假单胞菌ZB30及其在苯乙烯废气降解中的应用

假单胞菌zb30及其在苯乙烯废气降解中的应用
技术领域
1.本发明属于环境污染治理领域，涉及一株假单胞菌属(pseudomonas sp.)真菌“zb30
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及其在苯乙烯废气生物降解中的应用。


背景技术：

2.大气污染是环境污染的主要问题之一，也是当前人们关心的热点问题。伴随着社会 经济的发展，工业发展也越来越快。由于工业排放造成大气污染的情况越来越严重，在 实际工业生产过程，会产生大量的苯乙烯等恶臭废气。苯乙烯属于挥发性有机化合物， 主要由塑料、油漆、涂料、精细化工等工业产生。我国制定的gb14554-93《恶臭物质 排放标准》将苯乙烯列为恶臭废气的特征因子。苯乙烯废气的排放不仅对土壤、大气和 水资源造成污染，而且对人类的身心健康造成很大的潜在危害。苯乙烯可以通过呼吸系 统、皮肤及胃肠道等多种途径侵入人体，对人体的呼吸道黏膜、神经系统、肝脏和肺等 造成危害。苯乙烯轻者会引起人体咽喉痛、流鼻涕和咳嗽等，重者则会引起急性中毒， 出现呕吐、恶心、乏力眩晕、食欲减退、腹胀及忧郁等症状。因此，处理苯乙烯废气对 环境和人类健康有着极大的意义。随着生活水平的不断提高，人们的环境保护意识不断 提高，对生活质量和环境条件的要求也越来越高，如何高效的处理苯乙烯废气已成为人 们关注的焦点。
3.苯乙烯废气的处理方法可以分为三种：物理法、化学法和生物法。其中，物理法包 括吸附法、膜分离法、吸收法等；化学法包括光催化法、热破坏法等；生物法主要包括 生物滴滤法、生物洗涤法和生物滤池法等。虽然物理法和化学法都有不少各自的优点， 但是也存在着许多缺点，譬如投资成本高、操作复杂、容易产生二次污染等。与传统的 处理方法相比，生物法处理废气具有诸多优点，如设备要求简单，运行费用低，不易产 生二次污染，安全性好、且处理效率高等。采用生物法处理苯乙烯废气的重要方法之一 是筛选出具有高效降解苯乙烯废气能力的菌株，已成为国内外处理恶臭废气的主要方法。 目前，微生物降解苯乙烯废气的研究报道非常少。


技术实现要素：

4.本发明的一个目的是提供一种假单胞菌属(pseudomonas sp.)真菌“zb30”。
5.本发明的通过下述技术方案实现：
6.本发明提供的假单胞菌属(pseudomonas sp.)真菌“zb30”保藏于中国典型培养 物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：cctcc no:m 2021371， 保藏日期：2021年4月14日。
7.该菌株的生物学特征如下：近圆形、边缘规则、淡黄白色，表面光滑，革兰氏阴性。
8.本发明所涉及菌种的筛选技术方案是：
9.所提供菌株是从工业企业的生物滴滤塔反应器活性污泥中筛选获得。取驯化后的生 物反应器污泥10g，用双蒸水稀少至5倍、50倍和500倍三个不同的浓度梯度，分别 涂布于pda真菌固体培养基上。每个培养皿涂布2ml稀释后的污泥溶液，在32℃下恒 温箱培养2
物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：cctcc no:m 2021371， 保藏日期：2021年4月21日。
19.本发明具有的有益效果是：
20.(1)假单胞菌属真菌“zb30”能降低恶臭废气中的苯乙烯浓度，且处理效果优异。
21.(2)添加假单胞菌属真菌菌株“zb30”后的活性填料，其驯化时间明显缩短，可 快速启动生物滴滤塔反应器；
22.(3)本发明提供的假单胞菌属真菌“zb30”在苯乙烯废气降解中的方法，操作简 单；
23.(4)本发明提供的假单胞菌属菌株“zb30”菌种可长期保存，-80℃超低温冰箱中 保存一年后，经活化可继续使用，对含苯乙烯废气的清除效率没有显著下降，具有较好 的可保存性。
附图说明
24.图1为生物反应器结构示意图；
25.图2为菌株的菌落形态图；
26.图3为系统发育树图。
具体实施方式
27.为了使本发明的目的、技术和特点更加清楚，以下通过具体实施例进一步来为本发 明进行详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限 定本发明。
28.实施例1：假单胞菌属真菌“zb30”的分离培养
29.所提供菌株是从工业企业的生物滴滤塔反应器(如图1所示)活性污泥中筛选获得。 取驯化后的生物反应器污泥10g，用双蒸水稀少至5倍、50倍和500倍三个不同的浓 度梯度，分别涂布于pda真菌固体培养基上。每个培养皿涂布2ml稀释后的污泥溶液， 在32℃下恒温箱培养2天，从菌落边缘挑取菌丝体，转移到新鲜的pda平板划线分离 培养，重复至获得纯培养物，转入pda斜面保存。
30.实施例2：假单胞菌属真菌“zb30”的形态学及分子生物学鉴定
31.根据《真菌鉴定手册》手册，在显微镜下，观察假单胞菌属真菌“zb30”的形态特 征，具体方式是采用点种法将筛选到的菌株接种于pda平板上，放于32℃恒温培养， 肉眼观察菌株的形态特征，包括菌落形态、颜色、大小、边缘特征、菌丝性状、生长速 度等特征。
32.本发明的假单胞菌属真菌“zb30”的形态特征如下：
33.如图2所示，假单胞菌属真菌“zb30”菌株在pda培养基上，该菌近圆形、边缘规 则、淡黄白色，表面光滑，革兰氏阴性。
34.实施例3：假单胞菌属真菌“zb30”的分子生物学鉴定
35.1、基因组dna提取
36.基因组dna提取方法如下：选取菌液2ml，在4℃、12000rpm条件下，离心3分 钟，进而收集获得菌体；加入600μl 2
×
ctab(包含2％β-巯基乙醇)，液氮中速 冻1分钟，再转至64℃水浴1分钟，重复上述过程3次，然后，高速震荡2min，64℃ 水浴30分钟；加入等体积的氯
仿：异戊醇(体积比24:1)，上下颠倒混匀，冰上静止 3分钟，然后，4℃，12000rpm，离心15分钟，取上清至新的离心管；在上清液中加 入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，在冰上静止放置30分钟，然后，4℃，12000rpm， 离心5分钟；弃上清，利用75％无水乙醇进行沉淀物洗涤，然后，在室温下风干得到真 菌dna，然后用ddh2o溶解dna沉淀物，冰箱保存备用。
37.2、假单胞菌属真菌“zb30”its-pcr扩增及分子鉴定
38.利用真菌通用引物27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag
–3’
)、1492r(5
’ꢀ‑
tacggctaccttgttacgactt-3’)为pcr扩增引物，经pcr技术，扩增出真菌基因组的 rrna基因内部转录间隔区(its)。pcr反应体系(20μl)：2
×
taq pcr mastermix 10 μl，上游引物(10μmol/l)1μl，下游引物(10μmol/l)1μl，dna模板(50ng/l) 1μl，利用ddh2o补齐至20μl体积。然后，在pcr仪上进行pcr扩增，扩增条件： 94℃预变性5分钟；32个循环：94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸1 分钟30s秒；72℃进一步延伸10分钟。最后，将pcr产物纯化后送样测序。
39.将测序获得核苷酸序列，在ncbi中进行blast比对，比对结果显示其与假单胞菌 属真菌“zb30”(genbank登录号mn410633)的同源性最高，为100.0％，故鉴定该菌株 为假单胞菌属真菌。
40.实施例4：假单胞菌属菌“zb30”的系统进化分析
41.将上述获得的假单胞菌属真菌“zb30”序列在ncbi中进行的blast检索，下载与 之相近的已知菌种its序列，用于构建系统发育树。采用clustalx1.83进行多序列比 对，比对结果利用mega7.0软件并采用neighbor joining统计学方法，bootstrap值 设置为1000，使用tamura-nei model碱基替换模式，构建基于rdna its序列的系统 发育树。具体的系统进化树如图3所示。
42.实施例5：假单胞菌属真菌“zb30”发酵及填料制备
43.在经过pda固体培养基培养纯化之后，将假单胞菌属菌“zb30”接种于发酵培养 基，按照种子液和发酵培养基的体积比为1:9进行放大培养。发酵培养基为tryton 10 g/l，yeast extract 5g/l，氯化钠10g/l，利用ddh2o配制。发酵培养的温度为32-37℃， 溶解氧大于1.6mg/l，压强为0.08mpa，培养时间48h。将发酵液放于冷冻离心机，4℃，4000rpm，离心30分钟，去上清液后，收集沉淀菌体，以新鲜无菌培养液重悬 菌体，得到终浓度为0.8-1.0g/l的真菌悬液。将“zb30”悬液吸附于填料上，完成富 含假单胞菌属菌“zb30”真菌的填料制备。
44.实施例6：假单胞菌属菌“zb30”提升生物滴滤反应器对含苯乙烯废气的吸收清除效率
45.设计两套平行生物滴滤塔反应器(对照组和处理组)，分别采用原始活性污泥和人 工添加上述实施例所得真菌接种后的活性污泥，检测一个工作日周期内，两组设备对含 氨废气吸收清除效率的差异。选取两套设备启动10天后，取样测定所需参数。生物滴 滤塔反应器输入口的废气含苯乙烯浓度分别为150mg/m3、300mg/m3、450mg/m3、600 mg/m3和750mg/m3，测定苯乙烯降解率。测定结果如表1所示。从表1数据结果可以看 出，处理组生物滴滤塔反应器对含苯乙烯废气的清除效率为98.5％～99.8％之间，显著高 于对照组。
[0046][0047]
实施例7：假单胞菌属菌“zb30”缩短生物滴滤塔反应器启动时间
[0048]
设计对照组和处理组两套平行生物滴滤塔反应器，分别采用原始活性污泥和人工 添加上述实施例所得真菌接种后的活性污泥，检测从开始第一天到启动后第10天的含 苯乙烯废气清除效率。取样时间固定为每天早上8点，提取输入口和输出口的废气样本， 测定氨气含量，单位为mg/m3。所测得的数据见表格2。
[0049][0050]
表2的结果表明，处理组的生物滴滤塔反应器从6天开始已经达到97.6％的效率，到 第10天就可以达到99.8％的效率；而对照组的生物滴滤塔反应器从第6天开始才达到 86.5％的效率，并且之后逐渐趋于稳定。表2数据统计结果表明，微小杆菌属真菌“zb21
”ꢀ
真菌可以大幅度缩短生物滴滤塔反应器启动时间。
[0051]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神 和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之 内。