用于野菊和神农香菊种质资源鉴定的SSR分子标记引物组合

用于野菊和神农香菊种质资源鉴定的ssr分子标记引物组合
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一组用于野菊和神农香菊种质资源鉴定的ssr分子标记引物组合及其应用。
技术背景
2.野菊(chrysanthemum indicum l.)为菊科(asteraceae)菊属(chrysanthemum)多年生草本植物，神农香菊(c.indicum var.aromaticum)为野菊的变种。野菊具有清热解毒、疏风散热等功效，神农香菊因全株散发浓郁的香气而得名，两者广泛用于药品、食品、日用品等行业。目前野菊广泛分布于中国大部分地区，生境条件迥异，造成遗传背景复杂；神农香菊只存在于神农架高海拔区域，尚未有人展开群体遗传研究。复杂不明确的遗传背景阻碍了神农香菊和野菊种质资源的开发利用。
3.分子标记能在dna水平上反应植物遗传基础的差异，在植物遗传育种中广泛应用。简单重复序列(simple sequence repeats,ssr)广泛分布于真核生物基因组的不同位置，由于ssr位点的重复基元种类和重复次数不同，使其呈现出高度的多态性。与其他分子标记相比，ssr具有多态信息含量高、共显性、技术简单、重复性好、特异性强等优点，被认为是可靠性较强的分子标记之一。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为了克服现有技术不足，提供一组用于野菊和神农香菊种质资源鉴定的ssr分子标记引物组合。
5.为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案予以实现的。
6.一组用于野菊和神农香菊种质资源鉴定的ssr分子标记，由21对ssr组成，引物编号分别为ssr01、ssr02、ssr03、ssr04、ssr05、ssr06、ssr07、ssr08、ssr09、ssr10、ssr11、ssr12、ssr13、ssr14、ssr15、ssr16、ssr17、ssr18、ssr19、ssr20、ssr21，用于扩增这21对分子标记的引物序列如下所示：
7.(1)扩增ssr分子标记的ssr01引物：
8.seq id no:1：ssr01-f：5'-gcaccagtcaccttcttggt-3'
9.seq id no:2：ssr01-r：5'-ggtgggagtgggaggtattt-3'
10.(2)扩增ssr分子标记的ssr02引物：
11.seq id no:3：ssr02-f：5'-acaacgggctcttcaatacg-3'
12.seq id no:4：ssr02-r：5'-cccaagacctagccaaaaga-3'
13.(3)扩增ssr分子标记的ssr03引物：
14.seq id no:5：ssr03-f：5'-ttggtcaaactgggcaaaat-3'
15.seq id no:6：ssr03-r：5'-ggggtcgatggtatttggta-3'
16.(4)扩增ssr分子标记的ssr04引物：
17.seq id no:7：ssr04-f：5'-tatcatccgccaattcatca-3'
18.seq id no:8：ssr04-r：5'-atgtagcgccagaagacgtt-3'
19.(5)扩增ssr分子标记的ssr05引物：
20.seq id no:9：ssr05-f：5'-ttgatcgtgcagaagtggag-3'
21.seq id no:10：ssr05-r：5'-cctaagcgcatgttccctac-3'
22.(6)扩增ssr分子标记的ssr06引物：
23.seq id no:11：ssr06-f：5'-cccgtttgtgctaatggagt-3'
24.seq id no:12：ssr06-r：5'-aagagcaaaccgagaagtgc-3'
25.(7)扩增ssr分子标记的ssr07引物：
26.seq id no:13：ssr07-f：5'-acccacggtcaaatcacaat-3'
27.seq id no:14：ssr07-r：5'-ctcacttgtgggagccaaac-3'
28.(8)扩增ssr分子标记的ssr08引物：
29.seq id no:15：ssr08-f：5'-caaaacctttcaccccaatc-3'
30.seq id no:16：ssr08-r：5'-atcatgtggtggtcatgtgg-3'
31.(9)扩增ssr分子标记的ssr09引物：
32.seq id no:17：ssr09-f：5'-acctcaccctccctcattct-3'
33.seq id no:18：ssr09-r：5'-agccatacgtggctttacca-3'
34.(10)扩增ssr分子标记的ssr10引物：
35.seq id no:19：ssr10-f：5'-tttgtgcaggagggaagttt-3'
36.seq id no:20：ssr10-r：5'-caaccattatttggtcggcta-3'
37.(11)扩增ssr分子标记的ssr11引物：
38.seq id no:21：ssr11-f：5'-aaagatgcagcaaccacctc-3'
39.seq id no:22：ssr11-r：5'-tcttttgtaggacggcttgg-3'
40.(12)扩增ssr分子标记的ssr12引物：
41.seq id no:23：ssr12-f：5'-cccgtgtgacataattctatctagc-3'
42.seq id no:24：ssr12-r：5'-ctgcatctggatctggatttc-3'
43.(13)扩增ssr分子标记的ssr13引物：
44.seq id no:25：ssr13-f：5'-cttttcctcaccacccaaaa-3'
45.seq id no:26：ssr13-r：5'-aacaatccacctggcagaac-3'
46.(14)扩增ssr分子标记的ssr14引物：
47.seq id no:27：ssr14-f：5'-tcaaacaccacccaacaaaa-3'
48.seq id no:28：ssr14-r：5'-atattcggcaacaagcaacc-3'
49.(15)扩增ssr分子标记的ssr15引物：
50.seq id no:29：ssr15-f：5'-ggattcgttggagagacgag-3'
51.seq id no:30：ssr15-r：5'-ttgttgcggttgtgattgtt-3'
52.(16)扩增ssr分子标记的ssr16引物：
53.seq id no:31：ssr16-f：5'-attctcggcatttgttttgg-3'
54.seq id no:32：ssr16-r：5'-gaacccctatgtcccatcct-3'
55.(17)扩增ssr分子标记的ssr17引物：
56.seq id no:33：ssr17-f：5'-ttcccatcattttcccaaac-3'
57.seq id no:34：ssr17-r：5'-taacagcagcaggagcagaa-3'
58.(18)扩增ssr分子标记的ssr18引物：
59.seq id no:35：ssr18-f：5'-cccggtttgaaatctaggaa-3'
60.seq id no:36：ssr18-r：5'-tcccaaatggtttcgacaat-3'
61.(19)扩增ssr分子标记的ssr19引物：
62.seq id no:37：ssr19-f：5'-tcgaaccgtttcactcttcc-3'
63.seq id no:38：ssr19-r：5'-aacaatccaagcctgaccac-3'
64.(20)扩增ssr分子标记的ssr20引物：
65.seq id no:39：ssr20-f：5'-ttccttcatcctggacaacc-3'
66.seq id no:40：ssr20-r：5'-accaccagaaccagaaccag-3'
67.(21)扩增ssr分子标记的ssr21引物：
68.seq id no:41：ssr21-f：5'-accatccgcaggtttacaag-3'
69.seq id no:42：ssr21-r：5'-cccacgatgtcgttctcttt-3'
70.又一方面，本发明提供了上述ssr分子标记引物组合在野菊和神农香菊筛选或种质资源鉴定中的应用。
71.又一方面，本发明提供了一种野菊和神农香菊筛选或种质资源鉴定的方法，所述的方法包括以下步骤：
72.首先，基于神农香菊的近缘物种菊花脑的基因组信息和神农香菊的转录组数据(http://www.amwayabrc.com/)，利用misa软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)分别进行核基因组和转录组的ssr位点筛选，搜索标准参数设置为单，二，三，四，五和六核苷酸至少重复10、6、5、5、5和5次，得到的ssr位点及侧翼保守序列批量导入primer3软件(https://sourceforge.net/projects/primer3)进行引物设计。引物设计的设置参数为：(1)引物长度为18～27bp；(2)pcr产物大小为100～500bp；(3)gc含量40～60％；(4)退火温度55～65℃。合成的荧光引物即在正引物的5’端加入m13(gtaaaacgacggccagt)作为接头序列，接头序列由不同荧光基团(fam/hex/rox/tamra)修饰。
73.该方法的具体步骤如下：
74.(1)待测植株总dna提取；
75.(2)以步骤(1)提取的总dna作为模板，分别用筛选和设计的ssr分子标记引物组合进行pcr扩增；
76.(3)毛细管电泳检测步骤(2)的pcr扩增产物，收集数据；
77.(4)根据步骤(3)获得的数据进行遗传多样性指标、聚类及多态信息含量pic计算分析。
78.具体地，步骤(2)中所述的pcr扩增体系为：dna模板2ul(50ng/μl)、5μm的正引物0.5ul、5μm的反引物0.5ul、2
×
es taq master mix 5μl，双蒸水1.85μl，fam/hex/rox/tamra 0.15ul，体系的总体积为10μl。
79.pcr扩增的程序为95℃，2min；95℃，30sec；55℃，30sec；72℃，30sec；35个循环；72℃，2min；4℃保存。
80.本发明的优点在于：本研究基于神农香菊的近缘物种菊花脑的基因组信息和神农香菊的转录组数据，筛选多态性好的21对引物，对野菊和神农香菊合计203份材料的dna进
行全面扩增。本发明首次利用ssr标记共同检测野菊和神农香菊种质的遗传多样性，这一组ssr分子标记的多态性良好，遗传多样性水平较高，为野菊和神农香菊的种间杂交后代鉴定、分子标记辅助育种、基因组比较研究、遗传图谱构建、重要性状的qtl定位、核心资源的利用和保存、分子辅助育种等方面奠定基础。
附图说明
81.图1是ssr01的部分扩增毛细管电泳检测峰图，图中从上到下的5个小图分别代表ssr01对hp-cia14、snd-cia58、tmy-cia151、snd-ci90、hs-ci194合计5个样本的检测峰图。
82.图2是居群在k＝3时的样本遗传聚类关系图。
具体实施方式
83.下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做出进一步阐述，所述实施例只用了解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，可从商业途径得到的试剂和材料。除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学用语均具有本领域技术人员通常理解的含义。
84.实施例1
85.试验材料
86.本发明采用湖北省神农架中医药产业研究院收集保存的神农架2个野菊居群共41份种质资源和神农架3个神农香菊居群共151份种质资源，武汉市洪山区11份野菊种质资源，具体信息见下表1。所有实验材料均种植于湖北省神农架中医药产业研究院温室大棚内。
87.表1 203份种质资源基本信息
[0088][0089]
[0090]
试验方法
[0091]
1.总dna提取
[0092]
本研究采用改良ctab法提取神农香菊及野菊的基因组dna，具体操作步骤如下：
[0093]
(1)称取0.03g的干燥叶片，放于2.0ml的ep管中，再加入2颗钢珠，于球磨仪中以60hz的频率打磨2min。操作在洁净的环境中进行，避免称量样品的相互污染。
[0094]
(2)加入预冷的核分溶液800ul于ep管中，盖好盖混匀5min，放入离心机，以12000r/min的转速，离心10min。离心结束后，弃掉上清液，重复以上操作2～3次，直到上清液没有明显的绿色。
[0095]
(3)加入预热65℃的ctab溶液800ul于ep管中，ep管插入漂浮板，放入65℃恒温水浴锅中40min，定时每10min轻轻摇匀一次。水浴结束之后，向ep管中加入750ul的氯仿-异戊醇混合液(体积比24:1)，混匀，以12000r/min的转速，离心5min，离心后取出ep管。
[0096]
(4)用1000ul的移液枪吸取上清液750ul于新的2.0ml ep管中，加入750ul的氯仿-异戊醇混合液(体积比24:1)，混匀，以12000r/min的转速，离心5min，离心后取出ep管。
[0097]
(5)用1000ul的移液枪吸取700ul的上清液于新的1.5ml ep管中，加入-20℃预冷的异丙醇600ml，于-20℃的条件中冰冻30min。取出后常温放置20min，吸取800ul上清液，转移至dna吸附柱(吸附柱放置于收集管)中，以12000r/min的转速，离心1min，离心后取出ep管。
[0098]
(6)丢掉收集管的废液，于吸附柱中加入700ul的70％的乙醇溶液，静置5min，使乙醇充分溶解其杂质，以12000r/min的转速，离心1min。重复本次操作2～3次，待收集管中的乙醇溶液没有明显的颜色。
[0099]
(7)将空吸附柱放于离心机中，以12000r/min的转速，离心1min。取出，再讲空吸附柱移至1.5ml ep管中，开启吸附柱盖子，于通风橱中风干30min至无乙醇味道。
[0100]
(8)移液枪吸取40ul的灭菌超纯水，竖直滴入吸附柱的过滤层中间位置，静置5min，以12000r/min的转速，离心1min。重复本次操作2次。于ep管盖写上编号，将提取的dna溶液放置-20℃环境下保存。
[0101]
(9)取2μl dna用于1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，取1μl dna用于nanodrop分光光度计测浓度。
[0102]
2.ssr分子标记及引物组合
[0103]
2.1.本研究基于神农香菊的近缘物种菊花脑的基因组信息和神农香菊的转录组数据(http://www.amwayabrc.com/)，利用misa软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)分别进行核基因组和转录组的ssr位点筛选。搜索标准参数设置为单，二，三，四，五和六核苷酸至少重复10、6、5、5、5和5次。得到的ssr位点及侧翼保守序列批量导入primer3软件(https://sourceforge.net/projects/primer3)进行引物设计。引物设计的设置参数为：(1)引物长度为18～27bp；(2)pcr产物大小为100～500bp；(3)gc含量40～60％；(4)退火温度55～65℃。
[0104]
合成的荧光引物即在正引物的5’端加入m13(gtaaaacgacggccagt)作为接头序列，接头序列由不同荧光基团(fam/hex/rox/tamra)修饰。
[0105]
2.2.根据ssr分子标记设计引物，所述引物如下表2所示。
[0106]
表2 ssr分子标记引物
[0107]
[0108][0109]
3.样品扩增使用表2中的引物进行样品的pcr扩增。
[0110]
pcr扩增体系为：dna模板2ul(50ng/μl)，5μm的正引物0.5ul、反引物0.5ul、2
×
es taq master mix 5μl，双蒸水1.85μl，fam/hex/rox/tamra0.15ul,体系的总体积为10μl。
[0111]
pcr扩增的程序为95℃，2min；95℃，30sec；55℃，30sec；72℃，30sec；35个循环；72℃，2min；4℃保存。
[0112]
4.检测
[0113]
1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。扩增完成后将pcr产物均稀释10倍。将去离子甲酰胺(hidi)和liz500分子量内标按体积比为100：1混合，将9μl的混合物和1μl的pcr产物添加到96孔样品板中，最后将具有四种不同荧光基团的四板96孔板的样品均匀混合于一块上样板中，使用dna测序仪abi3730xl对混合后的pcr荧光产物进行荧光毛细管电泳检测，并使用软件genemarkerv2.2.0对原始数据进行条带分型。
[0114]
5.数据分析
[0115]
使用popgene版本1.3.2计算居群样本的遗传多样性参数，包括等位基因数(number of alleles，na)、有效等位基因数(effective number of alleles，ne)、观察杂合度(observed heterozygosity，ho)、期望杂合度(expected heterozygosity，he)、香农信息指数(shannon's information index，i)，用pic-cale软件计算多态信息含量(pic)，使用r语言采用upgma(带算术的非加权对群方法)通过计算sm距离进行聚类分析，采用strcture软件进行种群结构分析。
[0116]
试验结果
[0117]
1.所筛选和设计的ssr分子标记引物扩增的多态性良好，图1所示为其中一种ssr01分子标记对部分样品扩增后的毛细管电泳检测峰图，从图中可以看出，该ssr分子标记引物扩增效果良好，基线平稳、峰型尖锐、多态性良好。
[0118]
2.遗传分析及聚类
[0119]
用这一组ssr分子标记扩增所有样本，计算引物的遗传多样性参数如表3所示；
[0120]
表3：21对ssr标记的遗传多样性
[0121]
[0122][0123]
结果表明：单个ssr位点扩增了5～16个等位基因，有效等位基因(ne)的范围从1.278至4.632，这些ssr位点的pic信息指数均值为0.529，相应的其他遗传参数多样性水平也较高，说明这21对引物具有较高的多态性，可以用于该实验材料的群体遗传分析。
[0124]
n-j树结果显示，洪山野菊(hs-ci)单独聚为一支，同时大多数神农香菊样本以及疑似野菊样本各自聚类，只有少数神农香菊个体和少数疑似野菊个体呈现相互居群样本混杂。structure分析结果表明，当k＝2时，洪山野菊(hs-ci)与其他居群样本具有明显的遗传分化；当k＝3时(图2)，神农顶和天门垭的疑似野菊样本(snd-ci和tmy-ci)进一步从其他神农香菊样本中分离开来；神农架地区，神农香菊和野菊的遗传差异较大，不同地区的神农香菊的遗传差异较小。
[0125]
本研究利用ssr标记检测了野菊和神农香菊的遗传多样性，实验结果精确、可靠。区别于传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测技术，本研究采用毛细管电泳检测技术，检测误差在1～2bp之内，相比于传统技术，该方法极大地提高了检测效率和精确性。此外，采用多种荧光标记如fam/hex/rox/tamra混版上样，进一步提高了毛细管电泳检测效率，并大幅度降低了检测成本。综合分子标记进行遗传多样性的鉴定评价，保证了对基因组更大程度的代
表性和覆盖性，能很好地代表野菊和神农香菊种质资源的遗传多样性。实验证实，这一批ssr分子标记的多态性良好，可以用于野菊和神农香菊的资源遗传评价、种间杂交后代鉴定、分子标记辅助育种等领域。