一种电子介导下聚多巴胺修饰希瓦氏菌还原固定Cr(VI)的方法

一种电子介导下聚多巴胺修饰希瓦氏菌还原固定cr(vi)的方法
技术领域
1.本发明属于危险废物无害化技术领域，具体涉及一种电子介导下聚多巴胺修饰希瓦氏菌还原固定cr(vi)的方法。


背景技术：

2.铬及其化合物在钢铁、电镀、制革、燃料等行业被大量应用，故铬成为土壤重金属污染的主要污染物之一。铬为非降解型有毒物质，目前土壤铬污染处理的思路主要是通过将高毒性的六价铬还原成低毒性的三价铬同时改变其存在形态以降低铬在土壤中的迁移性。传统的土壤铬污染的治理手段主要有物理法和化学法。随着生物技术的发展，微生物修复逐渐从实验阶段应用于实际，其具有投入低、经济环保、没有二次污染等优点。通过添加外源微生物或者利用土壤中存在的某些土著微生物来吸附、还原和沉淀污染土壤中的铬，实现对土壤环境介质中铬的固定，且有效地避免了稳定相固态含铬矿物被重新释放到环境中。
3.微生物电化学系统(bioelectrochemical system，bes)可通过外电路将电子输出和输入分离，在两个空间内实现电子“传递”。阳极电活性微生物通过胞外电子传递将电子导入阳极，实现底物的氧化及电子输出至外电路。阴极功能微生物将电子从阴极以胞外电子传递的途径摄取进入细胞内参与阴极的还原过程。对于微生物电化学系统还原cr(vi)来说，其内在机理为导电微生物能够在阳极通过有机物释放电子并将其传递到电极，然后通过外电路将电子传递到阴极，而阴极液中的电子受体通过接受电子而被还原。申请号cn202010533244.1公开了一种可加速铬还原的阴极及其制备方法和应用，阴极采用生物质碳和聚吡咯复合得到复合催化剂，具有较好的导电能力，较高的电荷迁移率和电化学稳定性，改善产电功率，增强了六价铬还原效率，但没有增强三价铬的固定效率。申请号cn201810490894.5公开了一种聚苯胺/还原石墨烯材料的合成方法及其在微生物燃料电池阴极材料的应用，微生物燃料电池的阴极材料采用聚苯胺/还原石墨烯材料吸附六价铬离子，增快阴极还原电子的速率，但修饰的阴极材料价格昂贵，不适宜实际应用。


技术实现要素：

4.为解决现有技术中含铬废水处理中铬元素的返黄和低浓度铬废水不易处理的问题，本发明的目的在于提供一种电子介导下聚多巴胺修饰希瓦氏菌还原固定cr(vi)的方法。
5.本发明方法实现了纳米颗粒在希瓦氏菌表面及内部的功能化修饰，协同加速了胞内外电子传递和代谢速率，并构建了电子-生物膜-cr(vi)的三元体系，利用bess技术，通过调控电子介导过程(电流导通/电路断开)或通过改变电极电位，利用导电网络复合膜上的微生物表面有机官能团来实现cr(vi)的还原固定，设备简单、操作性高、具有大规模连续化工业化生产的潜力，有望于解决目前的环境问题。
6.本发明目的通过以下技术方案实现：
7.一种电子介导下聚多巴胺修饰希瓦氏菌还原固定cr(vi)的方法，包括以下步骤：
8.(1)将希瓦氏菌(shewanella oneidensis mr-1)菌株接种培养至od
600
为1.5～2，离心收集，洗涤，将得到的菌体加入到tris-hcl缓冲液中，再加入盐酸多巴胺，恒温有氧的条件震荡反应，得到聚多巴胺修饰的希瓦氏菌(pda@shewanella oneidensis mr-1)；
9.(2)构建由工作电极、参比电极和对电极构成的三电极微生物电化学系统，将聚多巴胺修饰的希瓦氏菌接种到三电极微生物电化学系统的阳极液中，通过外电源施加正电势条件下孵育一段时间后，在工作电极上形成生物膜，即得生物阳极；在阳极液中加入cr(vi)并对生物阳极进行耐铬驯化；
10.(3)将耐铬驯化后的生物阳极置于阴极液中，对三电极微生物电化学系统施加负电势，在该电势下驯化一段时间使生物阳极反转为生物阴极，获得双向电子转移生物膜，同时实现阴极液中cr(vi)的还原固定。
11.优选地，步骤(1)所述培养指将希瓦氏菌(shewanella oneidensis mr-1)菌株接种到luria bertani(lb)培养基中，在30～37℃的恒温环境下进行有氧培养至od
600
为1.5～2。
12.优选地，步骤(1)所述洗涤指用质量浓度为0.85％的nacl水溶液和tris-hcl缓冲液(ph＝8.5)清洗2～3次。
13.优选地，步骤(1)所述tris-hcl缓冲液的ph为8.5。
14.优选地，步骤(1)所述菌体在tris-hcl缓冲液中的od
600
为1.5～2，所述盐酸多巴胺在tris-hcl缓冲液中的浓度为4～16mg/ml。
15.优选地，步骤(1)所述恒温有氧的条件震荡反应的温度为30～37℃，时间为2～4小时。
16.优选地，步骤(2)所述聚多巴胺修饰的希瓦氏菌接种到阳极液中od
600
为0.5～1。
17.优选地，步骤(2)所述阳极液由磷酸盐缓冲溶液(pbs缓冲溶液)、维生素、微量矿物质和c3h5o3na组成，阳极液中维生素的浓度为10ml/l，微量矿物质的浓度为12.5ml/l，c3h5o3na的浓度为15～30mmol/l；所述磷酸盐缓冲溶液由na2hpo4·
2h2o 3.32g/l、nah2po4·
12h2o 10.32g/l、nh4cl 0.31g/l和kcl 0.13g/l组成，ph＝7.0；按质量份数计，所述微量矿物质由3.0份mgso4·
7h2o、0.5份mnso4·
h2o、1.0份nacl、0.1份feso4·
7h2o、0.1份cocl2·
6h2o、0.1份cacl2、0.1份znso4·
7h2o、0.01份cuso4·
5h2o、0.1份akl(so4)2·
12h2o、0.01份h3bo3和0.01份na2moo4·
2h2o组成。
18.优选地，步骤(2)所述正电势值为+100～300mv。
19.优选地，步骤(2)所述孵育的温度为30～37℃，时间为1～5天。
20.优选地，步骤(2)、(3)中三电极微生物电化学系统的工作电极为碳毡电极(1
×
2cm2)，参比电极为饱和甘汞电极，对电极为铂片电极(1
×
1cm2)。
21.优选地，步骤(2)所述在阳极液中加入cr(vi)指在阳极液中加入20～100mg/l k2cr2o7；所述耐铬驯化的温度为30～37℃，时间为1～2天。
22.优选地，步骤(3)所述阴极液中含有20～100mg/l k2cr2o7。
23.优选地，步骤(3)所述阴极液含有磷酸盐缓冲溶液(pbs缓冲溶液)、维生素、微量矿物质和nahco3或c3h5o3na，阴极液中维生素的浓度为10ml/l，微量矿物质的浓度为12.5ml/
1)菌株(该菌株与文章carbon dots-fed shewanella oneidensis mr-1for bioelectricity enhancement.(https://doi.org/10.1038/s41467-020-14866-0)中的菌株相同)到lb培养基中，在30℃的恒温环境下进行有氧培养。当od
600
达到1.5时，离心收集细胞(菌体)，并用质量浓度为0.85％的nacl水溶液和tris-hcl缓冲液清洗多次。将收集的菌体浸入tris-hcl缓冲液中使其od
600
达到1.5，并向细胞悬浮液中加入盐酸多巴胺使其浓度分别为4、8、12和16mg/ml。将希瓦氏菌/多巴胺混合溶液在37℃有氧的条件震荡3小时。离心收集聚多巴胺修饰的希瓦氏菌(pda@s.oneidensis mr-1(1))，并用氮气净化的蒸馏水清洗多次。
43.通过图1(加入盐酸多巴胺浓度为8mg/ml，37℃下反应3h所得)对聚多巴胺包覆后的希瓦氏菌的sem结果分析，可以得知，通过调整聚多巴胺的浓度，在细胞表面组装了一层几乎完全覆盖并紧密连接的聚多巴胺纳米壳，而且聚多巴胺纳米粒子与细胞外膜紧密接触。
44.进一步通过图2(加入盐酸多巴胺浓度为8mg/ml，37℃下反应3h所得)对聚多巴胺包覆后的希瓦氏菌的tem图2中的a结果分析，可以得知，在最佳浓度下，聚多巴胺纳米颗粒不仅在细胞膜表面形成一层纳米壳，并且一些纳米粒子进入细胞质中，进一步促进了胞内外的电子传输。
45.实施例2
46.生物阳极的构建：使用实施例1聚多巴胺修饰的希瓦氏菌作为本体系的实验导电菌株(加入盐酸多巴胺浓度为8mg/ml，37℃下反应3h所得)。构建三电极微生物电化学系统，其中三电极体系由工作电极、参比电极以及对电极构成。用导线将三电极微生物系统与多通道恒电位器相连接起来，恒电位仪施加正电势(+200mv)。将导电菌(od
600
＝1)接种到阳极液(由磷酸盐缓冲溶液、维生素、微量矿物质和c3h5o3na组成，阳极液中维生素的浓度为10ml/l，微量矿物质的浓度为12.5ml/l，c3h5o3na的浓度为18mmol/l；所述磷酸盐缓冲溶液由na2hpo4·
2h2o 3.32g/l、nah2po4·
12h2o 10.32g/l、nh4cl 0.31g/l和kcl 0.13g/l组成，ph＝7.0，微量矿物质由3.0g mgso4·
7h2o、0.5g mnso4·
h2o、1.0g nacl、0.1g feso4·
7h2o、0.1g cocl2·
6h2o、0.1g cacl2、0.1g znso4·
7h2o、0.01g cuso4·
5h2o、0.1g akl(so4)2·
12h2o、0.01g h3bo3和0.01g na2moo4·
2h2o组成)中，在生物阳极阶段，碳布(工作电极)浸没在溶液中充当生物膜形成过程中的支持物，30℃孵育7天后，在碳布上逐渐形成导电生物膜。随后对阳极的生物膜进行耐铬驯化(在阳极液中加入20mg/l的重铬酸钾，耐铬驯化的温度为30℃，时间为1天)，使之具有较高的电化学活性。
47.通过图3聚多巴胺包覆的希瓦氏菌(加入盐酸多巴胺浓度为8mg/ml，37℃下反应3h所得)nonturnover cv图，可以得知，相较于希瓦氏菌，聚多巴胺包覆的希瓦氏菌，除了mtrc/omca通道，还可观察到另一对可逆的氧化还原峰，对应核黄素结合的mtrc/omca通道，峰值电流高。由此可见，通过mtrc/omca通道，聚多巴胺包覆的希瓦氏菌可更有效的将电子收集并传输起来。
48.进一步通过图4聚多巴胺包覆(加入盐酸多巴胺浓度为8mg/ml，37℃下反应3h所得)的希瓦氏菌安培时间图，可以得知，聚多巴胺包覆的希瓦氏菌产生的电流大约是希瓦氏菌的3倍，这表明聚多巴胺包覆层可以更加有效的促进导电菌与固体电极的电子传递速率。
49.实施例3
50.阳极导电网络的生物膜及复合膜反转到阴极(构建电子-生物膜/复合膜-cr(vi)的三元体系)：在三电极生物电化学系统中，将实施例2中耐铬驯化后的生物阳极置于阴极液(由磷酸盐缓冲溶液、维生素、微量矿物质和nahco3组成，阴极液中维生素的浓度为10ml/l，微量矿物质的浓度为12.5ml/l，nahco3的浓度为18mmol/l；所述磷酸盐缓冲溶液由na2hpo4·
2h2o 3.32g/l、nah2po4·
12h2o 10.32g/l、nh4cl 0.31g/l和kcl 0.13g/l组成，ph＝7.0；微量矿物质由3.0g mgso4·
7h2o、0.5g mnso4·
h2o、1.0g nacl、0.1g feso4·
7h2o、0.1g cocl2·
6h2o、0.1g cacl2、0.1g znso4·
7h2o、0.01g cuso4·
5h2o、0.1g akl(so4)2·
12h2o、0.01g h3bo3和0.01g na2moo4·
2h2o组成)中，对三电极微生物电化学系统施加电势-300mv，在该电势以及30℃下驯化1天，使耐铬驯化后的导电网络复合膜通过电势反转(-150mv)变成生物阴极(pda@s.oneidensis mr-1(2))，然后通过电化学表征生物膜的状态。
51.通过图5为聚多巴胺包覆希瓦氏菌构成的生物阴极扫描电镜图，可以得知，电势反转后，碳毡电极上附着一层致密的生物膜，并保持较好的生物活性。
52.实施例4
53.cr(vi)的固定矿化的过程研究：以实施例2中经过耐铬驯化的生物膜作为电子供体，参考实施例3的过程，区别仅在于：生物阴极在调控电子介导过程(电流导通)中，即在施加不同恒电位(-500mv，-300mv，-150mv，0mv，200mv)下，测定铬还原和固定效率；利用导电网络复合膜上的微生物表面有机官能团以及电子中介体等无机相的协同作用，实现cr(vi)到氧化铬矿的转变。
54.通过图6为生物阴极对cr(vi)的去除率结果分析，可以得知，聚多巴胺表面及内部修饰希瓦氏菌(pda@s.oneidensis mr-1(2))构建的生物阴极对cr(vi)的去除率在24小时内达到了90％以上，远远优于未修饰的希瓦氏菌生物阴极。在生物阴极阶段，聚多巴胺表面及内部修饰包不仅可以促进导电菌胞内的电子传递，而且也可促进导电菌与固体电极的电子传输，同时减少铬盐对导电菌的毒害作用。
55.进一步通过图7对生物阴极上的铬还原产物的xps图结果分析，可以得知，生物阴极与cr(vi)反应72h后，在576.6和586.8ev附近出现新的峰，这些峰对应于cr 2p3/2和cr 2p1/2的特征峰。在576.6(cr 2p3/2，cr2o3)和586.8ev处的结合能属于cr(iii)，而在581.9ev处的结合能对应于cr2o
72-。同时检测到cr(vi)和cr(iii)两个价态，表明生物阴极的氧化还原和吸附作用。
56.对比例1
57.本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于，在常温下加入在体系中浓度为2mg/ml的多巴胺来进行功能化修饰希瓦氏菌的实验(即修饰反应的温度为常温)，通过希瓦氏菌包覆后的tem图2中的b可以得知，聚多巴胺纳米颗粒仅在细胞膜表面形成已成球状纳米颗粒。
58.对比例2
59.本对比例与实施例4基本相同，不同之处在于，本对比例在构建电子-生物膜/复合膜-cr(vi)的三元体系时，加入仅表面修饰的希瓦氏菌。表面修饰的希瓦氏菌构建的生物阴极(pda@s.oneidensis mr-1(1))对cr(vi)的去除率在24小时内达到30％以上，远远小于表面及内部修饰的希瓦氏菌(pda@s.oneidensis mr-1(2))。
60.由以上结果可知，本发明电子介导下聚多巴胺修饰希瓦氏菌可有效地处理低浓度
的铬废水，实现其中铬元素的固定矿化。
61.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。