斑叶稠李叶绿体基因组及在品种鉴定中的应用的制作方法

1.本发明属于基因技术领域，具体涉及斑叶稠李叶绿体基因组及在品种鉴定中的应用。


背景技术：

2.斑叶稠李prunus maackii，又称斑叶樱，是蔷薇科李属落叶小乔木。分布在我国黑龙江、吉林、辽宁等地，海拔950-2000米的针叶阔叶混交林中或针叶林缘。斑叶稠李叶片卵状披针形、椭圆披针形或菱状卵形，先端长渐尖，叶下部沿脉被褐色柔毛；总状花序，花梗密被稀疏短柔毛，花白色，先端啮齿状，花期4-5月。斑叶稠李总状花序小花数目小于20个，介于稠李亚属与樱亚属之间，其形态特征与樱亚属植物具有高度的一致性，且可与樱亚属中的黑樱桃prunus maximowiczii自然杂交。近年来，部分学者从形态学和分子生物学研究结果均倾向于将其归为樱亚属植物(li and jiang，1998；shi et al.，2013)。但是，由于研究材料亲缘关系较近、分子标记多态性位点有限导致分辨率不足等原因，目前使用的分子标记得出的结果支持率相对较低，无法揭示斑叶稠李特有的遗传信息，从而影响鉴定的准确性。因此，开发可靠、有效的斑叶稠李鉴定方法势在必行。
3.超级条形码是将叶绿体全基因组序列作为dna条形码对物种进行识别和鉴定的分子生物学技术(kane and cronk，2008)。与常规的dna条形码相比，超级dna条形码能够克服基因缺失、样品dna降解、测序质量低等对条形码的使用限制。高等植物的叶绿体基因组为双链闭合环状dna，具有高度保守的四分体结构，长度为120-160kb(cai et al.，2003；brouard et al.，2010)；长度的增加使得超级条形码比一般短序列的条形码能提供更多的变异位点和更丰富的遗传信息，尤其在较低分类等级中的分辨力更强，鉴定能力更为突出。相比较线粒体基因组和核基因组，叶绿体基因组具有大小适中、核苷酸置换率适中、编码区和非编码区的分子进化速度差异显著、且各类群间具有良好的共线性等优点(clegg et al.，1994)，更适合作为超级条形码。parks等利用37个松属(pinus)植物及其近缘种的叶绿体基因组，完成松属内部系统学研究，在分支的分辨率和支持率上都远远高于以往基于多个分子片段的研究结果(parks et al.，2009)。这一研究成果首次证实了叶绿体全基因组序列用于低阶元分类群鉴定的可行性。之后，叶绿体基因组在青篱竹族(anmdinarieae)(zhang et al.，2012)、兰属(cymbidium)(yang et al.，2013)、椴树属(tilia)(蔡杰，2016)、柑橘属(citrus)(杨晓明，2017)、罗汉果属(siraitia)(shi et al.，2019)、山茶(camellia)(li et al.，2019)等类群的研究中也表现出明显的优势，尤其在亲缘关系较近的物种鉴定中优势更为突出。这为我们利用叶绿体基因组序列作为超级条形码来鉴定斑叶稠李提供了有益探索。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供斑叶稠李叶绿体基因组，用以填补现有技术的基因数据库没有斑叶稠李叶绿体基因组序列的空白，能够用于鉴别斑叶稠李品种，为樱亚属种质资源
的保护、物种鉴定提供技术支撑。
5.为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
6.本发明的目的之一在于提供斑叶稠李叶绿体基因组，其核苷酸序列如seq id n0.1所示。
7.本发明的目的之二在于提供斑叶稠李叶绿体基因组在鉴定斑叶稠李和/或重建李属系统发育树中的应用。
8.本发明还公开了一种斑叶稠李品种鉴定方法，所述鉴定方法包括：
9.(1)采用mctab法提取样品总dna提取；
10.(2)对提取的总dna进行双末端测序；
11.(3)叶绿体基因组拼接和组装；
12.(4)将组装好的样品叶绿体基因组核苷酸序列与斑叶稠李的叶绿体基因组核苷酸序列进行比对，当其相似指数达到99.9％以上时，才确定为斑叶稠李。
13.具体地，步骤(3)所述叶绿体基因组拼接和组装的方法具体为：
14.(1)利用spades 3.6.1软件对高通量测序数据进行de novo组装，k-mer参数设置为95；
15.(2)基于已经公开发表的樱花叶绿体基因组序列作为参考序列，利用sequencher软件从组装的数据中挑选出属于叶绿体基因组的片段，进行初步组装；
16.(3)利用geneious软件，将初步组装的结果与原始序列进行比对，确定序列的位置，完成叶绿体基因组的拼接和组装，并进行人工校对；
17.(4)使用plann和sequin软件完成叶绿体基因组的注释和校对，从而获得完整的斑叶稠李叶绿体基因组，利用在线软件dogma绘制叶绿体基因组注释图。
18.本发明具有如下优点：
19.本发明首次公开了斑叶稠李的叶绿体基因组，并将其应用于斑叶稠李的系统发育研究中，解析了斑叶稠李在樱亚属中的系统发育地位。该研究结果对今后樱亚属物种的育种和保护具有重要意义。
20.本研究利用分子系统学和系统发育基因组学方法，通过叶绿体基因组建立樱亚属物种的系统发育关系，在此基础上，利用叶绿体全基因组作为樱亚属的一个超级dna条形码，用于鉴别樱花品种，为樱花种质资源的保护、物种鉴定提供技术支撑，对于典型樱亚属植物的育种以及遗传多样性评价、保护与利用具有重要意义。
附图说明
21.图1是斑叶稠李叶绿体基因组结构图；
22.图2是基于叶绿体基因组的李属系统发育树；
23.图3待鉴定样品与斑叶稠李叶绿体基因组核苷酸序列比对图；
24.图4待鉴定样品与斑叶稠李160bp-200bp位点比对图；
25.图5是待鉴定样品与斑叶稠李116610bp-116690bp位点比对图；
26.图6是待鉴定样品与李属物种系统发育关系；
27.图7是待鉴定样品与滨州樱桃比对图。
具体实施方式
28.下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
29.如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
30.如无特殊说明，本发明采用的各种试剂以及材料均能从市场上购买。
31.一.材料与方法
32.1.植物总dna提取
33.本发明采用mctab法对样品的总dna进行提取，mctab法即一种改良的ctab法技术提取dna，这种提取方法提取成本低，提取效果稳定，获得的dna质量较高(李金璐等，2013)。将提取好的dna置于-20℃冰箱保存备用。
34.2.植物总dna测序方法
35.用超声波打断总dna，切胶回收400-600bp的dna片段，利用的建库试剂盒构建500bp大小的dna文库，在illumina hiseq 4000pe150 platform(illumina，san diego，ca)进行双末端测序，获取2x 150bp的双端片段；保证每个个体的测序深度不低于30
×
(不少于10gb数据)。
36.3.数据分析方法
37.利用spades 3.6.1软件对高通量测序数据进行de novo组装，k-mer参数设置为95；
38.基于已经发表的李属叶绿体基因组序列作为参考序列，利用sequencher(v5.4)软件从组装的数据中挑选出属于叶绿体基因组的片段，进行初步组装；
39.利用geneious(r10.2.3)软件，将初步组装的结果与原始reads进行mapping，完成叶绿体基因组的拼接和组装，并进行人工校对；
40.使用plann和sequin软件完成了叶绿体基因组的注释和校对，从而获得完整的叶绿体基因组，利用在线软件dogma(dual organellar genome annotator)绘制叶绿体基因组注释图。
41.4.系统发育分析方法
42.将组装好的样品叶绿体基因组与genbank上下载的已公布的李属物种叶绿体基因组序列合并，利用mafft(v7)软件进行序列比对，通过bioedit软件对数据进行手工调整。
43.通过modelfinder软件，基于bic(bayesian information criterion)标准筛选最佳模型；利用phylosuite软件中的iq-tree模块，采用最大似然法(maximum likelihood，ml)，自展值设置10000次重复，进行系统发育树重建。
44.二、结果与分析
45.1.斑叶稠李叶绿体基因组分析
46.斑叶稠李的叶绿体基因组大小为158015bp，总gc含量为36.7％；包含一对26408bp大小的反向重复序列，gc含量为42.5％；一个大小为19142bp的小单拷贝区域，gc含量为30.2％；一个大小为86057bp的大单拷贝区域，gc含量为34.5％(图1)。
47.整个叶绿体基因组总共有129个基因得到注释(见表1)，包含84个蛋白编码基因，37个转运rna基因，8个核糖体rna基因。在这些基因中，大多数基因都是单拷贝基因，除此之外，6个蛋白编码基因，7个转运rna基因和4个核糖体rna基因是寡拷贝基因。
48.表1斑叶稠李叶绿体基因组的注释基因信息
[0049][0050]
(
×
2)indicates duplicated genes in ir regions
a indicates genes containing a single intron
b indicates genes containing two introns
[0051]
2斑叶稠李系统发育分析
[0052]
将组装好的斑叶稠李叶绿体基因组数据与genbank上下载的已公布的李属物种叶绿体基因组序列合并、比对；其中，genbank上已公布的樱亚属物种叶绿体基因组24个，具体参见表2；选择李属物种8个作为外类群，具体参见表3。
[0053]
表2 genbank中公布的樱亚属物种叶绿体基因组序列
[0054]
[0055][0056]
表3外类群物种叶绿体基因组序列
[0057]
属名种名genbank idprunusdulcisnc034696prunushumilismf405921prunusmumenc023798prunuspaduskp760072prunuspersicahq336405prunussalicinabop002868prunusserotinamf374324prunustomentosanc036394
[0058]
基于bic(bayesian information criterion)标准筛选最佳模型，得出最佳模型为tvm+f+i+g4。基于最佳模型，利用iq-tree模块，采用最大似然法(maximum likelihood，ml)进行系统发育树重建。基于叶绿体基因组的李属系统发育树见图2所示。结果显示，斑叶稠李与稠李聚为一支，其分化节点的自展支持率为100。
[0059]
3斑叶稠李分子鉴定方法
[0060]
本案例提供一种斑叶稠李的分子鉴定方法，以及基于叶绿体全基因组的李属物种的系统发育关系重建；对某个丢失了植物标签，且形态性状疑似斑叶稠李的李属植物标本prunus sp.进行鉴定。
[0061]
具体步骤如下：
[0062]
采用mctab法进行植物叶片dna提取，利用illumina hiseq pe150进行双末端测序；利用spades 3.6.1软件对高通量测序数据进行de novo组装，利用sequencher(v5.4)和geneious软件，完成样品叶绿体基因组的拼接和组装；使用plann和sequin软件完成了叶绿体基因组的注释和校对。
[0063]
将组装好的待鉴定样品与斑叶稠李的叶绿体全基因组数据进行比对，利用geneious(r10.2.3)软件的pairwise alignment功能进行详细比较，发现待鉴定样品的叶绿体基因组总长为157973bp，与斑叶稠李158015bp，存在1799bp的差异，相似指数为98.6％。下图3中浅绿色线位置为两者存在差异的位点，具体可参照图4和图5。
[0064]
因此，说明待鉴定样品不是斑叶稠李。将待鉴定样品与genbank上已公布的李属物种叶绿体基因组序列进行比对，构建系统发育关系，结果见图6。待鉴定样品prunus sp.与滨州樱桃prunus pensylvanica聚为一个分支，分支支持率为100。而没有与斑叶稠李聚为一支，系统发育分析再次证实了待鉴定样品不是斑叶稠李。
[0065]
将待鉴定样品与滨州樱桃进行详细比对，结果见图7，发现两者序列完成一致，均为157973bp，序列相似指数为100％，证实待检测样品是滨州樱桃。
[0066]
本实施例提供的分子鉴定方法在应用到樱花物种鉴定时，检测结果准确，特异性好；具有操作简单、检测效率高、检测精准、重复性好的特点。
[0067]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。