一种产高品质还原糖的工程菌株、构建方法及其应用与流程

1.本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种产高品质还原糖的工程菌株、构建方法及其应用。


背景技术：

2.嗜热纤维梭菌是目前自然界中已知的降解纤维素最高效的微生物之一，分泌的纤维小体具有极强的纤维素降解能力。纤维小体降解纤维素的能力大约是木霉属的50倍，这种高效性取决于纤维小体的特殊结构。热纤梭菌本身是一种严格厌氧的嗜热微生物，特殊的生长条件，使得分泌的木质纤维素水解酶具有较好的耐热性、杂菌污染的风险极小。
3.在热纤梭菌的木质纤维素水解应用中，由于热纤梭菌本身复杂的代谢通路，分泌纤维小体的同时会伴有乙酸、乳酸等代谢副产物，这些副产物对微生物的生长有明显的抑制作用，在使用热纤梭菌水解木质纤维素时，会带入到水解液中，降低木质纤维素水解产物—还原糖的品质，不适用于后期培养高价值微生物。
4.现有技术中，热纤梭菌利用木质纤维素主要涉及以下几个方面：1）热纤梭菌直接利用木质纤维素生产氢气、乙醇等，如发明专利cn111394394a； 2）热纤梭菌及其与其他厌氧菌株通过木质纤维素糖化技术联产生物产品，如发明专利cn108893501a、cn111349565a等。发明专利cn108866025a公开了一种纤维素酶制剂及其应用，获得的还原糖产量为90-500 mm，是用于微生物培养的优质碳源；然而该糖化液中除了可发酵糖外，还有高达4 g/l的乙酸和5 g/l的乙醇，过高的乙酸和乙醇不利于微生物的生长，如小球藻、红法夫酵母等。目前，在已有研究中，未见对热纤梭菌代谢副产物及其相关代谢通路改造的研究。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种产高品质还原糖的工程菌株、构建方法及其应用，针对现有技术中热纤梭菌厌氧发酵时代谢副产物的分泌，提供了一种经基因改造的热纤梭菌，可以有效降低代谢副产物的产生，大大提高水解液产品的品质。
6.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种产高品质还原糖的工程菌株，其特征在于：所述工程菌株为热纤梭菌经过基因改造，敲除l-乳酸脱氢酶基因（ldh）、磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因（pta-ack）工程菌株。
7.所述热纤梭菌为野生型热纤梭菌，优选为热纤梭菌（clostridium thermocellum）pn2102，保藏日期为2021年07月09日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为cgmcc no.22869。
8.优选的，所述敲除的l-乳酸脱氢酶基因ldh的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述敲除的磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因（pta-ack）的核苷酸序列如seq id no.3所示。
9.本发明还提供了上述高品质还原糖的工程菌株的构建方法，通过同源重组敲除热纤梭菌基因组上的l-乳酸脱氢酶基因（ldh）和磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因（pta-ack），
得到工程菌株。
10.所述l-乳酸脱氢酶基因ldh的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因（pta-ack）的核苷酸序列如seq id no.3所示。
11.上述构建方法具体包括如下步骤：（1）以野生型热纤梭菌为出发菌株，构建ldh基因敲除的重组质粒puc-ldh；（2）将重组质粒puc-ldh转入热纤梭菌，构建l-乳酸脱氢酶基因ldh缺失的热纤梭菌工程菌；（3）构建pta-ack基因敲除的重组质粒puc-pta-ack；（4）将重组质粒puc-pta-ack转入ldh缺失的热纤梭菌工程菌，构建l-乳酸脱氢酶基因ldh、磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因（pta-ack）缺失的热纤梭菌工程菌。
12.使用热纤梭菌pn2102为出发菌株时，上述构建方法具体包括如下步骤：（1）以热纤梭菌pn2102为出发菌株，构建ldh基因敲除的重组质粒puc-ldh；（2）构建热纤梭菌l-乳酸脱氢酶基因ldh缺失工程菌pn2102/δldh；（3）构建ptaack基因敲除的重组质粒puc-pta-ack；（4）构建ldh基因、磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因（pta-ack）缺失的热纤梭菌工程菌pn2102/δldhδptaack。
13.优选的，步骤（1）重组质粒puc-ldh的构建过程为：1）以ppn01为模板质粒，在启动子p-gapd前段插入l-乳酸脱氢酶上游和下游基因重组片段，在hpt基因后端插入l-乳酸脱氢酶中游基因重组片段；2）模板质粒ppn01的线性化；3）将上、中、下游基因重组片段与线性化后的模板质粒ppn01用gibson assembly连接，转入bl21，并做pcr筛选确认；4）对dna载体片段回收。
14.进一步优选的，用于基因删除质粒构建的l-乳酸脱氢酶基因的上、中、下游基因重组片段由下面三对引物加上20-25 bp模板质粒首尾连接片段经pcr获得：上游引物1：tcttcctctgtcctggct；上游引物2：tgcaccaactacggttactttt；中游引物1：aaaaagccgacggagaag；中游引物2：ataccgtttacacccacga；下游引物1：agtccggaaacactctaaaa；下游引物2：gtataaagcccatgcctg。
15.优选的，步骤（2）中，利用电转化将质粒puc-ldh转入热纤梭菌pn2102中，经过同源重组和抗性筛选将目的基因序列在基因组上删除，挑选及验证阳性单克隆，得到热纤梭菌l-乳酸脱氢酶基因ldh缺失工程菌pn2102/δldh。
16.进一步优选的，用于基因删除质粒构建的磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因pta-ack的上、中、下游基因重组片段由下面三对引物加上20-25 bp模板质粒首尾连接片段经pcr获得：上游引物1：ggcagaccttcggttaaaa；上游引物2：cgtctgatttcgcccttt；中游引物1：aagccgcatccatgatag；中游引物2：ttcaaaaactcactcccgtc；下游引物1：cccgatgcgaaagtaaag；下游引物2：cgtcaccatacaacaaacc。
17.优选的，步骤（3）重组质粒puc-pta-ack的构建过程为：1）以ppn01为模板质粒，在
启动子p-gapd前段插入pta-ack上游和下游基因重组片段，在hpt基因后端插入pta-ack中游基因重组片段；2）模板质粒ppn01的线性化；3）将上、中、下游基因重组片段与线性化后的质粒模板ppn01用gibson assembly连接，转入bl21，并做pcr筛选确认；4）对dna载体片段回收。
18.优选的，步骤（4）中，利用电转化将质粒puc-pta-ack转入热纤梭菌pn2102/δldh工程菌中，经过同源重组和抗性筛选将目的基因pta-ack序列在基因组上删除，挑选及验证阳性单克隆，得到热纤梭菌工程菌pn2102/δldhδptaack。
19.本发明还提供了上述产高品质还原糖的工程菌株在纤维高效水解中的应用，用热纤梭菌工程菌的发酵液复配纤维素酶对秸秆纤维进行水解，每克秸秆纤维加入发酵液10-40 ml，每克秸秆纤维加入木聚糖酶3-6 mg，得到的水解产物分离浓缩后得到高品质还原糖产物。
20.本发明的产高品质还原糖的工程菌株在纤维高效水解中的应用包括如下步骤：（1）木质纤维素的预处理：以常见农业秸秆为原料，通过物理或化学法进行预处理，脱除木质素并提取秸秆纤维；（2）热纤梭菌工程菌的厌氧发酵：热纤梭菌工程菌依次进行种子培养、厌氧发酵，得到发酵液；（3）纤维水解：将步骤（2）得到的发酵液复配纤维素酶对步骤（1）得到的秸秆纤维进行水解，得到水解产物；（4）纤维水解液的分离浓缩：将步骤（3）得到的水解产物进行固液分离，收集的水解液进行浓缩，得到还原糖产物。
21.优选的，步骤（1）中，所述木质纤维素的预处理包括步骤：将洗净切碎的水稻秸秆原料与碱性物质（无机碱）进行水热反应，充分脱除木质素后提取秸秆纤维，之后脱水并充分洗去残留碱液，得到秸秆纤维；其中，所述碱性物质包括氢氧化钠与亚硫酸钠，所述氢氧化钠的重量和所述水稻秸秆原料绝干重的比值为1：（4-6），所述亚硫酸钠和所述氢氧化钠的重量比为1：（3-5），所述水热反应的温度为150-160℃，所述水热反应的时间为1-3 h。
22.优选的，所述步骤（2）中，热纤梭菌工程菌的种子培养和厌氧发酵过程为：将-80℃保藏的热纤梭菌菌种置于4℃冰箱解冻，无菌条件下吸取注入种子培养基中，接种量为2.5 %（v/v），在50-65℃、150-200 rpm条件下培养16-24 h得到热纤梭菌种子液；将热纤梭菌种子液以5 %-10 %（v/v）的接种量接入发酵培养基中，在50-65℃、150-200 rpm条件下培养16-24 h，得到发酵液。
23.其中，所述种子培养基或所述发酵培养基的组分包括体积比为40：2：1：1：1的a液、b液、c液、d液和e液；所述a液包括5.00-10.00 g/l微晶纤维素或秸秆纤维、10.00 g/l 3-吗啉丙磺酸；所述b液包括50.00 g/l柠檬酸三钾、31.25 g/l一水合柠檬酸、25.00 g/l na2so4、25.00 g/l kh2po4、62.50 g/l nahco3；所述c液包括250.00 g/l尿素；所述d液包括50.00 g/l mgcl2·
6h2o、10.00 g/l cacl2·
2h2o、5.00 g/l fecl2·
4h2o、50.00 g/l半胱氨酸盐；所述e液包括1.00 g/l吡哆胺二盐酸盐、0.20 g/l对氨基苯甲酸、0.10 g/l生物素、0.10 g/l vb
12
；优选的，所述秸秆纤维为步骤（1）得到的秸秆纤维。
24.优选的，步骤（3）中，纤维水解的具体步骤为：将步骤（1）的秸秆纤维浸泡在ph值为4.5-5.5缓冲液中，加入步骤（2）的发酵液和木聚糖酶进行水解；其中：固液比为1：（10-30），温度为45-55℃，水解时间为12-48 h，振荡速率为150-250 r/min，单位质量秸秆纤维（即每克秸秆纤维）加入的上述热纤梭菌发酵液为10-40 ml，单位质量秸秆纤维（即每克秸秆纤维）加入的木聚糖酶为3-6 mg。
25.本发明的有益效果为：本发提供了的热纤梭菌工程菌，经过对热纤梭菌pn2102代谢改造，敲除了乳酸脱氢酶、磷酸乙酰转移酶基因和乙酸激酶基因，得到热纤梭菌工程菌，该工程菌株在发酵及水解过程中不会产生乳酸和乙酸，可以高效应用在木质纤维素的水解中，避免了难去除的发酵抑制物，提高水解液产品的品质，浓缩后水解液中的葡萄糖与木糖浓度为浓缩前的6.0倍和6.1倍。
附图说明
26.图1为敲除l-乳酸脱氢酶基因的重组质粒puc-ldh图谱；图2为敲除磷酸乙酰转移酶和乙酸激酶基因的重组质粒puc-pta-ack图谱；图3为实施例1敲除乳酸脱氢酶基因的dna删除验证胶图，野生型菌株pcr得到dna片段为2777 bp，乳酸脱氢酶敲除后的菌株pcr得到dna片段为1915 bp；图4为实施例2敲除磷酸乙酰转移酶和乙酸激酶基因的dna 删除验证胶图，野生型菌株pcr得到dna片段为4017 bp，磷酸乙酰转移酶和乙酸激酶敲除后的菌株pcr得到dna片段为1834 bp；图5为ppn01模板质粒图谱。
具体实施方式
27.为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明作进一步地详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
28.本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecular cloning: a laboratory manual, 3nd ed. (sambrook, 2001)和currentprotocols in molecular biology (ausubel, 2003) 中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。
29.本发明提供了一种产高品质还原糖的工程菌株，所述工程菌株为热纤梭菌经过基因改造，敲除l-乳酸脱氢酶基因（ldh）、磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因（pta-ack）的工程菌株。
30.所述热纤梭菌为野生型热纤梭菌，野生型热纤梭菌分离自牛粪，是一种嗜热、严格厌氧的革兰氏阳性细菌，生长温度在50-65℃，生长速度快。优选为热纤梭菌（clostridium thermocellum）pn2102，保藏日期为2021年07月09日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为cgmcc no.22869。热纤梭菌（clostridium thermocellum）pn2102的核苷酸序列如seq id no.1所示。
31.优选的，所述敲除的l-乳酸脱氢酶基因ldh的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述敲除的磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶pta-ack的核苷酸序列如seq id no.3所示。
32.本发明还提供了上述高品质还原糖的工程菌株的构建方法，通过同源重组敲除热纤梭菌基因组上的l-乳酸脱氢酶基因（ldh）和磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因（pta-ack），
得到工程菌株。
33.所述l-乳酸脱氢酶基因ldh的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因（pta-ack）的核苷酸序列如seq id no.3所示。
34.以热纤梭菌pn2102为出发菌株，上述构建方法具体包括如下步骤：（1）构建ldh基因敲除的重组质粒puc-ldh；（2）构建热纤梭菌l-乳酸脱氢酶基因ldh缺失工程菌pn2102/δldh；（3）构建pta-ack基因敲除的重组质粒puc-pta-ack；（4）构建热纤梭菌磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因（pta-ack）缺失工程菌pn2102/δldhδpta-ack。
35.本发明还提供了上述产高品质还原糖的工程菌株在纤维高效水解中的应用，用热纤梭菌工程菌的发酵液复配纤维素酶对秸秆纤维进行水解，得到的水解产物分离浓缩后得到高品质还原糖产物（木糖和葡萄糖）。包括步骤：（1）木质纤维素的预处理；（2）热纤梭菌工程菌的厌氧发酵；（3）将步骤（2）得到的发酵液复配纤维素酶对步骤（1）得到的秸秆纤维进行水解；（4）对纤维水解液分离浓缩，得到还原糖产物。
36.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。需要注意的是，除非另有说明，本技术使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
37.本发明使用的培养基为：ctfud培养基（g/l）：3.00 二水柠檬酸钠、1.30 (nh4)2so4、1.50 kh2po4、0.13 cacl2•
2h2o、0.5 l-半胱氨酸盐酸盐、11.56 mops-na、2.60 mgcl2•
6h2o、0.001 feso4•
7h2o、5.00 avicel ph 105、4.50 ye，若配制固体培养基则加入10 g/l琼脂。实施例所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
38.本发明的热纤梭菌为热纤梭菌（clostridium thermocellum）pn2102，保藏日期为2021年07月09日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为cgmcc no.22869。具有如seq id no.1所示的16s rdna序列。
[0039] l-乳酸脱氢酶基因（ldh）和磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因（pta-ack）序列来源于热纤梭菌，从文献中（application of long sequence reads to upgrade genomes for clostridium thermocellum ad2, clostridium thermocellum lqri, and pelosinus fermentans r7）获得热纤梭菌的l-乳酸脱氢酶基因（ldh）和磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因（pta-ack）序列，genbank号为genbank: cp016502.1，通过南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0040]
实施例1 热纤梭菌l-乳酸脱氢酶基因ldh缺失工程菌pn2102/δldh的构建构建l-乳酸脱氢酶基因敲除重组质粒puc-ldh，利用电转化将重组质粒转入热纤梭菌pn2102。敲除的l-乳酸脱氢酶基因ldh的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0041]
构建重组质粒的表达载体为ppn01模板质粒（如图5），可由市售购买或由基因设计公司合成后实验室保存。模板质粒包含gapdh启动子、甲砜霉素抗性基因、hpt基因、puc19起始区、tdk基因、复制蛋白和氨苄抗性基因。（1）l-乳酸脱氢酶基因敲除重组质粒puc-ldh的设计及构建a.pcr扩增目的基因
以ppn01为模板质粒，在启动子p-gapd前段插入l-乳酸脱氢酶上游和下游基因重组片段，在hpt基因后端插入l-乳酸脱氢酶中游基因重组片段。用于基因删除质粒构建的l-乳酸脱氢酶基因的上、中、下游基因重组片段由下面三对引物加上20-25 bp模板质粒首尾连接片段经pcr获得。
[0042]
pcr反应体系为：上、中、下游引物1用量各 0.4
ꢀµ
l，引物2 用量0.4
ꢀµ
l，菌液或质粒用量1
ꢀµ
l，prime star 用量5
ꢀµ
l (效率10s/kb)，无菌水用量3.2
ꢀµ
l，其中各引物浓度分别为10 μm。
[0043]
pcr反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s到2 min 30 s，循环数30；72℃再延伸2 min，12℃保温20 min。
[0044]
b.模板质粒ppn01的线性化及载体片段回收：将ppn01模板质粒线性化，使用的引物及pcr条件如下：引物1：cttactctagcagacttggcaatg，引物2：tccatctgtttcgtttgccctttcc。
[0045]
pcr反应体系为：引物1用量 0.4
ꢀµ
l，引物2 用量0.4
ꢀµ
l，菌液或质粒用量1
ꢀµ
l，prime star 用量5
ꢀµ
l (效率10 s/kb)，无菌水用量3.2
ꢀµ
l。其中各引物浓度均为10 μm。
[0046]
pcr反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s到2 min 30 s，循环数30；72℃再延伸2 min，12℃保温20 min。
[0047]
将上、中、下游基因重组片段与线性化后的模板质粒ppn01用gibson assembly（三段重组片段各30 ng，线性化后的模板质粒ppn01 30 ng，gibson assembly 5
ꢀµ
l，无菌水补足至10
ꢀµ
l，50℃保温1 h）连接，然后转入bl21并在含氨苄的胶板上涂布，长出菌落后做pcr筛选确认。
[0048]
pcr筛选确认的引物及条件为：引物1：agcggtaaaagtgaagaac；引物2：tgggcccctactaaaatga。
[0049]
pcr反应体系为：引物1用量 0.4
ꢀµ
l，引物2 用量0.4
ꢀµ
l，菌液或质粒用量1
ꢀµ
l，prime star 用量5
ꢀµ
l (效率10 s/kb)，无菌水用量3.2
ꢀµ
l，其中各引物浓度分别为10 μm。pcr反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30s到2 min 30 s，循环数30；72℃再延伸2 min，12℃保温20 min。
[0050]
将pcr扩增之后的产物进行琼脂糖凝胶电泳实验（2%琼脂糖，110 v，30 min），阳性验证胶图条带大小为473 bp。说明重组质粒puc-ldh构建成功。图1为敲除l-乳酸脱氢酶基因的重组质粒puc-ldh图谱，其中ldh上游为967 bp，ldh下游为948 bp，ldh中游为727 bp。
[0051]
（2）重组质粒puc-ldh的转入
利用电转化将质粒ppn01ldh转入热纤梭菌pn2102中，经过同源重组和抗性筛选将目的基因序列在基因组上删除。其操作步骤如下：1）细胞生长将50ml的菌液培养至od600=0.6-1后，将其置于冰上放置20分钟。
[0052]
2）细胞收集与洗涤在6500 g、4℃条件下离心10分钟收集细胞，离心完成后小心倒掉上清液，再向离心管或离心瓶中小心加入洗涤缓冲液（经蒸汽灭菌过的反渗透纯化水），加的过程中不要搅动沉淀，然后再次在6500 g、4℃条件下离心10分钟，小心倒掉上清液，重复上述步骤两次。
[0053]
3）电转化将收集到的细胞放进厌氧室中，用100 μl 厌氧的洗涤缓冲液将其轻轻重悬。随后在标准的 1 mm 电转杯中，加入 20 μl 细胞悬液和1μg dna，充分混匀。设置电转条件为电压1500v、持续时间1.5 ms 进行电转化。
[0054]
4）孵育电转化细胞用1 ml ctfud培养基将电转后细胞重新混合，在51℃下孵育16小时。
[0055]
（3）阳性单克隆挑选及验证1）筛选转化细胞ctfud 固体培养基融化并冷却至55℃，将6 mg/ml 的甲砜霉素1 ml与50 μl 孵育后的电转化细胞加入到20 ml ctfud 固体培养基中倒入平板，室温下让平板中的培养基凝固30分钟，随后将平板放置在55℃下培养3-5天。
[0056]
2）挑选单克隆菌落，pcr验证重组质粒puc-ldh是否已经转入热纤梭菌感受态细胞。将pcr扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳实验（110 v，30 min），阳性验证胶图条带大小为473 bp。
[0057]
pcr验证引物及条件为：引物1：agcggtaaaagtgaagaac；引物2：tgggcccctactaaaatga。
[0058]
pcr反应体系为：引物1用量 0.4
ꢀµ
l，引物2 用量0.4
ꢀµ
l，菌液或质粒用量1
ꢀµ
l，prime star 用量5
ꢀµ
l (效率10s/kb)，无菌水用量3.2
ꢀµ
l，各引物浓度分别为10 μm。
[0059]
pcr反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s到2 min 30 s，循环数30；72℃再延伸2 min，12℃保温20 min，各引物浓度分别为10 μm。
[0060]
把经过验证的单克隆细胞菌落接入含有甲砜霉素（6 mg/ml）的ctfud液体培养基在55℃培养1-2天。
[0061]
3）取10 μl到1ml培养液加入到20 ml 含有甲砜霉素（6 mg/l）和fudr（10 mg/l）的ctfud固体培养基中倒入平板，室温下让平板中的培养基凝固30分钟，随后将平板放置在55℃下培养2-5天。
[0062]
4）挑选单克隆菌落，做pcr验证质粒puc-ldh中的ldh上游和ldh中游是否已重组到热纤梭菌基因组上。pcr验证的引物和条件如下：引物1：tcttcctctgtcctggct；引物2：gtataaagcccatgcctg。
[0063]
pcr反应体系为：引物1用量 0.4
ꢀµ
l，引物2 用量0.4
ꢀµ
l，菌液或质粒用量1
ꢀµ
l，
prime star 用量5
ꢀµ
l (效率10s/kb)，无菌水用量3.2
ꢀµ
l，各引物浓度分别为10 μm。
[0064]
pcr反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30s到2 min 30 s，循环数30；72℃再延伸2 min，12℃保温20 min。
[0065]
将pcr扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳实验（110 v，30 min），阳性验证胶图条带大小为5493 bp。
[0066]
把经过验证的单克隆细胞菌落加入到20 ml 含有8azh（500mg/l）的ctfud固体培养基中倒入平板，室温下让平板中的培养基凝固30分钟，随后将平板放置在55℃下培养2-5天。
[0067]
5）挑选单克隆菌落，做pcr验证重组质粒基因组上两个ldh下游是否已重组。把经过验证的单克隆细胞菌落加入5 ml培养基培养1-2天后保存。
[0068]
pcr验证的引物和条件如下：引物1：tcttcctctgtcctggct；引物2：gtataaagcccatgcctg。
[0069]
pcr反应体系为：引物1用量 0.4
ꢀµ
l，引物2 用量0.4
ꢀµ
l，菌液或质粒用量1
ꢀµ
l，prime star 用量5
ꢀµ
l (效率10s/kb)，无菌水用量3.2
ꢀµ
l，各引物浓度分别为10 μm。
[0070]
pcr反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s到2 min 30 s，循环数30；72℃再延伸2 min，12℃保温20 min。
[0071]
将pcr扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳实验（110 v，30 min），图3为敲除l-乳酸脱氢酶基因的dna删除验证胶图。如图3所示，野生型菌株热纤梭菌pn2101 pcr扩增得到dna片段为2777 bp，l-乳酸脱氢酶敲除后的菌株pcr得到dna片段为1915 bp，片段大小符合设计预期，证明热纤梭菌pn2102基因组上的ldh基因序列seq id no.2已被删除，得到热纤梭菌pn2102/δldh工程菌。
[0072]
实施例2 热纤梭菌磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因ptaack缺失工程菌pn2102/δldhδptaack的构建构建磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因ptaack敲除重组质粒puc-pta-ack，利用电转化将重组质粒转入热纤梭菌pn2102/δldh。敲除的磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因ptaack的核苷酸序列如seq id no.3所示。
[0073]
a.pcr扩增目的基因以ppn01为模板质粒，在启动子p-gapd前段插入ptaack上游和下游基因重组片段，在hpt基因后端插入ptaack中游基因重组片段。用于基因删除质粒构建的磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因pta-ack的上、中、下游基因重组片段由下面三对引物加上20-25 bp模板质粒首尾连接片段经pcr获得。
[0074]
pcr反应体系为：上、中、下游引物1用量各 0.4
ꢀµ
l，引物2 用量0.4
ꢀµ
l，菌液或质粒用量1
ꢀµ
l，prime star 用量5
ꢀµ
l (效率10 s/kb)，无菌水用量3.2
ꢀµ
l，各引物浓度分别为10 μm。
[0075]
pcr反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30s到2 min 30 s，循环数30；72℃再延伸2 min，12℃保温20 min。
[0076]
b.模板质粒ppn01的线性化、重组质粒的构建及载体片段的回收：将ppn01模板质粒线性化，使用的引物及pcr条件如下：引物1：cttactctagcagacttggcaatg，引物2：tccatctgtttcgtttgccctttcc。
[0077]
pcr反应体系为：引物1用量 0.4
ꢀµ
l，引物2 用量0.4
ꢀµ
l，菌液或质粒用量1
ꢀµ
l，prime star 用量5
ꢀµ
l (效率10 s/kb)，无菌水用量3.2
ꢀµ
l。其中各引物浓度均为10 μm。
[0078]
pcr反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s到2 min 30 s，循环数30；72℃再延伸2 min，12℃保温20 min。
[0079]
将上、中、下游基因重组片段与线性化后的质粒模板ppn01用gibson assembly（三段重组片段30 ng，线性化后的模板质粒ppn01 30 ng，gibson assembly 5
ꢀµ
l，无菌水补足至10
ꢀµ
l，50℃保温1 h）连接，然后转入bl21并在含氨苄的胶板上涂布，长出菌落后做pcr筛选确认。pcr引物及条件为：引物1：agcggtaaaagtgaagaac；引物2：tgggcccctactaaaatga。
[0080]
pcr反应体系为：引物1用量 0.4
ꢀµ
l，引物2 用量0.4
ꢀµ
l，菌液或质粒用量1
ꢀµ
l，prime star 用量5
ꢀµ
l (效率10s/kb)，无菌水用量3.2
ꢀµ
l，各引物浓度分别为10 μm。
[0081]
pcr反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30s到2 min 30 s，循环数30；72℃再延伸2 min，12℃保温20 min。
[0082]
将pcr扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳实验（110 v，30 min），阳性验证胶图条带大小为473 bp。说明重组质粒puc-pta-ack构建成功。
[0083]
图2为敲除磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因（pta-ack）的重组质粒puc-pta-ack图谱，其中ptaack上游为911bp，ptaack下游为923bp，ptaack中游为1028bp。
[0084]
（2）重组质粒puc-pta-ack的转入利用电转化将质粒ppn01ptaack转入热纤梭菌pn2102/δldh工程菌中，经过同源重组和抗性筛选将目的基因ptaack序列在基因组上删除。其操作步骤如下：1）细胞生长
将50 ml的菌液培养至od
600
为0.6-1后，将其置于冰上放置20分钟。
[0085]
2）细胞收集与洗涤在6500 g、4℃条件下离心10分钟收集细胞，离心完成后小心倒掉上清液，再向离心管或离心瓶中小心加入洗涤缓冲液（经蒸汽灭菌过的反渗透纯化水），加的过程中不要搅动沉淀，然后再次在6500 g、4℃条件下离心10分钟，小心倒掉上清液，重复上述步骤两次。
[0086]
3）电转化将收集到的细胞放进厌氧室中，用100μl 厌氧的洗涤缓冲液将其轻轻重悬。随后在标准的 1 mm 电转杯中，加入 20 μl 细胞悬液和1μg dna，充分混匀。设置电转条件为电压1500v、持续时间1.5 ms 进行电转化。
[0087]
4）孵育电转化细胞用1 ml ctfud培养基将电转后细胞重新混合，在51℃下孵育16小时。
[0088]
（3）阳性单克隆挑选及验证1）筛选转化细胞ctfud 固体培养基融化并冷却至55℃，将6 mg/ml 的甲砜霉素1ml与50 μl 孵育后的电转化细胞加入到20 ml 培养基中倒入平板，室温下让平板中的培养基凝固30分钟，随后将平板放置在55℃下培养3-5天。
[0089]
2）挑选单克隆菌落，做pcr验证质粒puc-pta-ack是否已经转入热纤梭菌pn2102/δldh工程菌细胞。pcr验证引物及条件为：引物1：agcggtaaaagtgaagaac；引物2：tgggcccctactaaaatga。
[0090]
pcr反应体系为：引物1用量 0.4
ꢀµ
l，引物2 用量0.4
ꢀµ
l，菌液或质粒用量1
ꢀµ
l，prime star 用量5
ꢀµ
l (效率10s/kb)，无菌水用量3.2
ꢀµ
l，各引物浓度分别为10 μm。
[0091]
pcr反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30s到2 min 30 s，循环数30；72℃再延伸2 min，12℃保温20 min。
[0092]
将pcr扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳实验（110 v，30 min），阳性验证胶图条带大小为473 bp。
[0093]
把经过验证的单克隆细胞菌落接入含有甲砜霉素（6 mg/ml）的ctfud液体培养基在55℃培养1-2天。
[0094]
3）取10 μl到1ml培养液加入到20 ml 含有甲砜霉素（6 mg/l）和fudr（10 mg/l）的ctfud固体培养基中倒入平板，室温下让平板中的培养基凝固30分钟，随后将平板放置在55℃下培养2-5天。
[0095]
4）挑选单克隆菌落，做pcr验证质粒puc-pta-ack中的pta-ack上游和pta-ack中游是否已重组到基因组上。pcr验证引物及条件为：基因敲除验证引物1：ggcagaccttcggttaaaa；基因敲除验证引物2：cgtcaccatacaacaaacc。
[0096]
pcr反应体系为：引物1用量 0.4
ꢀµ
l，引物2 用量0.4
ꢀµ
l，菌液或质粒用量1
ꢀµ
l，prime star 用量5
ꢀµ
l (效率10 s/kb)，无菌水用量3.2
ꢀµ
l，各引物浓度分别为10 μm。
[0097]
pcr反应程序为：98℃预变性2 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30s到2 min 30 s，循环数30；72℃再延伸2 min，12℃保温20 min。
[0098]
将pcr扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳实验（110v，30min），阳性验证胶图条带大小为6755bp。
[0099]
把经过验证的单克隆细胞菌落加入到20ml含有8azh（500mg/l）的ctfud固体培养基中倒入平板，室温下让平板中的培养基凝固30分钟，随后将平板放置在55℃下培养2-5天。
[0100]
9）挑选单克隆菌落，做pcr验证质粒puc-pta-ack基因组上两个pta-ack下游是否已重组。pcr验证引物及条件为：基因敲除验证引物1：ggcagaccttcggttaaaa；基因敲除验证引物2：cgtcaccatacaacaaacc。
[0101]
pcr反应体系为：引物1用量0.4
µ
l，引物2用量0.4
µ
l，菌液或质粒用量1
µ
l，primestar用量5
µ
l(效率10s/kb)，无菌水用量3.2
µ
l，各引物浓度分别为10μm。
[0102]
pcr反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s到2min30s，循环数30；72℃再延伸2min，12℃保温20min。
[0103]
将pcr扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳实验（110v，30min），图4为敲除磷酸乙酰转移酶和乙酸激酶基因的dna删除验证胶图。如图4所示，野生型菌株热纤梭菌pn2102pcr扩增得到dna片段为4017bp，磷酸乙酰转移酶/乙酸激酶基因ptaack敲除后的菌株pcr得到dna片段为1834bp，片段大小符合设计预期，证明基因组上的ptaack基因序列seqidno.3已被删除，得到热纤梭菌pn2102/δldhδpta-ack工程菌。
[0104]
把经过验证的单克隆细胞菌落加入5mlctfud培养基培养1-2天后保存。
[0105]
实施例3热纤梭菌工程菌的发酵培养（1）培养基的配制与除氧培养基采用mtc培养基，该培养基分为abcde液五种，其中，a液为5g/l碳源（微晶纤维素或秸秆纤维）与10.00g/lmops；b液为50.00g/l柠檬酸三钾、31.25g/l一水合柠檬酸、25.00g/lna2so4、25.00g/lkh2po4、62.50g/lnahco3；c液为250.00g/l尿素、d液为50.00g/lmgcl2·
6h2o、10.00g/lcacl2·
2h2o、5.00g/lfecl2·
4h2o、50.00g/l半胱氨酸盐；e液为1.00g/l吡哆胺二盐酸盐、0.20g/l对氨基苯甲酸、0.10g/l生物素、0.10g/lvb
12
。具体配方如表1所示。
[0106]
a液配制结束后，121℃、20min灭菌处理；b、c、d、e液按表配制完成，装于厌氧瓶中，加胶塞铝盖密封后反复抽真空充入高纯氮气3次，最后保持厌氧瓶内为正压。5种培养液按照40:2:1:1:1（v/v）在超净台内使用一次性无菌注射器和0.22μm无菌滤膜注入已灭菌装有a液的厌氧瓶中，总体积不超过厌氧瓶体积的40%。其中，a液中的碳源（微晶纤维素或者秸秆纤维），种子培养基中使用微晶纤维素avicelph105，浓度为5g/l；发酵产酶时使用秸秆纤维，浓度为5g/l。
[0107]
表1mtc培养基配制的各组分及浓度
（2）种子液的制备：将从-80℃保藏的热纤梭菌菌种置于4℃冰箱解冻，无菌条件下吸取1 ml菌种注入种子培养基中，55℃、200 rpm条件下培养24 h；种子培养基中，mtc培养基a液中的碳源为5.00 g/l的微晶纤维素（avicel ph 105），其具体配方见表1。
[0108]
（3）发酵：将上述种子液以10%（v/v）的接种量接入发酵培养基中，55℃、200 rpm下培养16 h。发酵培养基中，mtc培养基中a液的碳源为5.00 g/l的秸秆纤维，其具体配方见表1。其中，秸秆纤维的制备方法为本发明中木质纤维素的预处理步骤，参见实施例4步骤（1）：将秸秆原料洗净切碎，采用氢氧化钠和亚硫酸钠进行水热反应，充分脱除木质素，提取秸秆纤维，脱水并充分洗去残留碱液。其中氢氧化钠重量：水稻秸秆原料绝干重为1:6，亚硫酸钠：氢氧化钠重量比为1:3，处理条件为：反应温度为150℃，时间为2 h。
[0109]
实施例4 热纤梭菌在以秸秆为原料生产高品质还原糖中的应用（1）木质纤维素的预处理将小麦秸秆原料洗净切碎，采用氢氧化钠和亚硫酸钠进行水热反应，其中氢氧化钠重量与小麦秸秆原料绝干重比为1:6，亚硫酸钠：氢氧化钠重量比为1:3，处理条件为：反应温度为150℃，水解时间为2 h。充分脱除木质素后，提取小麦秸秆纤维，脱水并充分洗去残留碱液；（2）小麦秸秆纤维的水解将秸秆纤维浸泡在乙酸-乙酸钠（或同类具备缓冲效应的缓冲对）缓冲液中，投加热纤梭菌发酵液，进行秸秆纤维的水解，得到水解液。水解条件如下：ph 5，固液比1:10（秸秆纤维绝干重与加入的缓冲液的体积比例），单位质量秸秆纤维的热纤梭菌发酵液投加量为40 ml、单位质量秸秆纤维的木聚糖酶投加量为4 mg，反应温度为50℃、反应时间48 h，震荡速率为150转/分钟，水解结束时，水解液中的葡萄糖浓度约为65.00 g/l、木糖浓度为18.00 g/l。相同条件下，使用商业里氏木霉纤维素酶代替热纤梭菌发酵液进行水解时，水解48 h时，葡萄糖浓度约为42.00 g/l、木糖浓度为17.60 g/l。使用热纤梭菌发酵液水解小
麦秸秆纤维时，葡萄糖浓度较商业里氏木霉纤维素酶提高了54.8%。
[0110]
（3）水解液的固液分离与浓缩水解液的固液分离：采用中空纤维微滤膜去除所得水解液中的菌体与残渣，微滤膜购自于山东招金膜天有限责任公司，型号为mf1，聚丙烯材料，膜有效面积为0.33 m2，孔径为0.2 μm，错流速度为0.052 m/s，菌体去除率为100%，总糖回收率为98%。
[0111]
浓缩：在室温条件下进行水解液的浓缩。采用膜美国电气公司纳滤膜dk1812c-34d进行水解液的浓缩，操作压力为17 bar、流量为5 l/min，操作时间3 min/l，ph值自然。浓缩后水解液中的葡萄糖与木糖浓度为浓缩前的6.0倍和6.1倍。
[0112]
以上对本发明的实例进行了详细说明，但内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。