康德拉氏副球菌及其应用

1.本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及康德拉氏副球菌及其应用。


背景技术：

2.污水中氮元素的排放量较大，来源也十分广泛，主要来源是城市生活污水、工业废水、农业生产污水和垃圾渗滤液。氮素(硝态氮, 氨态氮等)含量过高会使水环境产生毒害作用。其中以氨态氮和亚硝态氮的毒性作用尤为明显，会严重影响水生生态系统，no
2-‑
n 转化速率低、毒性大，会造成人体产生中毒、呕吐以及休克等症状，严重危及人类生命健康。因此，含氮污水脱氮处理显得尤为重要。
3.目前主要利用物理法、化学法和生物法进行脱氮处理。前两者具有费用高和易造成二次污染等缺陷，而生物脱氮法具有费用低、脱氮效率高、无二次污染等优势，因此生物脱氮法被广泛应用。生物脱氮技术主要通过氨化作用、硝化作用、反硝化作用以及固氮作用来实现污水脱氮。
4.近年来随着新型脱氮工艺如同步硝化/反硝化(snd)、短程硝化/反硝化(pnd)和短程硝化/厌氧氨氧化(pna)的深入研究和应用，弥补了传统脱氮工艺高处理成本和低脱氮效率的缺陷，特别是在高氨氮或低c/n废水处理方面具有十分显著的优势。
5.目前，单纯的硝化作用仅能使氨态氮和亚硝态氮转化为硝态氮，无法彻底解决水环境氮素超标的问题，反硝化尤其是好氧反硝化是去除氮素污染的重要途径。目前已经筛选到的部分异养硝化好氧反硝化菌生长与代谢速度缓慢，积累no
2-‑
n，不适用于实际污水处理。此外，目前报道的异养硝化好氧反硝化菌在脱氮处理过程中需要外源添加较为昂贵的葡萄糖，并依赖较高的c/n比才具有较好的脱氮处理能力，显著提升了微生物脱氮的处理成本。基于以上考虑，筛选并鉴定具有更高脱氮能力并不依赖较高c/n比的异养硝化好氧反硝化新型菌成为目前开发微生物污水脱氮处理的关键。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种康德拉氏副球菌及其应用的技术方案。
7.本发明具体采用以下技术方案：本发明一方面提供了一株康德拉氏副球菌（paracoccus kondratievae）zjb21134，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，分类命名为康德拉氏副球菌zjb21134（paracoccus kondratievae zjb21134），保藏编号为cctcc no：m20211514，保藏日期2021年11月30日。
8.本发明另一方面提供了康德拉氏副球菌zjb21134在含氮污水脱氮处理中的应用。
9.进一步，该应用包括以下步骤：将康德拉氏副球菌zjb21134接种至含氮污水中，添加碳源至c/n比值为5～20，于ph7～9、25℃～35℃、80～200rpm下进行培养，去除废水中的氨氮。
10.进一步，所述碳源为蔗糖。
11.进一步，添加碳源至c/n比值为5，于ph8、30℃、160rpm下进行培养。
12.与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明的康德拉氏副球菌zjb21134（paracoccus kondratievaezjb21134），可以利用丁二酸钠和蔗糖为碳源，且廉价的蔗糖为最优碳源、c/n为5、ph为8、温度为30℃、转速为160rpm的条件下好氧培养6h时有最优脱氨氮效果，为98.51%。同时该菌株对硝氮和亚硝氮均有很好清除效果，这对开发高效脱氮生物菌剂并降低微生物脱氮的处理成本具有重要的实际意义。
附图说明
13.图1为本发明康德拉氏副球菌zjb21134的电镜图。
14.图2为本发明康德拉氏副球菌zjb21134 16s rdna的系统发育树。
15.图3为本发明康德拉氏副球菌zjb21134对氨氮降解能力的示意图。
16.图4为本发明康德拉氏副球菌zjb21134对硝氮降解能力的示意图。
17.图5为本发明康德拉氏副球菌zjb21134对亚硝氮降解能力的示意图。
18.图6为本发明康德拉氏副球菌zjb21134在不同碳源下的脱氮效率示意图。
19.图7为本发明康德拉氏副球菌zjb21134在不同碳氮比下的脱氮效率示意图。
20.图8为本发明康德拉氏副球菌zjb21134在不同ph下的脱氮效率示意图。
21.图9为本发明康德拉氏副球菌zjb21134在不同温度下的脱氮效率示意图。
22.图10为本发明康德拉氏副球菌zjb21134在不同转速下的脱氮效率示意图。
具体实施方式
23.以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。实施例中如无特殊说明，均为常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规试剂或按常规方法配制的试剂：实施例1：一株康德拉氏副球菌的筛选及鉴定取2~3g杭州某污水处理公司的生物转盘泥样加入到装有100ml无菌水的锥形瓶中，于摇床上震荡3h后，用移液枪吸取2ml液体接种于已灭菌的lb培养基中，于30℃，180rpm条件下培养2~3d。
24.上述lb培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1000ml，自然ph。
25.取菌种培养液接入装有无菌水的试管中，按比例进行稀释，分别得到菌种浓度为10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
和10-8
梯度的细菌悬浮液；然后采用平板涂布法，分别从各梯度细菌悬浮液中吸取100μl涂布于溴百里酚蓝（btb）固体培养基上，30℃培养4d，挑取变蓝的菌落进行划线分离，分离纯化3次以上直至菌落特征基本一致，然后接种于斜面培养基上并保存于4℃冰箱。
26.所述溴百里酚蓝（btb）固体培养基按如下组成配制：硝酸钾（kno3）1.01g，丁二酸钠（c4h4na2o4）8.5g，七水硫酸镁（mgso4·
7h2o）1.0g，磷酸二氢钾（kh2po4）1.0g，七水硫酸亚铁（feso4·
7h2o）0.59g，氯化钙（cacl2）0.09g，1%溴百里酚蓝乙醇溶液1ml，蒸馏水定容至
1000ml，琼脂20g，用1mol/l naoh调至ph 7.0-7.3。
27.从btb固体培养基上筛选得到的一株异养硝化-好氧反硝化细菌，利用细菌通用引物27f：5
′‑
agagtttgatcmtggctcag-3
′
，1492r：5
′‑
tacggytaccttgttacgactt-3
′
对其进行pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳（1％）验证；电泳检测，切胶纯化测序，由擎科生物进行序列测定。
28.pcr反应体系（50μl）：25μl采用的高保真酶为phusion high-fidelity pcr master mix with hf buffer；各3 μl (10 μm)前后f/r引物；10 μldna模板6μl ddh
2 o 。配置好的pcr体系按照如下反应条件进行pcr扩增：预变性98℃ 30s，接下来25个循环：变性98℃ 15s 退火58℃15s 延伸72℃15s；终延伸72℃1min。pcr产物用ampure xp beads (beckman coulter, indianapolis, in)纯化，并且使用picogreen dsdna assay kit (invitrogen, carlsbad, ca, usa)进行量化。
29.菌株zjb21134的16s rdna序列长度为1359bp，其基因序列如seq id no.1所示。
30.将菌株序列结果上传至ncbi数据库，与数据库中已有的细菌16s rdna基因序列进行比对，结果表明该菌为paracoccus kondratievae。通过mega.7.0软件的邻位连接法构建系统发育树，分析菌株的遗传学特征、确定其的种属情况及在遗传学上的进化地位，结果见图2。
31.菌株zjb21134命名为康德拉氏副球菌（paracoccus kondratievae），株号zjb21134，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m20211514，保藏日期2021年11月30日。
32.菌株zjb21134的电镜图如图1所示。其生物学特征为：革兰氏阴性菌，淡粉色圆形小菌落，边缘光滑，湿润，粘稠，易挑取。适宜ph为7.0～9.0，适宜生长温度为30～40℃。
33.实施例2：康德拉氏副球菌zjb21134硝化/反硝化能力鉴定硝化培养基配方为：硫酸铵（(nh4)2so4）0.47g，丁二酸钠（c4h4na2o4）5.06g，硫酸镁（mgso4）0.1g，磷酸二氢钾（kh2po4）0.1g，磷酸氢二钾（k2hpo4）0.1g，微量元素溶液20ml，蒸馏水定容至1000ml，ph值7.0-7.5；其中微量元素溶液包括：edta 50g，七水硫酸锌（znso4·
7h2o）3.92g，氯化钙（cacl2）5.5g，四水氯化锰（mncl2·
4h2o）5.1g，七水硫酸亚铁（feso4·
7h2o）5.0g，四水钼酸铵（(nh4)6mo7o
24
·
4h2o）1.1g，五水硫酸铜（cuso4·
5h2o）1.6g，六水氯化钴（cocl2·
6h2o）1.6g，用蒸馏水定容至1000ml。反硝化培养基将硝化培养基中的硫酸铵（(nh4)2so4）0.47g替换为硝酸钾（kno3）0.72g或亚硝酸钠（nano2）0.49g，其余配方保持不变。
34.处理方式为：接种2%种子液（种子液为lb培养基30℃，160rpm培养12h的菌悬液），30℃、160rpm培养。定期取样分别测定上清液中的中nh
4+-n、no3⁻‑
n、no2⁻‑
n和od
600
值，结果见图3至5。
35.结论：可以看到，菌株在0-3h处于氨氮降解的延滞期，3h后氨氮浓度迅速下降，6h时氨氮降解率达到98.92%，同时未发现有硝酸盐和亚硝酸盐的积累，具有良好的硝化反硝化能力。此外，菌体在整个氨氮降解过程中一直处于对数生长期。
36.实施例3：不同环境因子对康德拉氏副球菌zjb21134脱氮效能的影响无碳源基础培养基：(nh
4)2
so42g，k2hpo
4 0.75g，nah2po
4 0.25g，mnso4·
4h2o 0.01g，caco
3 5g，mgso4·
7h2o 0.03g，h2o 1000ml。种子液为实施例1中lb培养基30℃，160rpm培养24h后的菌悬液。
37.（1）不同碳源对菌株zjb21134脱氮效率的影响
固定碳源含量均为5g/l（以c计），改变碳源种类葡萄糖、蔗糖、丁二酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠作为碳源，接种2%种子液，在30℃，160rpm条件下，培养6h，测定其脱氮效率，结果如图6所示。表明丁二酸钠为碳源时，氨氮降解率为93.89%，而以蔗糖为碳源时，氨氮降解率为98.92%，远远高于含量相同（以c计）的葡萄糖，柠檬酸钠，乙酸钠作为碳源时的氨氮降解率。蔗糖来源广泛，价格低廉，可以作为实际污水处理的廉价碳源，降低了处理成本。
38.（2）不同c/n条件下对菌株zjb21134脱氮效率的影响以上述无碳源基础培养基为基础，设计添加蔗糖量分别为0.68g/l、1.71g/l、3.42g/l、5.13g/l、6.84g/l，使c/n比值分别为2、5、10、15、20时，接种2%种子液，在30℃，160rpm条件下，培养6h后，测定其脱氮效率，结果如图7所示，表明当c/n质量比值为15时，氨氮清除率最高，达到98.77%。此外，当c/n比例为5-10时，也有较好的氨氮去除能力，分别达到98.12%和98.44%，减少了外源添加高比例碳源的成本投入，因此，显示了该菌株在实际污水脱氮应用中的潜力。
39.（3）不同ph值对菌株zjb21134脱氮效率的影响在上述无碳源基础培养基加入蔗糖5.13g/l时，c/n比值为15，调ph值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，接种2%种子液，在30℃、160rpm条件下培养6h，测定培养基中残留nh
3-n含量如图8所示。当培养基的ph为8时，氨氮清除率达到97.62%，可见该菌株在ph为8附近时，脱氮能力最强。
40.（4）不同温度条件下对菌株zjb21134反硝化效能的影响采用上述无碳源基础培养基中加入蔗糖5.13g/l，c/n比值为15，调ph为8，接种zjb21134种子液2%，在160rpm条件下，改变培养温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，6h后检测残留硝氮清除率如图9所示，当温度为30℃时反硝化效率最高，达到98.51%。
41.（5）不同转速条件下对菌株zjb31134反硝化效能的影响采用上述无碳源基础培养基中加入乙酸钠6.0 g/l，调ph为6.1，接种zjb21134种子液2%在30℃条件下，改变摇床转速分别为90、120、150、180、210rpm，6h后检测残留硝氮清除率如图10所示，当转速为160rpm时反硝化效率最高，达到99.13%。
42.综上所述，康德拉氏副球菌zjb21134在以蔗糖为最优碳源并在c/n比值为15、ph为8、培养温度调节为30℃、160rpm条件下好氧培养6h时，该菌株的脱氮效率最强，达到98.51%。
43.实施例4：康德拉氏副球菌zjb21134在污水处理中的应用污水样品取自杭州某污水处理厂。取1l上述污水水样，按照每瓶100ml污水分装后，接种2%种子液（zjb21134种子液为实施例2中lb培养基在30℃，160rpm条件下培养12h后的菌悬液），添加1.17g蔗糖（由c/n=5计算得出）；在30℃、160rpm下摇床培养24h。取样测定污水处理前后总氮、氨氮和亚硝氮浓度，测定结果表1污水水样检测处理前后水体变化
由表1可知，本菌种在较低的c/n比例情况下，对较高含氮浓度污水中的氨氮和硝氮均有很好的脱氮效果，且处理过程不会造成亚硝氮的积累，同时避免了外源添加过多碳源的需求，减少了实际的处理成本。因此，相较于现有的菌种，本菌种应用范围广，能够丰富环境微生物的菌种库，提供高效脱氮的环境微生物，为不同程度的污染水体提供了解决方案。