技术特征：
1.一种膜联蛋白v与血管生成抑制剂融合蛋白，其特征在于：所述的膜联蛋白v(annexinv)的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述的血管生成抑制剂包括但不限于具有血管生成抑制活性的interferonsα/β、angiostatin、endostatin、vasostatin、canstatin、tumstatin、platelet factor-4、thrombospodin-1、il-12、16kd prolactin片段、il-18、ip-10或53kd antithrombin iii。2.根据权利要求1所述的膜联蛋白v与血管生成抑制剂融合蛋白，其特征在于：所述的血管生成抑制剂为内皮抑素(endostatin)，所述的内皮抑素endostatin的氨基酸序列如seq id no:2所示。3.根据权利要求1所述的膜联蛋白v与血管生成抑制剂融合蛋白，其特征在于：所述的膜联蛋白v与血管生成抑制剂融合蛋白具有如下氨基酸序列：(1)由seq id no.3或seq id no.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或(2)与序列seq id no.3或seq id no.4限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或(3)seq id no.3或seq id no.4所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。4.一种核酸分子，其编码权利要求1至3所述的膜联蛋白v与血管生成抑制剂融合蛋白。5.权利要求1所述的膜联蛋白v与血管生成抑制剂融合蛋白的构建方法，其特征在于包括以下步骤：(1)设计膜联蛋白v与内皮抑素融合蛋白结构；(2)构建包含膜联蛋白v与内皮抑素融合蛋白基因的质粒；(3)获得膜联蛋白v与内皮抑素融合蛋白可溶性表达的表达菌株；(4)表达和纯化可溶性的膜联蛋白v与内皮抑素融合蛋白。6.根据权利要求5所述的膜联蛋白v与内皮抑素融合蛋白的构建方法，其特征在于：在步骤(1)中，设计膜联蛋白v与内皮抑素融合蛋白；在步骤(2)中，构建融合蛋白的表达菌株，采用pet28a载体，膜联蛋白v与内皮抑素蛋白之间插入8个氨基酸残基来连接，设计并购买引物后，进行pcr，采用酶primer star，退火温度设为tm值-5℃；回收得的片段同载体酶切，室温过夜酶连，制得pet28a-annexinv-endostatin重组质粒；在步骤(3)中，转化top10感受态菌株后涂布平板，挑单克隆存样送测序公司测序，检验是否成功构建，提取质粒转化到大肠杆菌表达菌株bl21(de3)中；在步骤(4)中，表达并纯化蛋白：iptg诱导表达目的融合蛋白，sds-page检验样品分子量，确定目的蛋白；通过亲和层析初步纯化目的融合蛋白，再用阴离子交换层析进一步纯化制得目的膜联蛋白v与内皮抑素融合蛋白，得到的纯化蛋白可进行活性检验。7.根据权利要求6所述的膜联蛋白v与内皮抑素融合蛋白的构建方法，其特征在于：在步骤(1)中，设计与膜联蛋白v融合的蛋白具有类似endostatin的血管生成抑制剂的效应；在步骤(2)中，采用pet28a载体，annexinv与类似endostatin的血管生成抑制剂蛋白之间插入8个甘氨酸残基来连接。设计引物后，通过pcr扩增；以bamhi-xhoi为酶切位点，通过双酶切，t4 dna连接酶连接的方法整合到载体pet-28a质粒中；在步骤(3)中，通过cacl2方法制备感受态大肠杆菌bl21(de3)，将含有目的基因的质粒转化到大肠杆菌表达菌株bl21(de3)中；将冻存的重组表达质粒保种菌株接入含有50mg/l
卡那霉素的3ml液体lb培养基中，37℃震荡培养过夜；将活化后的菌液接种到含有相同浓度卡那霉素的3ml液体lb培养基中，37℃培养12h；次日，将过夜菌接种到500ml，含有50mg/l卡那霉素的液体lb培养基中，37℃震荡培养3～4h，至od600值达到0.6时，向培养液中加入iptg，20℃诱导表达16～20h；在步骤(4)中，通过sds-page检验是否得到目的蛋白。8.根据权利要求6所述的膜联蛋白v与内皮抑素融合蛋白的构建方法，其特征在于：在步骤(3)中，通过超声破碎菌体；将培养液转移到离心管中，4℃、6000r/min离心15min，用预冷的hepes-nacl缓冲液洗涤菌体，6000r/min再次离心15min，收集菌体；菌体重悬于40ml ni结合缓冲液中，进行超声波破碎，确保超声在低温条件下进行，防止蛋白变性，超声波破碎参数设置为3s间隔8s，净超声时间20min，直至菌液澄清为止；超声完毕后，4℃下12000r/min离心10min，取上清，备用；在步骤(4)中，由于融合蛋白以可溶性形式表达，采用亲和层析初步纯化蛋白；以ni琼脂糖凝胶介质，进行层析；ni洗脱液中缓慢加入20％～30％硫酸铵固体，并不断搅拌；然后，将溶液放置在磁力搅拌器上，4℃过夜，使目的蛋白充分沉淀；次日，4℃、12000r/min离心30min，收集沉淀，沉淀用hepes-nacl缓冲液重悬溶解，纯化得到蛋白纯度大于95％。9.根据权利要求1所述一种膜联蛋白v与血管生成抑制剂融合蛋白，其特征在于：融合蛋白具有比膜联蛋白v与血管生成抑制剂联合应用更强的抑制血管内皮细胞的活性，融合蛋白中膜联蛋白v与血管生成抑制剂的顺序不影响融合蛋白的表达、纯化和活性。10.权利要求5至9任一项所述的膜联蛋白v与血管生成抑制剂融合蛋白在筛选和开发相关药物中的应用。
技术总结
本发明公开了一种膜联蛋白V与血管生成抑制剂融合蛋白的构建方法和应用，本发明的构建方法，包括如下步骤：(1)设计膜联蛋白V(AnnexinV)与血管生成抑制剂内皮抑素(endostatin)融合蛋白结构；(2)构建包含膜联蛋白V与血管生成抑制剂内皮抑素融合蛋白基因的质粒；(3)获得膜联蛋白V与内皮抑素融合蛋白可溶性表达的表达菌株；(4)表达和纯化膜联蛋白V与内皮抑素融合蛋白。本发明利用膜联蛋白V对肿瘤血管导向性，可以设计膜联蛋白V与血管生成抑制剂蛋白质分子的融合蛋白，具有显著的协同效果。协同效果。协同效果。
技术研发人员：华子春 霍利娜
受保护的技术使用者：江苏靶标生物医药研究所有限公司
技术研发日：2022.04.26
技术公布日：2022/11/24