一种适用于圆红冬孢酵母的2A肽突变体及其筛选方法与应用与流程

本发明属于生物，具体涉及一种适用于圆红冬孢酵母的2a肽突变体及其筛选方法与应用。

背景技术：

1、2a肽是一类长度为18-22个氨基酸残基的肽片段，存在2个蛋白之间，能诱导细胞内含有2a肽的重组蛋白自我剪切，理论上可以实现两个基因的等量表达，因此2a肽非常适合用于构建双顺反子载体，但目前报道的2a肽介导的双顺反子载体的目的基因表达水平较低。

2、圆红冬孢酵母作为一种产油微生物，可天然累积类胡萝卜素，其具有生长周期短、利用碳源广泛、油脂积累量多等优点，且其对纤维素水解液中的诸如乙酸等毒性物质具有天然抗性，被认为是一株具有广泛工业应用前景的菌株。然而，受限于遗传操作的便利性和可操控性，使得对圆红冬孢酵母遗传改造研究进展缓慢、效率较低。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是提供一种多肽。

2、本发明提供的多肽的氨基酸序列如序列表中序列2或序列6所示。

3、本发明的另一个目的是提供编码上述多肽的核酸分子。

4、本发明提供的编码上述多肽的核酸分子为如下a1)或a2)：

5、a1)其编码序列是序列表中序列1或序列5所示的dna分子；

6、a2)与a1)限定的dna分子具有75％以上的同一性且编码上述多肽的dna分子。

7、上述a1)所述核酸分子可以是dna，如重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

8、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述多肽的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的多肽核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述多肽且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

9、上述a2)所述核酸分子中，所述同一性是指与天然核酸序列的序列相似性。同一性包括与本发明的编码序列2或序列6所示的氨基酸序列组成的多肽的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

10、本发明还有一个目的是提供与上述多肽相关的生物材料。

11、本发明提供的与上述多肽相关的生物材料为含有上述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

12、进一步的，所述重组载体可为双顺反子载体或多顺反子载体。

13、本发明还有一个目的是提供上述多肽或上述核酸分子或上述生物材料的新用途。

14、本发明提供了上述多肽在作为2a肽中的应用。

15、本发明还提供了上述多肽或上述核酸分子或上述生物材料在多个目的基因共表达或同时表达多个目的基因中的应用。

16、本发明还提供了上述多肽或上述核酸分子或上述生物材料在制备目的蛋白中的应用。

17、本发明还提供了上述多肽或上述核酸分子或上述生物材料在提高目的蛋白表达水平中的应用。

18、本发明还有一个目的是提供一种多个目的基因共表达或同时表达多个目的基因的方法。

19、本发明提供的多个目的基因共表达或同时表达多个目的基因的方法包括用上述核酸分子连接多个目的基因进行表达的步骤。

20、进一步的，所述方法包括用上述核酸分子连接两个目的基因进行表达的步骤。

21、更进一步的，所述方法包括用上述核酸分子连接leu2基因序列(带有flag标签)和egfp基因序列(带有sv40核定位序列)进行表达的步骤。

22、本发明最后一个目的是提供一种2a肽突变体的筛选方法。

23、本发明提供的2a肽突变体的筛选方法包括如下步骤：

24、1)通过易错pcr将适用于酵母菌的2a肽编码序列进行突变，得到易错pcr产物，并构建到质粒中，得到带有2a肽突变体的质粒文库；

25、2)将所述带有2a肽突变体的质粒文库转染酵母菌，然后用营养缺陷型培养基进行筛选，选择比对照菌株生长好的菌株作为目标菌株；

26、3)提取所述目标菌株的基因组dna并进行测序，获得2a肽突变体编码序列。

27、所述步骤1)中，所述质粒可为质粒p0，所述质粒p0具体为在质粒pkocar2的ncoi酶切位点处插入序列表中序列4所示的dna分子后得到的质粒；所述质粒pkocar2的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

28、所述步骤1)可包括如下步骤：

29、1-1)以p1质粒为模板采用序列7和序列8组成的引物对进行随机突变，得到易错pcr产物；所述p1质粒具体为在所述质粒p0的smai酶切位点处插入序列表中序列1所示的dna分子后得到的质粒；

30、1-2)利用限制内切酶smai酶切所述质粒p0，得到酶切产物；

31、1-3)将所述易错pcr产物和所述酶切产物进行组装，得到带有所述2a肽突变体的质粒文库。

32、进一步的，所述随机突变可采用genemorph ii random mutagenesis试剂盒构建突变体系。

33、所述组装可采用gibson assembly试剂盒构建组装体系。

34、更进一步的，所述突变体系(50μl)具体如下：41.5μl水，5μl 10×mutazyme iireaction buffer，1μl 40mm dntp混合物，0.25μl上游引物(引物浓度为250ng/μl，序列7)，0.25μl下游引物(引物浓度为250ng/μl，序列8)，1μl mutazyme ii dna polymerase(2.5u/μl)，500ng模板(p1质粒)。

35、所述组装体系中，所述酶切产物与所述易错pcr产物的摩尔比可为2:1。

36、所述组装的条件可为50℃反应20分钟。

37、所述步骤2)中，所述营养缺陷型培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为：酵母基础氮源1.7g/l、硫酸铵5g/l、l-精氨酸0.1g/l、l-半胱氨酸0.1g/l、l-赖氨酸0.1g/l、l-苏氨酸0.1g/l、l-天冬氨酸0.05g/l、l-异亮氨酸0.05g/l、l-苯丙氨酸0.05g/l、l-脯氨酸0.05g/l、l-丝氨酸0.05g/l、l-酪氨酸0.05g/l、l-缬氨酸0.05g/l、l-甲硫氨酸0.05g/l、l-色氨酸0.1g/l、l-组氨酸0.05g/l、l-尿嘧啶0.1g/l、l-腺嘌呤0.1g/l，葡萄糖20g/l。

38、所述选择比对照菌株生长好的菌株为选择比对照菌株生长快且比对照菌株od600nm数值大的菌株。所述对照菌株具体可为下文中的重组圆红冬孢酵母strain 1。

39、所述步骤3)可包括如下步骤：提取所述目标菌株的基因组dna，采用序列9和序列10组成的引物对进行扩增，并对扩增产物进行测序，获得2a肽突变体编码序列。

40、上述方法中，所述2a肽可为序列表中序列2所示的多肽；

41、所述2a肽突变体可为序列表中序列6所示的多肽。

42、所述2a肽突变体的剪切效率(切割效率)大于所述2a肽。

43、按照上述方法筛选获得的2a肽突变体也属于本发明的保护范围。

44、如下a1)-a4)任一所述应用也属于本发明保护范围：

45、a1)按照上述2a肽突变体筛选方法筛选获得的2a肽突变体在作为2a肽中的应用；

46、a2)上述2a肽突变体的筛选方法或按照上述2a肽突变体筛选方法筛选获得的2a肽突变体在多个目的基因共表达或同时表达多个目的基因中的应用；

47、a3)上述2a肽突变体的筛选方法或按照上述2a肽突变体筛选方法筛选获得的2a肽突变体在制备目的蛋白中的应用；

48、a4)上述2a肽突变体的筛选方法或按照上述2a肽突变体筛选方法筛选获得的2a肽突变体在提高目的蛋白表达水平中的应用。

49、上述任一所述方法或应用中，所述制备目的蛋白为利用酵母菌制备目的蛋白。

50、所述提高目的蛋白表达水平为提高目的蛋白在酵母菌中的表达水平。

51、上述任一所述方法或应用中，所述提高目的蛋白表达水平体现为提高2a肽剪切效率。

52、上述任一所述方法或应用中，所述目的蛋白可为重组蛋白。

53、上述任一所述方法或应用中，所述多个目的基因可为两个目的基因。所述多个目的基因共表达或同时表达多个目的基因为在单个启动子驱动下多个目的基因共表达或在单个启动子驱动下同时表达多个目的基因。

54、上述任一所述方法或应用中，所述酵母菌可为圆红冬孢酵母(rhodosporidiumtoruloides)。所述圆红冬孢酵母(rhodosporidium toruloides)具体可为圆红冬孢酵母(rhodosporidium toruloides)菌株ncyc 1585。

55、本发明首先鉴定了一个适用于圆红冬孢酵母的2a肽bmcpv1，然后通过易错pcr对该序列进行突变建库，并转化圆红冬孢酵母ncyc 1585菌株，再根据生长状态用营养缺陷型培养基sc-leu进行筛选，最后获得比2a肽bmcpv1剪切效率更高的2a肽突变体序列，并将其命名为bmcpv1-1。本发明提供了一种适用于圆红冬孢酵母的2a突变体筛选方法，并成功筛选到一个剪切效率提高的2a突变体，对利用酵母表达系统制备重组蛋白或提高重组蛋白表达水平具有重要意义。