家禽SNP分子标记选择及其应用

家禽snp分子标记选择及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物技术和分子标记技术领域，特别涉及一种家禽snp分子标记选择及其应用。


背景技术：

2.随着人们生活水平的提高，大家对日常饮食健康也日益关注。相比以前只注重量的追求，现在更注重质的享受，开始更加关注食物的营养结构，追求低脂的食品。禽肉脂肪含量较低、肉质鲜美、营养丰富并且其烹饪方式多种多样，很早就已成为人们日常食用较多的肉类之一。
3.在禽类的生长轴上，gh基因是调节动物生长的重要激素，具有促进生长的功能。当gh起作用时，第一步是结合靶细胞表面的gh受体，然后通过ghr传导信号进入细胞，促进细胞内生长相关通路的活性。生长激素受体(ghr)是gh调节细胞生长的关键基因。据报道，生长激素受体(ghr)基因还与禽类体内的脂肪沉积有关。
4.在动物的生长发育过程中，生长激素要发挥作用必须与生长激素受体结合。对于牛来说，当ghr基因碱基序列发生突变，将导致gh正常功能的发挥受到影响，进而影响到产奶、产肉等诸多性状。研究表明，当生长激素分泌增多时会提高肉禽类的生长性能，促进动物体物质与能量代谢，促进生长和发育过程。同时，gh基因对于家禽也是一种重要的功能基因，对于家禽的生长发育起着关键性作用。对家禽的基因研究中，在z染色体的短臂上发现了ghr基因确定了它的位置，ghr受体的跨膜结构包含有24个氨基酸残基，这些残基位于它的238-261的位置，ghr基因总共包含有592个氨基酸残基，其中n末端有16个氨基酸信号肽。相比于哺乳动物之间的ghr基因的氨基酸残基序列，家禽的ghr同源性仅有较低的同源性，例如鸡和鼠的同源性为58％，和兔的同源性为53％。相反的是，ghr基因氨基酸残基序列在哺乳动物之间相互都有着较高的同源性，例如人与鼠和兔的同源性分别达到了70％和84％，即使这三者同源性并不是太高，但它们的ghr的结构都比较相似，都是由胞外结构、胞内结构和跨膜结构这三个部分组成，其中，胞外结构负责与膜外配体结合，在存在于胞外结构的7个半胱氨酸所形成的二硫键能够使ghr在保外保持特定的空间结构而不会变形。
5.ghr是gh能够正常发挥作用的基础，和动物的生长发育有密切关系。ghr是一种重要的跨膜糖蛋白，是由单一基因所编码，含有620个氨基酸，当动物体内器官含有足够的ghr才能使促乳素、细胞因子、生长激素、促红细胞生成素等正常发挥作用。ghr其存在于机体的大多数器官细胞之内，起到与gh结合发挥gh生理作用的功能，在肝脏中尤为突出，在对禽类的ghr研究发现，肝脏是家禽ghr表达最多的器官。除了肝脏之外，ghr基因在皮肤、心脏、肌肉、肺、肾、睾丸、卵巢、肾上腺、脑和淋巴组织等都有表达。但是在不同的器官之中，ghr基因的不同位置也能发挥不同的功能，有不同的调节方法。
6.随着分子标记技术及分子数量遗传学的不断发展，应用分子遗传标记进行标记辅助选择可以大大缩短选育的世代间隔，加速选育的遗传进展。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，snps)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起
的dna序列多态性，其具有易于统计、分布广、遗传稳定性好等特性，为当前应用最广泛的遗传标记技术，在动物遗传育种研究领域发挥着重要作用。寻找与禽类生长和肉质性状相关的snps，并在分子育种中加以运用，可加快遗传进展并提高家禽的市场竞争力，从而提高家禽产品整体价值。


技术实现要素：

7.为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种与家禽生长和肉质性状相关的snp分子标记，并建立标记基因型检测方法，将其应用于家禽的选育中，提高家禽屠体性状。
8.本发明的第一方面在于提供了一种家禽snp分子标记，所述家禽snp分子标记位于galgal6版基因组z染色体中，对应于ghr基因第十外显子区域中的突变位点g.1595g》a，该snp位点的基因型为aa、ga和gg。
9.本发明的第二方面在于提供一种与家禽生长和肉质性状相关的早期选择方法。根据待测家禽ghr基因第十外显子区域中的突变位点g.1595g》a的基因型进行家禽的早期选择，获取预期屠体性状符合预期目标的个体进行饲养，降低总体饲养成本和提高产出价值。
10.进一步，所述早期选择方法包括如下步骤：
11.1)提取待测家禽血液的dna；
12.2)以待测家禽的血液dna为模板，进行pcr扩增获得含ghr基因目的片段的pcr产物；
13.3)采用dna测序方法检测pcr产物的突变位点g.1595g》a的基因型；
14.4)基于步骤3)snp位点的基因型对禽类生长和肉质性状进行早期选择，其中ga基因型个体的活重、腿肉重、心肝肌胃腺胃重、小肠长度、屠体重、胫长、腿肌肉色显著优于aa和gg基因型个体。
15.进一步，步骤3)所述pcr扩增所使用的引物的核苷酸序列为：
16.上游引物pcr-f：5
′–
ccctgacaaacactgac
–3′
(seq id no.1)；
17.下游引物pcr-r：5
′–
acacccacaagaacaag
–3′
(seq id no.2)。
18.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
19.本发明提供的snp分子标记，即家禽ghr基因外显子10序列中的突变位点g.1595g》a与家禽的多种性状相关，是一个新的分子标记。通过确定该snp位点的基因型对家禽的生长和肉质性状进行早期选择，可以节省生产成本并加快遗传进展，更好地应用于家禽选育中，具有很大的经济应用价值和科研价值。
附图说明
20.图1是ghr基因引物特异性测试结果图；
21.图2是ghr基因第十外显子区域中基因分型结果图。
具体实施方式
22.下面将结合具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实
施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.实施例1，提取杏花鸡
×
隐性白洛克鸡f2代资源群全同胞家系待测血液dna
24.实验开始时，确定肉鸡饲养数量为200只。待测禽类为杏花鸡与隐性白洛克鸡全同胞f2资源群体，其中隐性白洛克鸡为快大型肉鸡，杏花鸡为慢速型中国广东地方品种肉鸡。200只肉鸡于同一日龄出雏，并于同一日龄进行出生重指标测定，随后鸡群采用平养的方式饲养，饲喂符合国际配方标准的玉米-豆粕型饲料。在90日龄时屠宰取样，屠宰前记录肉鸡活重并进行翅下静脉采血，收集血液储存在含2％edta抗凝血剂的离心管里，用于血液dna提取。宰后测量胫长、头宽、胸宽、胸深、体长、胸角宽、屠宰重量、皮质厚度、去内脏重、膛重、胸肌重、腿肌重、羽重、腹脂重、头颈重、心脏重、肝重、胃重、小肠长和胸肌剪切力等多个屠体和肉质性状。
25.所有个体的基因组dna根据plant mini kit(qiagen,hilden,ca；cat#69104)试剂盒说明书步骤抽提血液dna，检测质量和浓度后稀释至50ng/μl，4℃保存备用。
26.实施例2，snp检测及dna混池测序
27.1、引物设计及特异性检测：
28.根据genebank上所公布的ghr基因序列，设计出用于扩增ghr基因的引物序列，如表1所示。将设计的引物对序列发往生工生物公司(上海)合成，并用该引物对对ghr基因标准品进行pcr扩增，测试引物的特异性，结果如图1所示，12个pcr扩增的平行样本均能稳定获得同样长度的扩增产物。所述ghr基因标准品pcr扩增产物的核苷酸序列如sed id no.3所示，该snp位点位于所扩增689bp片段序列的第195位碱基。
29.表1 ghr的snp筛选的引物信息
[0030][0031]
2、dna混池测序：
[0032]
从实施例1所得血液dna样品中随机挑选30个dna样品构建混池，每三个样品(每个样品约0.33μl)混合为一个混合样品，共计10个。将混池样品进行pcr扩增，所用引物与上述snp检测中所用的引物对相同，将获得的pcr产物送往生工生物公司测序，测序结果检测得到ghr基因中存在snp突变位g.1595g》a。
[0033]
实施例3，确定ghr突变位点g.1595g》a的基因型
[0034]
使用实施例2中步骤1的引物对，对实施例1所得血液dna全部进行pcr特异性扩增，获得ghr基因目的片段的pcr产物。分别对pcr产物进行测序，对每一个测序结果的基因型进行分析，分型结果如图2所示。在本实验例中成功分型199个个体，接着对各个基因型进行统计分析以得到该位点的基因型频率和等位基因频率。该snp突变位点g.1595g》a的基因及基因型频率统计结构如下表2所示。
[0035]
表2 ghr基因突变位点g.1595g》a的基因型频率等位基频率
[0036][0037]
其中：
[0038]
(1)基因型频率是指群体中某一基因型个体数占基因型总数的比值：基因型频率＝某基因型总数/该群体总数
×
100％；
[0039]
(2)基因频率是指群体中某一基因占其同一位点全部基因的比值：基因频率＝某基因个数/群体中同一位点基因总数
×
100％。
[0040]
由表2结构可以看出，gg基因型为待测鸡群体优势基因型。
[0041]
实施例4，snp突变位点g.1595g》a与家禽生长、屠体性状的相关性分析
[0042]
使用spss软件对ghr基因不同基因型与该f2群体生长、屠体性状进行关联分析，结果以(平均数
±
标准误差)表示。以t检验进行显著性分析，p《0.05表示差异显著，p《0.01表示差异极显著。关联分析结果如下表3所示。
[0043]
表3 ghr基因突变位点g.1595g》a与鸡生长、屠体性状关联分析
[0044][0045]
注：同行相同字母表示关联不显著，不同字母表示关联显著(p《0.05)。
[0046]
由表中可以得出该位点与鸡的活重、腿肉重、心肝肌胃腺胃重、小肠长度、屠体重、出生重、胫长、腿肌肉色、腿肌剪切力、胸肌剪切力、腿肌ph值、腿肌电导率等多个性状显著相关(p《0.05)。该snp位点可以作为提高禽类生长、屠体性状的辅助选择和分子遗传育种标记。
[0047]
实施例5，snp突变位点g.1595g》a在家禽生长和屠体性状的早期选择
[0048]
为验证实验例4中的snp突变位点g.1595g》a在禽类中的早期选择作用，购买杏花鸡与隐性白洛克鸡全同胞f2群体120只，在相同的环境下饲喂至1周龄，抽取血液样本，获得dna样本，根据实施例2设计的特异性引物进行pcr扩增，对获得的pcr产物送测，对测序结果进行突变位点g.1595g》a的基因分型。本次实验成功对120个个体进行分型，如下表4所示。
[0049]
表4 ghr基因突变位点g.1595g》a的基因型频率等位基频率
[0050][0051]
将不同分型的个体分别圈养，饲养条件保持一致。饲养至90日龄后屠宰测定各屠体和肉质性状，数据如表5所示。
[0052]
表5 ghr基因突变位点g.1595g》a与鸡生长、屠体性状关联分析
[0053][0054]
表5数据显示：ga基因型的个体的活重、腿肉重、心肝肌胃腺胃重、小肠长度、屠体重、胫长、腿肌肉色显著优于aa和gg基因型的个体，适合针对筛选提高供肉量的种群；gg基因型的个体的腿肌剪切力、胸肌剪切力、腿肌ph值和腿肌电导率显著优于aa和ga基因型的个体，适合针对筛选提高肉质口感的种群。实验数据验证了snp突变位点g.1595g》a能够在早期帮助进行家禽生长和屠体性状的选择，挑选出所需性状对应的基因型个体进行饲养，可以节省生产成本并加快遗传进展。
[0055]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。