Optineurin在制备诊断和治疗肝硬化药物中的应用

optineurin在制备诊断和治疗肝硬化药物中的应用
技术领域
1.本发明属生物制药领域，涉及optineurin在制备诊断和治疗肝硬化药物中的应用。


背景技术：

2.肝硬化是多种致病因素长期作用导致细胞外基质(ecm)过度沉积形成纤维的进行性肝损伤，伴有腹水、脓毒症、肝性脑病、肝肾综合征等并发症，若不及时治疗会导致多脏器功能衰竭甚至肝癌，最终导致患者死亡。肝星状细胞(hepatic stellate cells,hscs)的激活是导致ecm过度沉积引起肝硬化的关键原因：hscs受多种刺激因子诱导激活，激活的hsc合成分泌大量胶原蛋白，导致ecm过度沉积形成纤维，引起肝硬化。在我国，肝硬化非常普遍，毒物和药物性肝病、胆汁淤积性肝病、病毒性肝炎、酒精性和非酒精性脂肪肝炎等多种慢性肝病均可引起肝硬化。临床上通过血常规(谷丙转氨酶、谷草转氨酶、免疫性蛋白)、腹腔积液等检查评估肝功能，通过影像学和肝穿刺活检对肝硬化进行h&e染色进行病理诊断。但肝硬化病因多样、病理动态变化及病情的复杂性，使肝硬化的早期诊断较为困难，大多数病人在中后期才被诊断而被耽误了治疗。因此，实现肝硬化诊断的精准性和有效性对肝硬化的防治具有重要意义。
3.肝硬化的临床治疗手段非常有限，目前临床上主要通过去除致病因素减轻肝脏持续损伤，缓解肝硬化进程，比如，采用抗病毒药物清除慢性肝炎病毒，治疗病毒性肝硬化；采用激素和免疫抑制剂治疗免疫性肝硬化。当前缺乏有效的抗肝硬化药物，肝硬化严重者只能通过肝移植治疗。此外，尽管有效的病因治疗可缓解部分纤维形成，但某些肝病如遗传代谢性肝病缺乏病因治疗，纤维无法得到缓解。因此，临床上急需高效的抗肝硬化治疗药物。
4.optineurin(视神经蛋白)蛋白是由optn基因编码，被认为是原发性开角型青光眼、肌萎缩侧索硬化症等神经退行性疾病的病理学标记蛋白。optineurin蛋白广泛参与多种细胞过程，包括调控高尔基体膜运输、抗病毒先天免疫反应、细胞有丝分裂、核因子-κb(nf-κb)通路等。现有研究指出optn在肝癌患者的肿瘤组织中呈现低表达，但至今尚没有其对肝星状细胞和肝硬化作用的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供optineurin在制备诊断和治疗肝硬化药物中的应用，是一种靶向optineurin(optn)蛋白的抗体在制备诊断和治疗肝硬化药物中的应用，optn可作为肝硬化疾病的标记分子，本发明可提高肝硬化诊断的准确性。所述optn蛋白氨基酸序列如seq id no.1所示。所述抗体为能与optn蛋白特异性结合的抗体，包括在小鼠、大鼠、兔、山羊和其他免疫动物为宿主制备的单/多克隆抗体，采用杂交瘤技术制备的单克隆抗体以及基因工程抗体。
6.所述药物为包含抗体以及一种或多种蛋白保存所需辅料的混合物，所述辅料优选为叠氮化钠、明胶、甘油、三羟甲基氨基甲烷等。所述混合物ph值为7.3-7.4。
7.所述肝硬化疾病包括但不仅限于毒物和药物性肝病、胆汁淤积性肝病、病毒性肝炎、酒精性和非酒精性脂肪肝炎等多种慢性肝病引起的肝硬化。
8.本发明提供了一种靶向optn基因的引物在制备诊断肝硬化药物中的应用。所述optn基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述引物至少包括以下一对特异性扩增optn基因的引物：
9.正向引物1：5
’‑
gaaagagcagcgagagagaaa-3’(seq id no.3)，反向引物1：5
’‑
ctccgtcttcgaaagcatca-3’(seq id no.4)；
10.或正向引物2：5
’‑
gggagcacagagaaagagaatg-3’(seq id no.5)，反向引物2：5
’‑
agcctcttgaagctccttaaac-3’(seq id no.6)；
11.或正向引物3：5
’‑
cctaagggaagggaatcagaag-3’(seq id no.7)，反向引物3：5
’‑
cctctgtctgggtttcaatct-3’(seq id no.8)。
12.所述药物包括用实时定量pcr、免疫检测、原位杂交或基因芯片诊断肝硬化的药物。
13.本发明提供了一种靶向optn基因的干扰sirnas，所述optn基因编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述optn基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述的干扰sirnas的核苷酸序列优选为：
14.seq id no.9:5
’‑
gccaugaagcuaaauaaucaa-3’(#1)；seq id no.10:5
’‑
cgugauggauugcaucauuua-3’(#2)。
15.本发明提供了一种靶向optn基因的干扰sirnas在制备治疗肝硬化治疗药物中的应用。所述药物包括：通过rna干扰抑制optn基因表达的双链核糖核酸，或靶向optn基因的多肽类药物，或靶向optn基因的改构病毒类药物，或用于抑制optn蛋白活性的蛋白质，或用于抑制optn蛋白功能的小分子化合物。所述药物的制剂形式为液体制剂或固体制剂。
16.optn蛋白是由optn基因(genebank no.nm_001008211.1)编码而来，optn基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，该optn基因编码含有丝氨酸蛋白的神经丝蛋白，目前被报道与原发性开角型青光眼、肌萎缩性侧索硬化症、肝癌等疾病相关，但optn能否作为肝硬化的标记分子和治疗靶点尚无研究报道。本发明实验证明在肝硬化病人和动物肝组织中，optn蛋白发生显著上调；小鼠中敲除optn可显著减少胶原合成，缓解肝硬化的严重程度；同时，机制研究指出optn通过tgf-β信号正性调控肝星状细胞激活。因此，optn可作为肝硬化诊断和治疗的特异性标志，采用optn蛋白的药物可以提高肝硬化诊断的准确性，采用靶向optn基因的干扰sirnas可以提高肝硬化治疗的有效性。
17.现有的肝硬化诊断技术是对肝组织样本采用h&e染色，原理是采用苏木精使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色，采用伊红染料使细胞质和细胞外基质中的成分着红色，在显微镜下根据细胞的大小形态异常来判断肝脏病理变化，特别依赖于专业技术人员的经验，并且花费时间比较久。本发明与现有技术的区别在于，原理是利用免疫组织化学技术采用optn抗体药物对肝组织样本的optn蛋白进行定量检测，根据optn蛋白的表达水平来诊断肝硬化的级别，优点是不依赖于人的经验决断，可以通过仪器软件自动分析optn的蛋白表达水平进行诊断，减少肝硬化的误诊率，此外通过仪器分析可以批量操作并提高效率，大大节约了患者的治疗时间。
18.现有的肝硬化临床上治疗药物主要是针对肝硬化病因的治疗药物，如抗病毒药
物，免疫抑制剂等，可以有效阻止肝硬化的进程，但该方法的前提是对患者的诊断已经非常清晰，并明确其肝硬化发病的主要致病因素，而对于只诊断出肝硬化的症状但不确定致病因素的患者并不适用。本发明与现有技术的区别在于，本发明是主要针对肝硬化症状的治疗药物，发现肝纤维化/肝硬化形成过程中的关键调控蛋白optn，构建抑制optn蛋白表达的干扰sirnas进行肝硬化的治疗，优点是对所有的肝硬化患者都适用，增加了肝硬化患者的治疗选择。
附图说明
19.图1是本发明通过研究和分析肝硬化病人数据库和肝硬化病人肝组织发现optn蛋白在肝硬化患者的肝组织中表达显著升高，以及optn抗体药物在肝硬化组织中的诊断应用。
20.图2是本发明通过数据库分析和optn抗体药物检测发现optn在肝硬化小鼠肝组织中的表达显著升高。
21.图3是本发明通过optn基因敲除小鼠发现optn缺失明显缓解肝硬化模型小鼠的症状。
22.图4是本发明将靶向optn基因的干扰sirnas(seq id no.9，seq id no.10)应用于人肝星状细胞系lx-2细胞，发现靶向optn基因的干扰sirnas显著抑制肝星状细胞的激活。
23.图5是本发明将靶向optn基因的干扰sirnas(seq id no.9，seq id no.10)应用于人肝星状细胞lx-2细胞，发现p-smad2/3受到显著抑制，但p-tbk1和lc3 ii/i没有影响。
具体实施方式
24.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
25.实施例1：利用geo数据库分析gse 25097数据集，比较肝硬化患者和正常人中optn的mrna水平，如图1a结果显示在肝硬化患者肝组织中，optn的表达明显上调，并与胶原相关基因col1a1及肝星状细胞激活标记基因acta2呈正相关。利用肝硬化病人肝组织石蜡切片样本，脱腊后通过optn抗体药物检测optn蛋白表达，该药物中的抗体为针对人源optineurin蛋白n端150-190氨基酸表位定位的小鼠单克隆抗体，辅料为0.1％叠氮化钠和0.1％明胶。如图1b所示，相比于健康患者，肝硬化病人中optn蛋白表达发生明显增加，并且optn蛋白表达与肝硬化病人疾病进程呈正相关，与现有技术中的h&e染色结果一致，表明optn抗体药物在人肝硬化组织中有良好的诊断效果。
26.实施例2：利用geo数据库分析gse 55747数据集，比较肝硬化小鼠和正常小鼠中optn的mrna水平，如图2a结果显示在肝硬化肝组织中，optn的表达明显上调。取wt小鼠，将小鼠进行胆管结扎构建胆汁淤积型肝硬化动物模型；或每周两次给予灌胃25％四氯化碳(ccl4)构建毒物诱导型肝硬化动物模型。收集组织样本进行石蜡包埋并切片后，采用optn抗体药物检测optn蛋白的表达情况。如图2b结果显示，与正常对照组相比，optn蛋白在胆汁淤积型和毒物
诱导型肝硬化动物模型的肝组织中的纤维沉积区域发生显著增加，提示optn抗体药物在小鼠肝硬化组织中有良好的诊断效果。
27.实施例3：取野生型(wt)和optn基因敲除(optn-/-)小鼠构建胆管结扎或ccl4诱导的肝硬化动物模型，收集肝脏样本进行石蜡切片后进行h&e染色和天狼猩红染色考察两种小鼠的病理症状。如图3结果显示，optn缺失的小鼠肝脏肝细胞坏死和胶原纤维形成显著少于野生型小鼠(图3a)。提取肝脏样本中的蛋白和rna，optn缺失显著降低胶原蛋白col1a1和α-sma表达(图3b)，optn缺失显著抑制纤维化相关基因acta2，col1a1，timp1，tgfb的mrna水平(图3c)。这些结果表明optn蛋白缺失能显著缓解肝硬化症状，包括肝细胞坏死和纤维化形成，表明抑制optn蛋白表达是一种有效的治疗肝硬化症状的策略。
28.实施例4：肝纤维化的形成主要是由肝星状细胞激活并分泌胶原产生的。在传代培养的人肝星状细胞系lx-2细胞中，应用2个靶向optn不同序列的干扰sirnas(seq id no.9,seq id no.10)及阴性对照nc作用36h后，再给予肝星状细胞激活诱导剂tgf-β刺激24h，western blot检测optn蛋白、胶原蛋白fibronectin和肝星状细胞激活蛋白α-sma的蛋白表达。结果显示(图4)，与正常对照组比较，干扰sirnas(seq id no.9,seq id no.10)有效地抑制optn蛋白表达，同时降低fibronectin和α-sma的蛋白表达，表明optn蛋白的干扰sirnas抑制肝星状细胞激活及胶原分泌，表明optn蛋白的干扰sirnas显著抑制肝纤维化形成，进而治疗肝硬化。
29.实施例5：在lx-2细胞中，应用2个靶向optn不同序列的干扰sirnas(seq id no.9,seq id no.10)及阴性对照nc作用36h后，再给予tgf-β刺激，western blot检测tgf-β信号通路中smad2/p-smad2蛋白和smad3/p-smad3蛋白，自噬信号通路中p-tbk1和lc3 ii/i蛋白表达。结果显示，与正常对照组比较，干扰sirnas有效降低tgf-β诱导的p-smad2/3，抑制tgf-β下游传导(图5a)，但干扰sirnas不影响tgf-β对p-tbk1及lc3 ii/i表达(图5b)，提示靶向optn的干扰sirnas抑制肝星状细胞激活是通过tgf-β/smad2/3信号通路发挥作用的，而不依赖于其自噬信号通路。