一种小分子RNA的高通量测序文库构建方法

一种小分子rna的高通量测序文库构建方法
技术领域
1.本发明涉及高通量测序文库构建领域，特别涉及一种小分子rna的高通量测序文库构建方法。


背景技术：

2.small rna(小分子rna)包括rsrnas、ysrna、tsrnas、mirnas、sirnas和pirnas等，是一大类调控分子，几乎存在于所有生物体内。small rna可以通过mrna降解、翻译抑制、异染色质形成以及dna去除来调控生物体的生长发育、代谢和疾病发生等生理学过程。通过对small rna进行高通量的测序分析，可以获得物种全基因组水平的small rna图谱，实现样品间差异small rna的鉴定、rna聚类等科学应用。此外，最近研究发现血浆中存在丰富的small rna，并且在肿瘤、高血压和糖尿病等多种疾病中呈特异性表达，提示血浆中的small rna可以作为潜在的生物标记物用于疾病的诊断和治疗。通过对small rna大规模测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的small rna图谱，实现对不同疾病患者血浆中特异的small rna标志物鉴定。
3.目前针对small rna进行测序的方法已有多款成熟的试剂盒，如nebnext multiplex small rna library prep set。但这些试剂盒针对的材料主要为组织rna或细胞rna，并且只能对5’端为磷酸化修饰的rna进行文库构建与测序分析。目前，针对5’端为非磷酸化修饰的rna，并没有成熟的试剂盒，此外对于血浆中的微量rna，亦没有成熟的试剂盒可以用于small rna图谱的绘制。
4.因此，现有技术还有待于改进和发展。


技术实现要素：

5.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种小分子rna的高通量测序文库构建方法，旨在解决现有技术无法对微量5’端为非磷酸化修饰的小分子rna进行测序的问题。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种小分子rna的高通量测序文库构建方法，其中，包括步骤：
8.提取待测样品中的rna，备用；
9.使用polya加尾酶和mmlv逆转录酶，结合带有polyt的逆转录引物对所述rna进行加尾和逆转录，得到反应体系产物，所述反应体系产物包括合成的cdna第一链；
10.利用外切酶i清除反应体系产物中剩余的逆转录引物；
11.对所述cdna第一链进行变性后与末端突出的双链dna接头进行连接，得到连接产物；
12.对所述连接产物用user酶处理，得到处理后cdna；
13.对处理后cdna进行pcr扩增，得到高通量测序文库。
14.所述小分子rna的高通量测序文库构建方法，其中，使用polya加尾酶和mmlv逆转
录酶，结合带有polyt的逆转录引物对所述rna进行加尾和逆转录，得到反应体系产物的步骤包括：
15.将polya加尾酶、mmlv逆转录酶、带有polyt的逆转录引物以及逆转录缓冲液混合在一起，得到逆转录混合物；
16.在70℃条件下处理所述rna 2min使所述rna的二级结构打开，当温度降低至25℃时，将所述逆转录混合物和所述rna混合在一起，得到反应体系；
17.在37℃将上述反应体系孵育30min后得到反应体系产物，所述反应体系产物包括合成的cdna第一链。
18.所述小分子rna的高通量测序文库构建方法，其中，利用外切酶i清除反应体系产物中剩余的逆转录引物的步骤包括：
19.将外切酶i加入到反应体系产物中，在37℃保温30min，接着以80℃保温20min，清除反应体系产物中的逆转录引物。
20.所述小分子rna的高通量测序文库构建方法，其中，对所述cdna第一链进行变性后与末端突出的双链dna接头进行连接，得到连接产物的步骤包括：
21.对所述cdna第一链进行95℃，5min孵育使其变性，得到变性cdna第一链；
22.使用末端突出的双链dna接头与变性cdna第一链在20℃保温1h，接着在65℃保温10min的条件下进行连接，得到连接产物。
23.所述小分子rna的高通量测序文库构建方法，其中，对所述连接产物用user酶处理，得到处理后cdna的步骤包括：
24.利用user酶对所述连接产物进行37℃15min处理，得到处理后cdna。
25.有益效果：本发明在rna3’端同时使用polya加尾酶和mmlv逆转录酶的试验方案进行文库构建，这一技术手段的使用不需要进行rna 3’端的连接反应，因而极大的增强了检测的敏感性，实现了对血浆中极其微量的small rna的文库构建；此外，本发明不依赖于rna5’端为磷酸化修饰，因而可以对更多不同类型的rna进行文库构建。
附图说明
26.图1为本发明一种小分子rna的高通量测序文库构建方法流程图。
27.图2为小分子rna的高通量测序文库构建的原理图。
28.图3为实施例1中4例肺癌患者血浆中小分子rna的高通量测序文库的琼脂糖凝胶电泳结果图。
具体实施方式
29.本发明提供一种小分子rna的高通量测序文库构建方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
30.请参阅图1，图1为本发明提供的一种小分子rna的高通量测序文库构建方法流程图，如图所示，其包括步骤：
31.s10、提取待测样品中的rna，备用；
32.s20、使用polya加尾酶和mmlv逆转录酶，结合带有polyt的逆转录引物对所述rna
进行加尾和逆转录，得到反应体系产物，所述反应体系产物包括合成的cdna第一链；
33.s30、利用外切酶i清除反应体系产物中剩余的逆转录引物；
34.s40、对所述cdna第一链进行变性后与末端突出的双链dna接头进行连接，得到连接产物；
35.s50、对所述连接产物用user酶处理，得到处理后cdna；
36.s60、对处理后cdna进行pcr扩增，得到高通量测序文库。
37.在本发明中，不同的待测样品可使用不同的试剂盒来提取rna，作为举例，若待测样品为组织或细胞时，则可采用rnaiso plus试剂盒来提取样品rna；若待测样品为血浆时，则可采用apostle minimax high efficiency cfrna isolation试剂盒来提取样品rna，提取的rna最终溶解于无rna酶的水中，备用。
38.如图2所示，本发明是在rna3’端同时使用polya加尾酶和mmlv逆转录酶的试验方案进行文库构建，这一技术手段的使用可大大降低rna投入量，能够实现对血浆中微量rna的文库构建，这一技术手段还未有过报道。本发明极大的增强了检测的敏感性，实现了对血浆中极其微量的small rna的文库构建；本发明不依赖于rna5’端为磷酸化修饰，因而可以对更多不同类型的rna进行文库构建。
39.在一些实施方式，使用polya加尾酶和mmlv逆转录酶，结合带有polyt的逆转录引物对所述rna进行加尾和逆转录，得到反应体系产物的步骤包括：将polya加尾酶、mmlv逆转录酶、结合带有polyt的逆转录引物以及逆转录缓冲液混合在一起，得到逆转录混合物；在70℃条件下处理所述rna2min使所述rna的二级结构打开，当温度降低至25℃时，将所述逆转录混合物和所述rna混合在一起，得到反应体系；在37℃将上述反应体系孵育30min后得到反应体系产物，所述反应体系产物包括合成的cdna第一链。在本实施例操作过程中，对不同的样本采用不同的逆转录引物，逆转录引物上额外的加入8个标识碱基，用于不同样本在测序时能够区分开来。
40.在一些实施方式中，利用外切酶i清除反应体系产物中剩余的逆转录引物的步骤包括：将外切酶i加入到反应体系产物中，在37℃保温30min，接着以80℃保温20min，清除反应体系产物中的逆转录引物。如图2所示，本实施例通过采用外切酶i对反应体系产物进行处理，从而可以去除掉未发生逆转录反应的引物，使得测序数据中引物自连的比列降低到了25％以下(常规比例在60％-70％)。
41.在一些实施方式中，对所述cdna第一链进行变性后与末端突出的双链dna接头进行连接，得到连接产物的步骤包括：对所述cdna第一链进行95℃，5min孵育使其变性，得到变性cdna第一链；使用末端突出的双链dna接头与变性cdna第一链在20℃保温1h，接着在65℃保温10min的条件下进行连接，得到连接产物。
42.具体来讲，传统方法仅能对5’端为磷酸化修饰的rna进行文库构建和测序，而本实施例如图2所示，对所述cdna第一链进行变性后，通过t4dna连接酶将变性cdna第一链与末端突出的双链dna接头进行连接，通过这一技术手段，完全避免了rna5’端的修饰对文库构建的影响。
43.在一些实施方式中，利用user酶对所述连接产物进行37℃15min处理，得到处理后cdna。在本实施例中，通过采用user酶对所述连接产物进行处理，可以降低pcr过程所需要的循环数，减少文库中的冗余。
44.下面通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明：
45.实施例1
46.根据以上small rna文库构建方法，本例具体对4例肺癌患者200μl血浆中的小分子rna进行了高通量测序文库构建。先利用apostle公司的minimax tm high efficiency cfrna isolation kit对血浆中的小分子rna进行提取，最终体积均为10μl。
47.文库构建的逆转录引物为seq id no.1所示序列，其中，“nnnnnnnn”表示8bp的样本标识碱基，即多个样品混合测序时用于区分不同样品的序列。本例针对4例肺癌患者的小分子rna用到了4条逆转录引物，序列为seq id no.2至seq id no.5，其中v表示a，c，g；n表示a，t，c，g。
48.seq id no.1:
49.tacgagatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctnnnnnnnnttttttttttttttttttvn
50.seq id no.2:
51.tacgagatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcctctctgttttttttttttttttttvn
52.seq id no.3:
53.tacgagatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcagcctcgttttttttttttttttttvn
54.seq id no.4:
55.tacgagatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttgcctcttttttttttttttttttttvn
56.seq id no.5:
57.tacgagatgtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatcttcctctacttttttttttttttttttvn
58.4例肺癌患者血浆中小分子rna逆转录后所得cdna连接相同的双链dna接头，其由序列为seq id no.6和seq id no.7的两条dna分子退火形成。
59.seq id no.6:
60.cacctctctauacacucttucccuacacgacgctctuccgatcunnnnnn
61.seq id no.7:
62.agatcggaagagcgtcgtgtagggaaagagtgtatagagaggtg
63.4例肺癌患者血浆中小分子rna逆转录产物cdna连接接头后，采用相同的pcr引物进行扩增，即seq id no.8和seq id no.9所示。
64.seq id no.8:
65.aatgatacggcgaccaccgagatctacacctctctatacactctt
66.seq id no.9:
67.caagcagaagacggcatacgagatgtgactggagtt
68.本例中4例肺癌患者血浆中小分子rna高通量测序文库构建的具体反应体系和条件如下：
69.1、小分子rna加polya尾与逆转录
70.首先将血浆中提取的6.75μl无核酸酶的小分子rna与0.05μm的逆转录引物1μl混合，制备成混合样品后置于70℃孵育2min后立即放置于冰上，备用。
71.然后配制总体积为2.25μl的反应液，包括4
×
polya加尾缓冲液0.625μl，4
×
逆转录缓冲液0.625μl，polya加尾酶0.5μl，逆转录酶0.5μl。
72.将2.25μl的反应液与放置于冰上的混合样品混匀后置于37℃孵育30min，即完成了小分子rna加polya尾与逆转录，得到了cdna。
73.2、去除残留逆转录引物
74.在上述逆转录产物中加入核酸外切酶i1ul后混匀置于37℃孵育30min，80℃孵育20min，95℃孵育5min后迅速置于冰上备用，即完成了cdna中残留逆转录引物的去除。
75.3、接头的制备
76.首先分别将5μl制备接头所用的100μm的两条dna分子混合后置于冰上，向混合物中加入5μl的10
×
nebbuffer2.1并混匀，加入35μl无核酸酶的水后混匀并放置于冰上备用，总反应体系为50μl。
77.然后混合液置于thermal cycler中，并运行下述程序：95℃5min，然后进入70个循环：每个循环温度降低1℃并孵育1min，最终于25℃孵育1min后停止，将混合液置于冰上备用，即得到了接头。
78.4、逆转录产物连接接头
79.首先配制总体积为9μl的反应液：10
×
t4 dna ligase buffer 1μl、10mm atp 2μl、50％peg4000 2μl、接头1μl、t4 dna ligase 1μl、无核酸酶水2μl，混匀后置于冰上备用。
80.然后将配好的反应液加入到步骤2中的cdna中，混匀后置于20℃孵育60min，65℃孵育15min即完成了接头的连接，将产物置于冰上备用。
81.5、user酶消化接头
82.将1ul user酶加入到步骤4的产物中，混匀后置于37℃孵育15min即完成了对接头的消化，将产物置于冰上备用。
83.6、pcr扩增制备文库
84.首先取新的pcr管，配制总体积为35μl的反应液：2
×
kapa hifi ready mix 25μl、10μm的扩增引物分别1μl，无核酸酶的水8μl，混合后置于冰上备用。
85.吸取15μl步骤5中的产物并加入至上述pcr反应液中，混合后在thermal cycler上进行如下反应：95℃孵育1min，然后进入16个循环：98℃20s、60℃30s、72℃30s，循环结束后，72℃孵育1min，15℃保持，即得到了扩增产物。
86.7、利用xp beads纯化回收pcr产物
87.首先向pcr产物中加入90μl xp bead后混匀，室温放置15min，期间振荡混匀1次。
88.然后置于磁力架上3-5min后丢弃上清，用200μl 80％乙醇清洗两次，清洗时将pcr管前后方向反转5次，使beads在乙醇中得到充分洗涤。
89.打开pcr管盖，将其置于室温下晾干剩余乙醇。加入30μl蒸馏水后振荡混匀，使beads悬浮于溶液中，室温放置15min，期间再振荡混匀1次。
90.置于磁力架上3-5min后将上清转移至新的ep管中，即为本例中得到的4例肺癌患者血浆中小分子rna的高通量测序文库。
91.采用3％的琼脂糖凝胶电泳对文库进行质检，所得结果如图3所示。采用本发明所
述方法得到了平均长度约为180bp的文库，与预期结果一致。
92.采用qubit
tm dsdna assay kit对文库进行浓度测定后，分别取30ng文库混匀后在illumina测序平台进行测序。
93.对本例的小分子rna文库测序进行分析，具体如下：
94.1、对于4个不同样本数据的拆分
95.根据4个不同肺癌样本血浆小分子rna在逆转录过程中携带的样本标签不同，对测序原始数据中r2 reads的前8个碱基进行判断可得每条reads对应的样本。本例中对原始测序数据进行拆分后，所得每个样本的测序数据量均大于25m reads。
96.2、小分子rna文库测序结果分析
97.通过数据拆分得到4例肺癌样本的测序结果后，首先去除接头序列，然后通过判断插入片段的大小判断接头自连比例。本例中以15bp为筛选条件，即插入片段小于15bp为接头自连产物，插入片段大于15bp为小分子rna逆转录产物。如表1所示，数据经过分析发现4例肺癌样本文库中接头自连比列分别为：22.9％、25.2％、22.4％和24.5％。
98.表1 4例肺癌样品测序数据分析表
[0099][0100]
该结果表明本发明在对微量小分子rna进行文库构建过程中仅产生少量的接头自连。如表1所示，对去除掉接头自连后的序列进行比对分析发现了5种不同来源的小分子rna，包括rsrna、ysrna、tsrna、mirna、pirna。该结果表明利用本发明可以得到肺癌患者血浆中丰富的5’端不含磷酸化修饰的小分子rna信息，可以为癌症的早期诊断及预后标志物的筛选奠定基础。
[0101]
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。