一种人硫氧还原蛋白的制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及基因技术领域，具体涉及一种人硫氧还原蛋白的制备方法及其应用。


背景技术：

2.溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)是一种易复发的自身免疫性疾病，属于炎症性肠病(inflammatory bowel disease，ibd)的一种。溃疡性结肠炎通常会影响病人结肠和直肠的最内层粘膜，症状表现为持续的炎症和溃疡。在世界范围内，主要是在发展中国家包括中国，uc的发病率和发生率仍在增加。uc的致病机制尚不明确，遗传、免疫和环境因素，如饮食、压力、吸烟、肠道菌群和自由基等，都参与了其发展。对于uc的治疗，除了传统的皮质类固醇、免疫抑制剂等外，各种生物制剂逐渐成为热点例如tnf-α阻断剂、jak抑制剂、il-12/il-23p40单克隆抗体和细胞粘附分子抑制剂等。然而，这些生物制剂也存在着成本高、质控难度大、不良反应明显等缺点。因此，开发新型、高效、低毒的治疗药物成为需求。
3.硫氧还原蛋白(thioredoxin，trx/txn)又称成人t细胞白血病来源因子(adult t cell leukemia-derived factor，adf)，是控制氧化还原调节系统的最重要的分子之一，在保守的活性位点序列cys32-gly-pro-cys35中含有一个具有氧化还原活性的二硫醚/二硫醇。硫氧还原蛋白具有多种生物学功能，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用。已有文献报道，uc患者结肠粘膜中硫氧还原蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interactingprotein，txnip)的表达水平降低，并且uc炎症部位txn表达水平显著降低，这提示着trx与uc存在密切联系。
4.然而，人硫氧还原蛋白(recombinant human thioredoxin，rhtrx)对溃疡性结肠炎的作用如何，文献鲜有报道。


技术实现要素：

5.针对上述缺陷，本发明提供了一种具有生物活性的重组人硫氧还原蛋白的制备方法及其应用。
6.为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：本发明的一种人硫氧还原蛋白，所述的人硫氧还原蛋白具有如下氨基酸序列：
7.(1)由seq id no.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
8.(2)与序列seq id no.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
9.(3)seq id no.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
10.本发明的一种核酸分子，其编码所述的人硫氧还原蛋白。
11.进一步地，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
12.本发明所述的人硫氧还原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
13.(1)pcr扩增所述蛋白的基因，
14.(2)连接到pcold载体，得到重组质粒pcold tf-rhtrx，
15.(3)将其转化宿主菌e.coli bl21(de3)，获得阳性重组菌bl21(de3)(pcold tf-rhtrx)，
16.(4)在trigger factor标签与rhtrx之间有一个蛋白酶酶切位点,可用蛋白酶切除带有trigger factor标签以及his标签的目的人硫氧还原蛋白。
17.进一步地，在步骤(2)中，重组质粒pcold tf-rhtrx：用限制性内切酶ndei和ecori双酶切pcold tf质粒，将目的基因和酶切质粒同源重组后的产物转入bl21(de3)菌，挑选重组菌落进行pcr鉴定，发现所挑的8个菌落皆为阳性，菌落经sangon公司测序鉴定正确，制得重组质粒pcold tf-rhtrx。
18.进一步地，在步骤(4)中，所述的蛋白酶为常用的蛋白内切酶，所述的蛋白内切酶为hrv3c、tev、凝血酶或肠激酶。
19.本发明所述的人硫氧还原蛋白在制备溃疡性结肠炎药物中的应用。
20.本发明所述的人硫氧还原蛋白在制备溃疡性结肠炎诊断药物中的应用。
21.有益效果：本发明通过基因克隆技术表达有生物活性的重组人trx，在体外鉴定其活性，继而利用葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，dss)诱导小鼠溃疡性结肠炎模型研究重组人硫氧还原蛋白的治疗效果。并利用geo中的数据集gse107499证实uc炎症部位txn基因与枢纽基因的相关性，为重组人硫氧还原蛋白在溃疡性结肠炎治疗中的应用提供依据。
附图说明
22.图1为本发明重组表达质粒pcold tf-rhtrx的构建和鉴定。
23.a:rhtrx基因的pcr产物；b:质粒pcold tf经过ndei和ecori限制性内切酶酶切后的质粒dna；c:重组质粒的pcr筛选。
24.图2为本发明表达和纯化重组rhtrx蛋白。
25.a:sds-page分析iptg(5mmol
·
l-1)诱导的蛋白质表达。1:iptg诱导后的细菌总蛋白；2:iptg诱导前的细菌总蛋白；3:iptg诱导后的细菌裂解上清总蛋白；4:iptg诱导前的细菌裂解上清总蛋白；5:iptg诱导后的细菌裂解沉淀；6:iptg诱导前的细菌裂解沉淀；7:蛋白质分子量标准。
26.b:sds-page分析rhtrx纯化.1:蛋白质分子量标准；2:重组rhtrx蛋白；3:tf-rhtrx融合蛋白。
27.图3为本发明rhtrx蛋白的二硫键还原酶活性分析。n＝3,x
±
s,p《0.0001。
28.图4为本发明rhtrx蛋白在dss诱导的肠炎小鼠模型的治疗作用。a:rhtrx蛋白给药方案；b:每组动物的体重变化；c:每组动物的结肠形态；d:每组动物的结肠长度；e:he染色的结肠组织切片。n＝6，x
±
s，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001.。
29.图5为本发明rhtrx蛋白对dss诱导的肠炎小鼠模型的结肠具有靶向性效果。
30.a:rhtrx-mcherry融合蛋白在dss诱导的肠炎小鼠活体模型中的分布。
31.b:rhtrx-mcherry融合蛋白在dss诱导的肠炎小鼠活体模型结肠，肾脏和脾脏等组织中的分布。
32.图6为本发明的txn基因与炎症性肠病uc炎症部位的枢纽基因的关联性。
33.a:对gse107499数据集中的微阵列数据标准化；b:对数据集gse107499中炎症部位与非炎症部位差异表达基因(dges)的火山图分析。红色、蓝色和灰色的点分别代表上调、下调和无变化的基因。c:gse107499数据集中差异表达最显著的前50位基因的热图分析；d:基于closeness算法和利用string数据库和cytoscape,构建的排名前20位差异表达基因的蛋白质相互作用(ppi)网络；e:基于closeness算法评分的排名前20位差异表达基因；f:炎症性肠病患者炎症部位与非炎症部位的txn基因表达水平；g:炎症部位txn基因和枢纽基因间关联性热图。蓝色代表正相关，红色代表负相关，颜色越深代表关联性越强。x
±
s，*p《0.05，**p《0.01.
具体实施方式
34.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更加全面的描述，附图中给出了本发明的若干实施例，但是本发明可以通过不同的形式来实现，并不限于文本所描述的实施例，相反的，提供这些实施例是为了使对本发明公开的内容更加透彻全面。
35.下面结合附图对发明内容作进一步详细说明。
36.实施例1
37.本发明的一种人硫氧还原蛋白，所述的人硫氧还原蛋白具有如下氨基酸序列：
38.(1)由seq id no.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
39.(2)与序列seq id no.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或
40.(3)seq id no.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。
41.本发明的一种核酸分子，其编码所述的人硫氧还原蛋白。其核苷酸序列如seq id no.2所示。
42.本发明所述的人硫氧还原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
43.(1)pcr扩增权利要求1所述蛋白的基因，
44.(2)连接到pcold载体，获得重组质粒pcold tf-rhtrx：用限制性内切酶ndei和ecori双酶切pcold tf质粒，将目的基因和酶切后的质粒同源重组后的产物转入bl21(de3)菌，挑选重组菌落进行pcr鉴定，发现所挑的8个菌落皆为阳性，菌落经sangon公司测序鉴定正确，获得重组质粒pcold tf-rhtrx。
45.(3)将重组质粒转化宿主菌e.coli bl21(de3)，获得阳性重组菌bl21(de3)(pcold tf-rhtrx)，
46.(4)在trigger factor标签与rhtrx之间有一个蛋白酶酶切位点,可用蛋白酶切除带有trigger factor标签以及his标签的目的人硫氧还原蛋白，所述的蛋白酶为常用的蛋白内切酶，所述的蛋白内切酶为hrv3c。本发明所述的人硫氧还原蛋白在制备溃疡性结肠炎药物中的应用。
47.本发明所述的人硫氧还原蛋白在制备溃疡性结肠炎诊断药物中的应用。
48.实施例2
49.实施例2与实施例1的区别在于：
50.所述的蛋白内切酶为tev。
51.实施例3
52.实施例3与实施例1的区别在于：
53.所述的蛋白内切酶为凝血酶。
54.实施例4
55.实施例4与实施例1的区别在于：
56.所述的蛋白内切酶为肠激酶。
57.试验例1
58.1材料与方法
59.1.1菌株与细胞
60.e.coli bl21(de3)菌株、pcold tf载体质粒、jurkat细胞均由本发明团队冻存。
61.1.2主要试剂
62.胰岛素购自mce公司；葡聚糖硫酸钠购自yeasen公司；ii one step cloning kit购自vazyme公司；inflixmab购自sigma-aldrich公司。
63.1.3重组质粒pcold tf-rhtrx的构建
64.在ncbi中获得人硫氧还原蛋白的序列(nm_003329.4)。设计引物，从jurkat细胞中提取总rna，反转录反应合成cdna，pcr扩增出htrx基因编码区片段。利用ii one step cloning kit试剂将htrx序列连入pcold tf载体，转入coli bl21(de3)细胞。筛选阳性克隆，进行菌落pcr以及测序鉴定。
65.1.4rhtrx的诱导表达和纯化
66.取阳性克隆涂布于lb(amp
+
)平板，接种于lb(amp+)液体培养基中，37℃振荡过夜培养，次日按1:100比例转接于新鲜lb(amp
+
)中，37℃继续培养，至细菌密度达到(a600:0.6～0.8)，加入终浓度为5mmol
·
l-1
的异丙基-β-硫代丙糖苷(iptg)在15℃下诱导20h，获得可溶性表达。通过离心(4000r
·
min-1
，20min，4℃)收取大肠杆菌沉淀，在缓冲液(20mmol
·
l-1
tris，ph 7.8，150mol
·
l-1
nacl)中重悬菌液。使用高压均质匀浆器破碎大肠杆菌，离心后(12000r
·
min-1
，30min，4℃)吸取上清。用ni-nta柱纯化目标蛋白，用80mmol
·
l-1
咪唑洗脱。随后用蛋白酶从纯化的蛋白中去除his标签(4℃，12h)。然后使用ni-nta柱收集不含his标签的rhtrx。用pbs过夜透析后，将纯化的rhtrx浓缩并在-80℃下保存。
67.1.5rhtrx的体外活性检测
68.在1000μl反应混合物中含有50mmol
·
l-1
tris
·
hci(ph 7.5)，1mmol
·
l-1
乙二胺四乙酸(edta)，和0.17mmol
·
l-1
胰岛素，5μmol
·
l-1
的rhtrx。加入二硫苏糖醇(dtt)至终浓度2mmol
·
l-1
启动反应，室温下在650nm处每隔l min测定1次吸光度(a)值，绘制反应曲线。
69.1.6dss结肠炎小鼠模型的诱导和治疗
70.雌性spf级c57bl/6小鼠(17-19g，6-8周龄，合格证编号：no.202116011)来自南京大学模型动物研究中心。小鼠被饲养在25
±
2℃的恒温条件下，保持12小时的光-暗循环，自由饮用食物和水。动物实验是按照南京大学动物护理和使用委员会的适当的伦理指导方针进行的。
71.将36只小鼠随机分为6组：对照组、dss组、rhtrx(10μg
·
kg-1
)组、rhtrx(100μg
·
kg-1
)组、rhtrx(1mg
·
kg-1
)组和inflixmab(10mg
·
kg-1
)组。除了对照组外，其余组小鼠自由
饮用含3％葡聚糖硫酸钠dss(w/v)的无菌饮用水，诱导实验性结肠炎。从造模第2天开始腹腔注射不同浓度的rhtrx和inflixmab，直到它们被处死。每天检测小鼠体重和粪便出血等情况。
72.1.7结肠he染色
73.取小鼠结肠组织，在4％多聚甲醛中固定24h。用梯度浓度的酒精脱去结肠中的水分，再将其浸入二甲苯中。将组织块浸入石蜡块中包埋，冷却。将蜡块固定在切片机上，切成薄片，用热水烫平后贴在载玻片上，烘干。用苏木精溶液染色数分钟，再用酸水或氨水分色数秒，再用流水冲洗1h，用蒸馏水洗片刻，分别在70％和90％的酒精中脱水10min，最后用酒精伊红染色液染色3分钟。用树胶滴在切片上封片，显微镜观察。
74.1.8rhtrx对结肠的靶向性
75.取造模五天的dss小鼠，尾静脉注射htrx-mcherry(1mg
·
kg-1
)，1h后用10％水合氯醛(3ml
·
kg-1
)腹腔注射麻醉小鼠，然后将小鼠放入成像暗箱平台，软件控制平台的升降到一个合适的视野，自动开启照明灯(明场)拍摄第一次背景图。下一步，自动关闭照明灯，选择合适的激发和发射滤片，在没有外界光源的条件下(暗场)拍摄由小鼠体内发出的特异光子。明场与暗场的背景图叠加后可以直观的显示动物体内特异光子的部位和强度，完成成像操作。
76.1.9geo数据库中炎症性肠病(uc)炎症部位的枢纽基因与txn的相关性分析
77.在geo数据库中下载数据集gse107499，下载数据格式为miniml(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝gse107499)，该数据采用的芯片平台是gpl15207。gse107499数据集包含119个样本，其中有75个uc患者炎症部位结肠组织样本和44个uc患者非炎症部位结肠组织样本。首先使用r软件的limma软件包对数据进行整理、规范化、数据合并及注释转换。通过limma分别筛选差异表达基因(degs)，筛选条件为:表达变化倍数大于2(|log2(flod change)|》1)。
78.string数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)用于预测蛋白质及研究蛋白质间的相互作用关系。将degs导入string数据库，构建蛋白质相互作用(protein protein interaction，ppi)网络图，筛选条件为combine score≥0.4。并利用cytoscape(3.9.0)软件中的插件cytohubba基于closeness算法筛选出排名前20的枢纽基因。利用wilcoxon秩和检验对样本中txn的表达进行分析，箱线图通过r软件包ggplot2进行绘制。对txn和筛选出的枢纽基因做spearman相关性分析，相关性图通过r软件包pheatmap进行绘制。
79.1.10统计学分析
80.所有实验数据均采用graphpad prism 8.0分析处理，计量数据以平均值
±
标准误[mean
±
sem(standard error of mean)]表示，两组数据比较采用student's t test，p《0.05为显著差异，p《0.01为极显著差异。
[0081]
2结果与分析
[0082]
试验例2
[0083]
重组质粒pcold tf-rhtrx的鉴定
[0084]
首先构建重组质粒pcold tf-rhtrx，用1％琼脂糖电泳检测rhtrx基因的pcr产物，在约315bp处可见特异性条带(图1a)，与序列的实际大小一致。用限制性内切酶ndei和
ecori双酶切pcold tf质粒(图1b)。将目的基因和酶切质粒同源重组后的产物转入bl21(de3)菌，挑选重组菌落进行pcr鉴定，发现所挑的8个菌落皆为阳性(图1c)，菌落经sangon公司测序鉴定正确，说明重组质粒pcold tf-rhtrx构建成功。
[0085]
试验例3
[0086]
rhtrx的诱导表达和纯化结果
[0087]
在诱导前后和纯化过程中取样，用12％sds-page凝胶电泳检测蛋白的表达，trx含105个氨基酸，相对分子质量(mr)为12000。pcold tf载体是一种融合表达可溶性的标签“触发因子(trigger factor，tf)伴侣”的冷休克载体。“触发因子”是原核核糖体相关的分子伴侣蛋白，有利于新表达的多肽的共翻译折叠，分子量为52000。如图2a所示，经过iptg诱导后，所表达的rhtrx含有trigger factor标签，加上his标签等，总共大小为66000左右。
[0088]
在trigger factor标签与rhtrx之间有一个蛋白酶(例如，hrv 3c)酶切位点，可用蛋白酶(例如，hrv 3c)酶切除trigger factor标签以及his标签。如图2b所示，切割下的rhtrx大约为12000，其余部分为52000左右，显示出融合蛋白切割完全，获得了完整的rhtrx蛋白。
[0089]
试验例4
[0090]
rhtrx的体外活性检测
[0091]
对于纯化后的rhtrx，可以使用胰岛素还原法检测其活性。在dtt的作用下，rhtrx被还原成还原型的rhtrx，具有二硫键还原酶的活性。可以使得胰岛素ab链间二硫键打开，变成游离的ab链，b链在650nm处有强烈吸光度。如图3所示，同pbs组相比，rhtrx组650nm处的吸光度在十几分钟时明显升高，并在40分钟左右达到平台期。表明纯化的rhtrx具有二硫键还原酶的活性。这充分说明本发明表达的rhtrx具有生物活性，避免了大肠杆菌表达系统容易出现的包涵体产物的难题。
[0092]
通过简便易行的方式获得具有生物活性的重组rhtrx至关重要。本发明利用基因工程技术构建重组质粒，在大肠杆菌中表达和纯化人源的trx。而对于载体的选择，一开始我们选择了pet系列载体，然而却发现pet系列载体不能正常诱导rhtrx的表达。在多次尝试之后选择了pcold tf载体，该载体所具有的trigger factor(tf)是一种原核的核糖体结合伴侣蛋白质，能够促进新生肽链的翻译折叠；本发明同时利用his-tag能够方便和简易地帮助重组蛋白的纯化，并且可以利用蛋白酶(例如，hrv3c酶)将融合蛋白剪切，从而表达和纯化获得具有生物活性的完整的rhtrx重组蛋白。对于纯化后的rhtrx的活性检测，利用了其还原状态下具有二硫键还原酶的特性，采用胰岛素还原法检测了其活性。
[0093]
试验例5
[0094]
rhtrx对dss小鼠结肠炎的治疗效果
[0095]
使c57bl/6雌性小鼠自由饮用3％dss水诱导结肠炎。设置了3个剂量的rhtrx(10μg
·
kg-1
、100μg
·
kg-1
和1mg
·
kg-1
)，以英夫利昔单抗(inflixmab)作为阳性对照。在造模的第2天和第5天给药，以寻找有效的剂量(图4a)。rhtrx组100μg
·
kg-1
(17.25g
±
0.2377g，p＝0.0005)和1mg
·
kg-1
(16.77g
±
0.3461g，p＝0.0212)小鼠的体重显著高于dss组(15.68g
±
0.1939g)，并且rhtrx(100μg
·
kg-1)组更显著，与inflixmab(10mg
·
kg-1)组在维持小鼠体重上的效果没有显著差异(图4b)。
[0096]
解剖后取小鼠结肠观察，与dss组(5.183cm
±
0.1662cm)相比，rhtrx组在100μg
·
kg-1
(6.600cm
±
0.07746cm，p《0.0001)和1mg
·
kg-1
(5.85cm
±
0.09220cm，p＝0.0056)时的结肠形态更为完整(图4c)，长度也显著更长，并且rhtrx(100μg
·
kg-1
)组同样与inflixmab(10mg
·
kg-1
)在维持结肠长度和形态上有近似的效果(图4d)。
[0097]
通过对小鼠的结肠he染色切片分析，观察到经过dss造模后的小鼠，肠壁增厚，腺管排列不齐，有明显的隐窝受损和组织坏死的情况，并伴随着大量炎性细胞的浸润。而在经过rhtrx与inflixmab治疗后有明显改善。其中rhtrx(100μg
·
kg-1)治疗后肠壁趋于正常厚度，腺管排列整齐，炎性细胞浸润的情况有显著改善与正常对照组最为接近(图4e)。上述结论表明rhtrx在100μg
·
kg-1时对dss小鼠有良好的治疗效果。
[0098]
本发明利用dss诱导的结肠炎小鼠模型研究了纯化的rhtrx的治疗效果，并且设置了不同的剂量摸索其最佳的给药浓度。葡聚糖硫酸钠是化学诱导uc最佳的药物，给予dss的小鼠表现出体重减轻和粪便松散或腹泻的症状，有时还伴有直肠出血的迹象。在解剖小鼠取结肠观察后，可以发现明显的结肠充血和缩短。而rhtrx治疗组小鼠从体重变化、结肠长度和完整性以及结肠he染色切片的评估上优于dss组，其中100μg
·
kg-1
具有最佳的治疗效果与inflixmab在10mg
·
kg-1
的剂量下效果相当。
[0099]
试验例6
[0100]
rhtrx对dss小鼠的靶向诊断作用
[0101]
在已经证明了rhtrx对dss小鼠的治疗效果后，为了探究rhtrx对dss小鼠炎症部位的靶向性，在大肠杆菌中表达了带mcherry荧光标签的rhtrx-mcherry人硫氧还原蛋白融合蛋白。取造模五天的dss小鼠，将rhtrx-mcherry(1mg
·
kg-1)尾注射到dss小鼠和对照组体内，1小时后麻醉小鼠，用活体成像装置观察融合蛋白中的mcherry的荧光，并取小鼠结肠、肾脏和脾脏观察。结果显示，rhtrx-mcherry在结肠近端积累(图5a)，而在肾脏和脾脏中无明显蓄积(图5b)。这些结果证实了rhtrx-mcherry对dss小鼠结肠炎症部位具有靶向定位的作用，从而验证了rhtrx具有对炎症性肠病动物模型的结肠炎症部位具有靶向定位的诊断作用，同时为溃疡性结肠炎的治疗提出了一个新的靶点。
[0102]
试验例7
[0103]
geo数据库中uc炎症部位的枢纽基因与txn的相关性分析
[0104]
在之前的研究中我们已经可以证明：
①
rhtrx对dss小鼠有良好的治疗效果；
②
rhtrx对dss小鼠结肠炎症部位具有靶向定位的作用，然而rhtrx对人溃疡性结肠炎的作用仍是未知。为了研究txn基因与在uc患者中的表达水平变化和与枢纽基因相关性，在geo数据库中选取了数据集gse107499，包含着75个uc炎症部位结肠组织样本，44个uc非炎症部位结肠组织样品。首先，对数据集中的微阵列数据进行了标准化后，在fdr《0.05和|log2(fc)|》1的条件下，共筛选出859个差异表达基因，其中包括545个上调基因，314个下调基因。在|log2(fc)|》3和fdr《0.005的条件下从差异基因中筛选出26个显著差异表达的基因(图6b)。利用string数据库和cytoscape，构建了一个ppi网络。基于closeness算法，使用cytohubba插件识别排名前20位枢纽基因(图6d)，包括tnf、il-6、il-1β、ptprc(cd45)、fn1、cd44、cxcl8(il-8)、tlr2、mmp9、ccl2、cd86、icam1、cxcr4、ifng、ccl4、ctla4、fcgr3a、sell、cd40和vcam1，并且均为表达上调基因(图6e)。
[0105]
这些基因也在文献中被报道与uc的发生发展密切相关。tnf-α、il-6、il-1β、il-8等是由活化的单核-巨噬细胞和淋巴细胞所分泌的促炎细胞因子，参与了肠粘膜炎症反应
的起始和发展过程，血清中的il-6和il-8反应了uc患者的疾病活动性。粘附因子cd44、icam1、vcam1通过介导细胞间的粘附、细胞与基质间的粘附和促进淋巴细胞归巢等作用参与uc的发病过程，vcam-1与icam1介导白细胞募集到发炎的结肠。mmp9与fn1参与uc中的粘膜损伤和修复，粪便中的mmp9可以作为一种鉴别诊断uc的标志物[14]。cd40/cd40l相互作用激活与炎症相关的免疫细胞和非免疫细胞中的各种途径，并被证明对ibd的发展至关重要，肠炎症黏膜中cd40
+
和cd40l
+
细胞数量显著增加，分别为b细胞/巨噬细胞和cd4
+
t细胞，肠固有层t细胞诱导单核细胞产生促炎细胞因子的过程依赖于cd40l。
[0106]
在数据集中，相对于非炎症部位，炎症部位中txn有着显著的下调(图6f)。对炎症部位样本中的txn基因与筛选出的20个枢纽基因做spearman相关性分析，发现txn的表达与cd40的表达呈现出显著的负相关，与fn1的表达呈现出显著的正相关(图6g)。
[0107]
在验证了rhtrx在dss小鼠模型上的疗效和结肠靶向性后，为了研究txn基因在uc患者中的表达水平和与枢纽基因的相关性，在geo数据库中，选择了数据集gse107499，筛选出20个枢纽基因，发现txn在uc患者炎症部位有显著下调，并且txn的表达与fn1的表达呈现出极显著的负相关，与cd40的表达呈现极显著的正相关。
[0108]
纤连蛋白1(fn1)本身是促进伤口损伤修复的重要蛋白，在活动性uc患者中纤连蛋白有着显著的高表达，而txn的相互作用蛋白txnip则参与了介导着纤连蛋白的分泌，这可能是txn与fn1在表达上呈正相关的原因。cd40是一种与t细胞和b细胞功能有关的表面抗原，是肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)的成员。cd40通过与其同源配体cd40l的连接产生细胞内信号并产生表面和分泌分子，影响体液和细胞免疫，并最终影响炎症。在uc中cd40/cd40l系统被激活，cd40的过表达与疾病活动成正比，结肠组织中cd40l
+
单核细胞显著增加，肠上皮细胞中的促炎功能依赖于cd40的分泌和调节。由于cd40/c040l系统的激活在免疫反应的启动和放大的重要性，针对cd40/cd40l通路的一些抗体已经在克罗恩病、系统性红斑狼疮和原发免疫性血小板减少症等自身免疫性疾病上进行临床试验并展现出初步的疗效。
[0109]
氧化应激是uc的一个发病特征，cd40/cd40l也与氧化应激密切相关。而重组trx蛋白具有氧化还原的能力。这提示着在uc患者炎症部位，txn与cd40在表达上的负相关性可能与氧化应激相关，为重组人硫氧还原蛋白在人类溃疡性结肠炎中的应用提供了理论依据。
[0110]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。