且是一个重要的基因转录调节因子。如长链非编码rna malat1通过竞争结合mirna-143，对mirna-143靶基因vegfa 的表达进行间接调节，进而影响血管内皮细胞损伤进程。lncrna心肌梗死相关转录本（myocardial infarction-associated transcript，miat）可通过骨髓细胞瘤癌基因调节外胚层神经皮层 1的表达从而影响血管内皮细胞的凋亡进程等。miat也可通过海绵化mir-204-5p来促进高迁移率族蛋白 (hmgb1) 的表达，从而调节脑缺血后脑微血管内皮细胞的损伤。目前，国内外鲜有关于cerna网络分析与脑动脉瘤相关的研究报道。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高的用于脑动脉瘤早期诊断或检测的cerna调控网络及其应用，其中mirna-17-3p表达量与脑动脉瘤患病呈负相关，miat和galnt10基因表达量与脑动脉瘤患病风险呈正相关。
5.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于脑动脉瘤早期诊断或检测的cerna调控网络，所述的cerna调控网络为lncrna miat-mirna-17-3p
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galnt10调控网络，其中lncrna miat的核苷酸序列如seq id no.1所示，mirna-17-3p的核苷酸序列如seq id no.2所示，galnt10的核苷酸序列如seq id no.3所示。
6.上述用于脑动脉瘤早期诊断或检测的cerna调控网络在制备脑动脉瘤早期诊断或检测药物方面的应用。
7.所述的药物在脑动脉瘤早期诊断或检测中促进lncrna miat基因的表达和/或促进galnt10基因的表达和/或抑制mirna-17-3p基因的表达。
8.上述用于脑动脉瘤早期诊断或检测的cerna调控网络在制备脑动脉瘤早期诊断或检测试剂盒方面的应用。
9.所述的试剂盒包括miat基因荧光定量pcr特异性上游引物：5'
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caaggtccacagaacgag-3'，miat基因荧光定量pcr特异性下游引物：5'
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tagccctaacgccaaat-3'；galnt10基因荧光定量pcr特异性上游引物：5'-aaagttggtggtgttgggaaag-3'，galnt10基因荧光定量pcr特异性下游引物：5'
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agtgggtggcaggttggtt-3'。
10.所述的mirna-17-3p基因表达量与脑动脉瘤患病呈负相关，所述的miat基因和所述的galnt10基因表达量与脑动脉瘤患病风险呈正相关。
11.与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了用于脑动脉瘤早期诊断或检测的cerna调控网络及其应用，该调控网络包括一个长非编码rna miat，一个微小rna mirna-17-3p和一个信使rna基因galnt10组成，lncrna miat和galnt10基因在脑动脉瘤脑血管组织和血浆中高表达，mirna-17-3p在脑动脉瘤患者脑血管和血浆中低表达。其机理可能是lncrna miat海绵化mir-17-3p从而调节其靶基因galnt10的表达参与到脑动脉瘤的病理发展过程中。lncrna miat-mir-17-3p-galnt10 cerna网络轴通过nf-κb信号通路对巨噬细胞的浸润能力进行调节，参与ia的发展进程。因此，以检测cerna网络组合标记物miat/mir-17-3p/galnt10 基因/蛋白表达水平为基础的检测试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对脑动脉瘤的检测，检测效率高，针对性强，同时，以cerna网络组合标记物靶点miat/mir-17-3p/galnt10 为脑动脉瘤辅助诊断、检测和筛选的一种创新用途。
12.综上所述，本发明以检测cerna网络组合标记物miat/mir-17-3p/galnt10 的表达水平为基础的检测试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对脑动脉瘤的检测，其中分子标志物mirna-17-3p低表达，miat和galnt10基因高表达时具有脑动脉瘤患病风险，检测效率高，针对性强，有利于脑动脉瘤的早期发现和及时治疗。
附图说明
13.图1为生物信息学筛选出差异基因流程图；图2为在多个脑动脉瘤基因表达geo数据库中对于3种rna进行差异分析；图3为对geo数据库的mirna和mrna进行加权基因共表达网络分析 (wgcna)图4为在脑动脉瘤geo数据库中构建 lncrna-mirna-mrna的cerna 网络桑基图；图5为筛选出差异基因，临床验证得到cerna组合标记物miat/mirna-17-3p/galnt10在病例对照组间显著差异（*p《0.05, **p《0.01）；图6为cerna组合标记物在脑动脉瘤患者血浆中表达的roc曲线分析。
具体实施方式
14.以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施例
15.1、脑动脉瘤患者geo数据收集整个分析工作如图1所示。geo数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）全称gene expression omnibus，是由美国国立生物技术信息中心ncbi创建并维护的基因表达数据库，脑动脉瘤相关的mrna/lncrna/mirna芯片数据集均来自geo数据库。以“cerebral aneurysm/brain aneurysm/intracranial aneurysm”和“homo sapiens”和“expression profiling by array”和“non-coding rna profiling by array”为关键字共检索到20条信息。过滤标准：1)样本类型为脑动脉相关组织；2)需包含健康组；3)检测方法为微阵列芯片，基于以上条件，共有6套芯片数据（mrna和lncrna共用5套芯片数据，mirna有1套芯片数据）纳入研究。最终有68例样本用于mrna/lncrna分析，17例样本用于mirna分析。
16.2、rna差异表达分析染色体位置的可视化limma（v3.48.3）包用于筛选差异表达的rna。|log2 fc| 》 1，p.adj 《 0.05 为mrna/ncrna筛选标准。|log2 fc| 》 1，p 《 0.05 为mirna筛选标准。使用ggplot2（v3.3.5）包和omiccircos（v1.30.0）包对差异基因的表达和染色体位置进行可视化。差异基因分别标注为demrna、delncrna和demirna （图2）。
17.3、demirna 和 demrna 的权重基因共表达网络（wgcna）分析基于先前鉴定的demirna 和demrna，进行权重基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, wgcna，v1.70.3）以获取与ia相关的候选模块基因。wgcna是基于拓扑重叠识别基因共表达网络，寻找到协同表达的基因模块，并与表型进行关联的一种分析方法。通过wgcna包进行计算处理，选择一个软阈值功率 (β)，使共表达网络中节点的相关性达到 0.9，然后将相关性矩阵转换成邻接矩阵，再将邻接矩阵转化为一个拓扑重叠矩阵(tom)，以此获得不同的模块，将划分得到的模块与表型关联，挑选出与ia患病相关度高的模块进行后续分析。wgcna分析后挑选的基因分别标注为wgcnamrna和wgcnamirna （图3）。
18.4、构建cerna调控网络 lncrna-mirna-mrna上述挑选出的wgcnamrna、wgcnamirna和delncrna进行cerna网络预测：multimir（v1.14.0）包集中了8个预测mirna靶基因的网站，分别是diana-microt-cds、elmmo、microcosm、miranda、mirdb、pictar、pita 和 targetscan。设置阈值为20%，预测wgcnamirna的mrna靶基因并与wgcnamrna取交集，使用lncbook（https://ngdc.cncb.ac.cn/lncbook/index）数据库预测wgcnamirna的lncrna靶基因并与delncrna取交集，分别标注为multimirmirna-multimirmrna和lncbookmirna-lncbooklncrna。基于cerna假设原理lncrna与mrna存在表达相关性，对wgcnamrna和delncrna进行相关性分析，取|r|》0.6，p《0.01为筛选标准，分别标注为cormrna和corlncrna并与先前的关系网取交集，并分别标注为cor1mirna-cor1mrna和cor2mirna-cor1lncrna。取cor1mirna和cor2mirna共同的mirna构建lncrna-mirna-mrna的cerna网络。基因表达性关性、cerna网络分别使用ggplot2（v3.3.5）包、venndiagram（v1.7.0）包、ggalluvial（v0.12.3）包和cytoscape（v3.7.2）软件进行数据可视化。
19.5、收集临床样本临床样本验证脑动脉瘤患者血浆与健康对照组患者血浆差异表达的标志物组合，
评估其作为脑动脉瘤预测的候选标记物，用于脑动脉瘤早期辅助诊断或疗效监控的可能性。具体如下：在通过医院伦理委员会同意及患者知情同意的前体下，收集患者血浆样本用于验证实验。收集的样本包括对照组10名（5名男性，5名女性，年龄：63.40
±
7.15），实验组20名（12名男性，15名女性，年龄：64.04
±
6.94）。
20.6、荧光定量rt-qpcr验证cerna网络标记物采用常规酚氯仿法提取血浆rna，采用荧光定量rt-qpcr验证cerna网络标记物组合中所挑选的miat, linc01094, mirna-17-3p, galnt1, galnt5, galnt10, gpx8, wnt5a表达量变化。采用primer primer 5.5软件对基因miat, linc01094, galnt1, galnt5, galnt10, gpx8, wnt5a，β-actin进行引物设计，其中miat的基因序列位置是hg38, chr22: 26,646,452-26,669,655；galnt10的基因序列位置是hg38, chr5: 154,190,733-154,420,984；mirna-17-3p的基因序列是hsa-mir-17-3p，mimat0000071，5
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acugcagugaaggcacuuguag-3’； miat基因荧光定量pcr特异性上游引物：5'
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caaggtccacagaacgag-3'，miat基因荧光定量pcr特异性下游引物：5'
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tagccctaacgccaaat-3'；galnt10基因荧光定量pcr特异性上游引物：5'-aaagttggtggtgttgggaaag-3'，galnt10基因荧光定量pcr特异性下游引物：5'
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agtgggtggcaggttggtt-3'；hsa-mirna-17-3p（cd201-0017）和内参u6（cd201-0145）的rt-qpcr引物均来自北京天根公司。采用nano drop超微量分光光度计测定总rna浓度和质量。采用逆转录试剂盒revert aid first strand cdna synthesis kit (thermo fisher scientific, usa)进行合成 cdna。采用 sybr green pcr master mix (roche, us) 在 lightcycler480 lightcycler
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480 荧光定量rt-qpcr系统上进行 qrt-pcr 扩增 cdna。扩增条件：首先95℃ 10 min的变性；接着95℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1 min，共40个循环的退火反应；然后延伸反应72℃ 5min。
21.7、统计学处理使用2-δδcq法对表达数据进行处理，使用graphpad prism 8进行数据可视化以及统计学比较。* p 《 0.05，则被认为具有统计学意义。
22.8、研究结果通过wgcna分析，初步构建cerna调控网络，取cor1mirna-cor1mrna和cor2mirna-cor1lncrna共有的mirna部分，共获得了562条调控关系，其中包含3个lncrna节点，82个mirna节点，和42个mrna节点。结合以上研究结果，绘制cerna网络桑基图（图4）。
23.cerna通路分析发现，筛选出的基因组合标记物主要集中在糖基化相关通路上（粘蛋白型o-聚糖生物合成和其他类型的o-聚糖生物合成相关通路）。如图5a所示，该核心调控轴为：miat/linc01094
↑‑
mirna-17-3p
↓‑
galnt1/galnt5/galnt10/gpx8/wnt5a
↑
。
24.针对筛选出的核心调控轴，我们通过收集临床病例血浆样本，开展rt-qpcr实验进一步对该结果进行验证分析。结果发现，在脑动脉瘤患者血浆中lncrna miat（p 《 0.01，图5b）和galnt10（p 《 0.05，图5c）基因表达量显著高于对照组，而mirna-17-3p在脑动脉瘤患者血浆中的表达量显著下调（p 《 0.05，图5d）。然而在病例对照组间linc01094, galnt1, galnt5, gpx8和wnt5a基因的表达量没有显著差异（p 》 0.05，图5e-i）。
25.进一步，我们采用roc曲线分析对cerna网络组合标记物的诊断能力进行分析。结果显示miat基因表达水平的线下auc面积为0.83，最佳临界点时的敏感度为77.8%，特异性
为80.0%; galnt10基因表达水平的auc面积为0.79，最佳临界点时的敏感度为74.1%，特异性为90.0%; mirna-17-3p表达水平的auc面积为0.72，最佳临界点时的敏感度为66.7%，特异性为30.0%；两两组合后分析显示miat和galnt10表达水平组合后的auc面积为0.87，最佳临界点时的敏感度为70.4%，特异性为90.0%；miat和mirna-17-3p表达水平组合的auc面积为0.92，最佳临界点时的敏感度为100.0%，特异性为80.0%；galnt10和mirna-17-3p表达水平组合后的auc面积为0.88，最佳临界点时的敏感度为92.6%，特异性为70.0%；三个标志物组合后的auc面积为0.96，最佳临界点时的敏感度为92.6%，特异性为90.0%。
26.本发明一种检测cerna网络组合标记物表达量的试剂盒及其应用，在辅助诊断脑动脉瘤的检测试剂盒具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点。本发明采用上述试剂盒对cerna网络组合标记物miat和galnt10基因表达水平进行检测，能够快速、可靠地为脑动脉瘤的辅助诊断、检测或筛查药物提供借鉴。
27.本发明的最佳实施例已被阐明，由本领域普通技术人员做出的各种变化或改型都不会脱离本发明的范围。
28.上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。