一种采用阳离子交换层析法纯化双特异性抗体的方法与流程

1.本发明属于抗体纯化技术领域，尤其是涉及一种采用阳离子交换层析法纯化双特异性抗体的方法。


背景技术：

2.双特异性抗体(bsab，下文也称为双抗)是基因工程的重组抗体，由两个不同的结合域组成，能够结合两种不同的抗原或同一抗原的两个不同表位。与单克隆抗体一样，双特异性抗体已成为治疗各种疾病重要组成部分，其用于治疗的疾病包括但不限于癌症、自身免疫、传染病以及炎症等。双特异性抗体的作用机理，一方面，通过将一个或多个效应细胞传递到特定的靶细胞来实现免疫细胞重定位，另一方面，通过多个靶点的结合实现协同效应，阻断或激活两种不同的信号通路，在靶细胞和功能分子(细胞)之间建立一座桥梁，以刺激定向免疫反应。
3.自首款双抗药物removab于2009年获批上市以来，美国国家医学图书馆官方网站上共发表了180多项双特异性抗体的临床试验，而这十年间仅四款双抗药物获批上市，可见双抗成药性难度之高。究其原因，有以下三点：一是生产制备既耗时又昂贵，它需要适当、安全和稳定的细胞系生产工艺、纯化工艺和质量分析方法来获得所需的产品。二是制备生产过程的一系列问题，包括但不限于双抗的降解，聚集，变性，碎裂和氧化等。三是需要更多的临床试验来探索最佳的给药途径和最佳剂量。
4.目前，国内双抗项目迎难而上，已有80多款双抗药物处于临床阶段，超过40家国内药企参与布局，预计到2024年双抗药物的国内市场将达到50亿元规模。
5.在抗体纯化技术领域，双特异性抗体分为不对称双抗和对称双抗。不对称双抗，如果允许随机配对，出现错误配对的产品可能占总量的90％。为了解决这一问题，已有超过20个成熟的双抗设计平台，尽量减少错误配对，方便后续纯化工艺。对称双抗，也有更高的聚集倾向，在生产制备中会出现超过50％的聚集体的情况。达石药业(广东)有限公司设计的双抗为对称性双抗，亲和后纯度在85-91％之间。亲和纯化后续步骤为离子交换纯化，离子交换的动态载量(动态结合载量)跟流速相关，流速越大，填料能吸附的双抗量越少，动态载量越小。大部分阳离子介质填料的动态结合载量都不超过60mg/ml。而专利(cn104208719a，cn109336970a)，提出采用阳离子交换层析纯化过程中过载模式，能有效提高在单抗和抗体偶联小分子药物(adc)纯度，并且指出过载上样模式的工作原理为：在阳离子交换层析模式下，多聚体比二聚体与填料的结合能力更强，所以在持续上样过程中，多聚体会把二聚体的结合位点取代，直到柱子的完全被多聚体占据，使流穿出来的样品以二聚体为主。
6.综合以上信息，不管是在早期研究阶段还是生产阶段，对生产产品的均一性要求都需要高纯度的样品，双抗的纯化技术显得尤为重要。


技术实现要素：

7.本发明的技术目的是提供一种高效纯化双特异性抗体的方法。
8.一方面，本发明提供一种采用阳离子交换层析法纯化双特异性抗体的方法，所述方法包括：
9.采用过载倍数为动态结合载量的3-15倍的过载模式，在ph为4.0-7.0，电导率为3-17ms/cm的上样条件下将双特异性抗体溶液上样至阳离子交换层析柱，采用ph以及电导率分别与前述上样条件的ph以及电导率相同的平衡缓冲液平衡柱子，收集流穿液。
10.在具体实施方式中，所述双特异性抗体为对称性双特异性抗体，优选地，所述对称性双特异性抗体具有9％-10％的杂质含量，优选地，所述对称性双特异性抗体为抗her2/抗pd-l1双功能抗体。
11.在具体实施方式中，所述阳离子交换层析填料可选自：nanogel-50sp hp、monomix hc60-sp、capto s impact、poros xs和diamond sp mustang，其中，在15倍过载量情况下，nanogel-50sp hp的上样载量为300mg/ml；capto s impact的上样载量为600mg/ml；diamond sp mustang的上样载量为450mg/ml。
12.在具体实施方式中，所述平衡缓冲液可选自醋酸-醋酸钠缓冲体系、tris-hcl缓冲体系、磷酸盐缓冲体系和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系中的一种或多种。
13.在具体实施方式中，采用所述过载模式收集流穿液，上样结束后采用平衡缓冲液平衡柱子，收集流穿液直到紫外示数降低至200mau。
14.在具体实施方式中，所述上样条件的ph为4.2
±
0.2、电导率为16
±
1ms/cm。
15.在具体实施方式中，所述上样条件的ph为5.5
±
0.2、电导率为6
±
1ms/cm。
16.在具体实施方式中，所述上样条件的保留时间为0.5-4min。
17.在具体实施方式中，所述上样条件的保留时间为4min。
18.在具体实施方式中，在所述方法中，上样载量为300mg/ml，保留时间为4min，上样条件的ph为5.5，电导率为6ms/cm。
19.在具体实施方式中，经过所述方法纯化的双特异性抗体的纯度为97％以上，其活性与经过常规的protein a亲和层析、阴离子交换层析、阳离子交换层析三步层析纯化，纳滤和超滤后获得的参比品的抗原结合活性一致。
20.本发明的有益效果：
21.本发明的方法与传统的结合洗脱模式工艺相比，上样载量从60mg/ml提高到300mg/ml，纯度从91％提高到97％，回收率为79％，节约填料，节约工时。
22.另外，对于未来的开发用途，可以制作成前过滤装置，起去除聚体的作用，可以无需额外使用纯化设备，降低纯化使用门槛。
附图说明
23.图1：本技术实施例1中5种阳离子交换层析填料的动态载量热图。
24.a.nanogel 50sp hp动态载量热图。
25.b.monomix hc60-sp动态载量热图。
26.c.capto s impact动态载量热图。
27.d.poros xs动态载量热图。
28.e.diamond sp-mustang动态载量热图。
29.图2：本技术实施例2中3款阳离子交换层析柱保留时间测试。
30.图3：本技术实施例5中阳离子交换层析上样过载层析图与对应的组分纯度。
31.图4：本技术测试实施例1中抗原结合活性测试的结果。
具体实施方式
32.术语：
33.在本技术中，术语“双抗”、“bsab”可与“双特异性抗体”、“双特异抗体”互换使用。
34.在本技术中，术语“流穿”可与“穿透”互换使用。
35.在本技术中，术语“纯度”可与“sec纯度(尺寸排阻色谱纯度)”、“二聚体含量”互换使用。
36.在本技术中，术语“层析填料”可与“层析介质”互换使用。
37.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明以使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，然而本发明的范围不受实施例的限制。
38.以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
39.制备实施例
40.实施例1. 5款阳离子交换层析填料的动态载量测试
41.使用unicron 7.3软件对5款阳离子交换层析填料，分别为：nanogel-50sp hp、monomix hc60-sp、capto s impact、poros xs、diamond sp mustang，柱体积均为1ml，保留时间4min，进行doe设计。设计因子为：ph和cond。每个因子分别设置3个水平，分别为ph＝3，5.5，7，cond＝3，10，17ms/cm。
42.待纯化样品为达石药业(广东)有限公司制备的抗her2/抗pd-l1双功能抗体262-2#(参见cn113943371a，其全文内容通过引用并入本文，该262-2#双功能抗体的轻链氨基酸序列为seq id no.:1,重链氨基酸序列为seq id no.:2)，其来自cho细胞表达，经protein a亲和层析捕获，ph孵育灭活病毒，经0.22μm过滤膜过滤得到无菌样品，浓度为16mg/ml，ph＝4.3，cond＝4.6ms/cm，sec纯度为91.21％，聚体含量为8.79％。
43.溶液配制参考专利(cn109096363a)配制第一缓冲液(30mm磷酸二氢钠和30mm柠檬酸)和第二缓冲液(30mm磷酸氢二钠和15mm柠檬酸三钠)，添加nacl将cond调整到相应的3，10，17ms/cm。最终获得5种不同ph，不同cond的平衡液。分别为：
44.平衡a1液，cond＝10ms/cm,ph＝5.5，
45.平衡a2液，cond＝17ms/cm,ph＝7，
46.平衡a3液，cond＝17ms/cm,ph＝4，
47.平衡a4液，cond＝3ms/cm,ph＝7，
48.平衡a5液，cond＝3ms/cm,ph＝4，
49.同样地，将样品也调整到5种不同ph和不同cond。
50.样品s1液，cond＝10ms/cm,ph＝5.5，
51.样品s2液，cond＝17ms/cm,ph＝7，
52.样品s3液，cond＝17ms/cm,ph＝4，
53.样品s4液，cond＝3ms/cm,ph＝7，
54.样品s5液，cond＝3ms/cm,ph＝4，
55.根据设定参数，当样品通过柱子uv》50mau时(5％穿透)，为其动态结合载量载量。最后用1m nacl洗脱柱子吸附的蛋白，用1m naoh对柱子进行清洁，用0.1m naoh进行柱子保存。
56.根据图1a，1b，1c，1d，1e的结果，优化出5种阳离子交换层析填料的上样条件为ph＝4.2，cond＝16.0ms/cm，五种填料的动态结合载量值在最大值的70％以上。故在下文中，按ph＝4.2，cond＝16.0ms/cm条件，选取3种填料(monomix hc60-sp，diamond sp mustang，capto s impact)进行不同保留时间的动态结合载量测试。
57.实施例2. 3种填料不同保留时间的动态结合载量测试
58.操作步骤、样品与实施例1一致。
59.不同之处：3款阳离子交换层析填料，分别为：monomix hc60-sp、capto s impact、diamond sp mustang，保留时间1，2，4min。平衡液使用50mm醋酸-醋酸钠加氯化钠缓冲液体系(ph＝4.2，cond＝16ms/cm)。据设定参数，当样品通过柱子uv》50mau时(5％穿透)，为其动态结合载量载量，结果见下表1和图2。
60.表1三款填料动态结合载量预测值与测得值(保留时间4min)
61.填料名称预测值mg/ml测得值mg/ml预测/测定值monomix hc60-sp42.6159.5671.54％capto s impact88.5995.4192.85％diamond sp-mustang64.0877.5082.68％
62.根据表1结果，实际测定值与软件预测值相差不大，说明doe模型符合拟合要求。从图2的结果来看，动态结合载量与保留时间成正比。选择保留时间为1min，上样量为15倍动态结合载量，继续优化阳离子上样过载的条件。
63.实施例3. 3款阳离子交换层析填料不同上样量纯度测试
64.根据实施例2的结果，操作步骤、样品与实施例2一致。
65.不同之处：保留时间为1min，上样量为15倍动态结合载量，测试3款阳离子交换层析填料在相同ph、cond和保留时间下，不同过载量的纯度，结果见下表2。
66.表2 3款阳离子交换层析填料不同过载量倍数的纯度
67.sec纯度％monomix hc60-spdiamond sp mustangcapto s impactload91.1891.1891.183x动态结合载量96.3896.2196.096x动态结合载量95.3494.894.919x动态结合载量94.6594.1294.3712x动态结合载量94.3793.7694.115x动态结合载量94.6994.5694.47elute86.3281.3986.97回收率100.88％101.33％96.32％
68.表2结果表明，在保留时间1min，15倍动态结合载量的上样载量情况下，monomix hc60-sp为300mg/ml，capto s impact为600mg/ml，diamond sp mustang为450mg/ml，sec纯度大于94％，说明过载上样获得的样品纯度比上样前的纯度高，下文进一步优化更好的上样条件。
69.实施例4.doe设计优化阳离子交换层析过载上样条件
70.根据实施例3的结果，操作步骤、样品与实施例3一致。
71.不同之处：阳离子层析填料为monomix hc60-sp，ph＝5.5，doe设计2个因子，每个因子3个水平，分别是：保留时间为0.5，1，2，min，cond＝3，6，9ms/cm，响应值为动态结合载量和sec，测试优化过载的上样条件，结果如下表3所示。
72.表3 doe设计优化阳离子交换层析过载上样条件
[0073][0074]
从上表3看出，电导对过载的上样条件影响较小，流速越小，保留时间越长，上样过载后样品的纯度越高。选择ph＝5.5，cond＝6ms/cm，作为最优上样条件。
[0075]
实施例5.阳离子交换层析过载上样后纯度测试
[0076]
根据实施例4的结果，操作步骤、样品与实施例4一致。
[0077]
不同之处：保留时间为4min，ph＝5.5，cond＝6ms/cm，上样载量300mg/ml，测试过载上样后样品的质量。
[0078]
结果见图3，结果显示在300mg/ml的载量下使用穿透模式，纯度明显提高，对于需要大量纯度大于97％的样品，该条件下合并得到的样品计算纯度为97.31％，满足要求。对于需要制备小量纯度大于99％的样品，收集的条件满足要求。
[0079]
测试实施例1.抗原结合活性测试
[0080]
(1)包被抗原1：取抗原1(重组人pd-l1蛋白)用1
×
pbs溶液稀释，浓度为1μg/ml，包被96孔板，50μl/well，4℃孵育过夜。
[0081]
(2)封闭：0.1％pbst洗板3次，每孔加200μl 5％新鲜配置脱脂奶粉，室温孵育1h。
[0082]
(3)样品稀释：使用实施例5中优化条件下制备的样品和使用常规三步层析纯化，纳滤和超滤后获得的参比品配置第一个使用浓度为2μg/ml，之后使用1％bsa依次3倍梯度稀释10个浓度梯度。
[0083]
(4)加入样品：0.1％pbst洗板3次，将各浓度的样品加入96孔板，每孔50μl，每个样品3个复孔，室温孵育1h。
[0084]
(5)加入抗原2：0.1％pbst洗板3次，将抗原2(生物素化重组人her2蛋白)，浓度为2μg/ml加入96孔板，每孔50μl，每个样品3个复孔，室温孵育1h。
[0085]
(6)加入酶标抗体：1％pbst洗板3次，每孔加入50μl预先配制好酶标抗体工作液，室温孵育1h。
[0086]
(7)显色：0.1％pbst洗板3次，用多道移液器向每孔加入100μl tmb显色液，室温避光孵育10min后加入100μl终止液。
[0087]
(8)数据采集：打开酶标仪，待仪器自检结束，设定检测波长为450nm，读数。使用graphpad prism 7进行数据分析。
[0088]
结果见图4，经证实过载模式收集的样品与参比品的抗原结合活性一致。