技术特征：
1.一种凝结芽孢杆菌h-1的表达载体，其特征在于，包括来源于载体pnw33n的复制子ori、复制子repb，来源于载体pkvm1的dna转移起始位点orit，抗性基因。2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述抗性基因为四环素抗性基因tet
r
，载体命名为pnwmt，所述载体pnwmt的核苷酸序列如seq id no.1所示。3.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述抗性基因为卡那霉素抗性基因kan
r
，载体命名为pnwmk，所述载体pnwmk的核苷酸序列如seq id no.2所示。4.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述载体还包括反义rna表达模块。5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述反义rna表达模块包括启动子p
ldh1
、限制酶识别位点、反义rna序列、终止子tb5和终止子rrnb t1。6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述反义rna序列以甲基转移酶hsdm846为目标基因，载体命名为pnwmtas，所述载体pnwmtas的核苷酸序列如seq id no.3所示。7.如权利要求5所述的表达载体在凝结芽孢杆菌h-1敲弱基因表达中的应用。8.如权利要求1～6所述的任一项表达载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：s1从载体pnw33n上pcr扩增出复制子ori和复制子repb片段，从载体pkvm1上pcr扩增出dna转移起始位点orit片段，从含有抗性基因的载体上pcr扩增出抗性基因片段；s2将复制子ori和复制子repb片段和dna转移起始位点orit片段进行融合pcr；s3将复制子ori、复制子repb和dna转移起始位点orit片段与抗性基因片段使用无缝克隆技术进行连接，即可得到目的载体；s4将s3获得的目的载体转化到供体菌，再通过接合转移的方法，将目的载体转化到受体菌嗜热凝结芽孢杆菌h-1中。9.如权利要求8所述的表达载体构建方法，其特征在于，所述接合转移的方法中，供体菌与受体菌以总od
600
值以10：1的比例混合。10.如权利要求8所述的表达载体构建方法，其特征在于，所述供体菌为大肠杆菌s17-1菌株。
技术总结
本发明公开了一种凝结芽孢杆菌H-1的表达载体及其构建方法与应用，所述表达载体包括来源于载体pNW33N的复制子ori、复制子repB，来源于载体pKVM1的DNA转移起始位点oriT，抗性基因。本发明构建了携带四环素抗性基因的pNWMT质粒、携带卡那霉素抗性基因的pNWMK质粒和敲弱DNA甲基转移酶hsdM846表达的载体pNWMTAS，完成了凝结芽孢杆菌H-1的基础基因操作工具，验证了反义RNA表达模块在凝结芽孢杆菌H-1的关键基因的研究上的应用价值。关键基因的研究上的应用价值。关键基因的研究上的应用价值。
技术研发人员：陶飞 直家辉 孙舒扬 许平
受保护的技术使用者：上海交通大学
技术研发日：2022.04.21
技术公布日：2022/6/7