一株防治烟草炭疽病的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术和烟草病害防治技术领域，具体涉及一株防治烟草炭疽病的 枯草芽孢杆菌及其应用。


背景技术：

2.烟草炭疽病是由炭疽菌(colletotrichum spp.)侵染引起的一种真菌性叶部病害。该 病在烟草整个苗期和大田生长期均可发生。近年来，烟草炭疽病在烟叶大田生长期的为 害逐渐加重。发病初期，烟叶会出现暗绿色、水渍状的小斑点，后逐渐扩大成圆形或椭 圆形病斑。天气干燥时，圆形病斑中央部分为灰白色，有黄褐色或者褐色的边缘，发病 后期病斑处叶片会破碎，甚至造成穿孔；天气潮湿时，病斑上会产生小黑点。炭疽菌在 合适的条件下传播速度快、繁殖速率高，烟株脚叶一般先发病，而后逐渐向上方叶片蔓 延，发病严重时毁掉整片烟田，如若病情防治工作不及时还会造成病害大流行，给烟叶 生产带来巨大的经济损失。因此，对烟草炭疽病的防治迫在眉睫。
3.目前，炭疽病害的防治方法主要以化学农药为主，但长期使用化学农药，易使病菌 产生抗药性，危害更加严重；同时也会造成烟叶农药残留的增加和污染环境等问题。芽 孢杆菌具有防病促生的作用，拥有适应能力强及稳定性强、在占领空间及生存竞争方面 占绝对优势，同时具有对人畜低毒且绿色环保的优点，受到微生物制剂研究工作者的重 视。但是目前已开发出的用于烟草炭疽病防治的芽孢杆菌非常少，研究技术还不成熟， 使得生物防治烟草炭疽病的技术可选择范围小，推广难度大，因此，有必要开发出更多 的适合烟草炭疽病防治的生防菌株。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的是提供一株能够用于防治烟草炭疽病的枯草芽孢杆菌；第二个 目的是将所述枯草芽孢杆菌制备成用于防治烟草炭疽病的菌剂；第三个目的是提供所述 菌剂应用于烟草炭疽病防治的方法。
5.为了达到上述第一个目的，本发明提供一株防治烟草炭疽病的枯草芽孢杆菌，所述 枯草芽孢杆菌的保藏编号为cctcc no：m 2021284。
6.本发明的枯草芽孢杆菌(bacillus sp.)命名为k11，是从烟草炭疽病发病烟田(湖 北省恩施州宣恩县椒园镇锣圈岩村烟田)中取健康烟株根际土，采用稀释涂布的方法将 土壤微生物悬液涂布于na培养基上进行细菌的分离和纯化，以烟草炭疽病病原菌为靶 标，通过平板试验进行筛选，得到对烟草炭疽病具有较好防治效果的菌株。该菌株已于 2021年3月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学)， 保藏编号为：cctcc no：m 2021284。
7.为了达到上述第二个目的，本发明提供一种防治烟草炭疽病的菌剂，所述菌剂由上 述保藏编号为cctcc no：m 2021284的枯草芽孢杆菌k11制备而成。
8.所述菌剂的制备方法包括以下步骤：
有效消灭大部分萌发前的病菌孢子；将枯草芽孢杆菌k11与三唑类杀菌剂联用应用于 主栽烟草品种炭疽病的防治中，通过生防菌剂与化学药剂的结合，可以克服单施生防菌 剂或单施化学药剂带来的抗药性问题，提升防治效果，并减少至少52.8％的化学农药施 用量，从而提升产品安全性和减少环境污染；烟草移栽后75d，本发明对烟草炭疽病的 防治效果较常规防控措施提高至少50.00％；烟草移栽后100d，本发明对烟草炭疽病的 防治效果较常规防控措施提高至少59.49％。
27.(2)本发明选择炭疽病感病烟草品种大黄金为指示烟株，是因其与烟草主栽品种 相比，其炭疽病的发病时期通常比主栽品种早7～10d，当观察到指示烟株大黄金上出现 炭疽病后，病原菌的分生孢子借气流或雨滴飞溅传播，主栽品种上烟草炭疽病也将于 7～10d后发生；因此，在烟草移栽时，将炭疽病感病烟草品种大黄金的烟苗种植于烟田 的边缘，可根据其炭疽病的发生情况，对主栽品种炭疽病的发生时期进行精准预测，对 主栽品种炭疽病的精准防控给予指导。
附图说明
28.图1为k11菌株对烟草炭疽病菌的抑制效果示意图；
29.图2为基于16s rdna基因序列的k11菌株系统发育树。
具体实施方式
30.以下结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例 仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普 通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所 保护的范围。本领域技术人员依据以下实施方式所作的任何等效变换或替代，均属于本 发明的保护范围之内。
31.本发明中使用的枯草芽孢杆菌k11的筛选和鉴定方法如下：
32.(1)菌株的筛选
33.2019年7月在湖北省恩施州宣恩县椒园镇罗圈岩村烟田(烟草炭疽病发病烟田) 中取健康烟株的根际土壤1g，加入99ml含有玻璃珠的无菌生理盐水(nacl浓度为 0.85wt％)中，以150r/min速度震荡30min，取1ml得到的土样悬浮液加入到999ml 0.85wt％生理盐水中，充分混匀得到10-5
倍土样稀释液；按照同样的方法制备10-6
、10-7
倍土样稀释液。将三种浓度倍数的土样稀释液各取出100μl分别均匀涂布于na平板 上。所有na平板在30℃培养箱中培养48h，根据不同菌落形态特征挑取单菌落作为生 防菌，该生防菌命名为k11。其中，na平板的培养基成分包括：蛋白胨10.0g/l，牛肉 粉3.0g/l，nacl 5.0g/l，琼脂15.0g/l，ph值为7.2。
34.(2)测定生防菌k11对烟草炭疽病的平板抑菌效果
35.采用平板对峙法测定上述生防菌k11对烟草炭疽病的抑菌作用。蘸取5μl该生防 菌k11菌体接种到pda平板中央划线，同时在直线两侧呈十字交叉(距直线30mm处) 接种供试烟草炭疽病菌菌丝块作为实验组，以不接种该生防菌只接种供试烟草炭疽病菌 菌丝块的培养皿为对照组，测定抑菌带大小，结果如图1所示。图1中左图为实验组， 右图为对照组，从图1中可以看到，筛选得到的生防菌k11对烟草炭疽病菌具有较好 的抑制作用，抑菌
～1
×
109cfu/ml，获得枯草芽孢杆菌k11微生物菌剂。
50.s4、将木质素磺酸钠、十二烷基硫酸钠、枯草芽孢杆菌k11微生物菌剂按照质量 比1:1:100混合均匀，得到菌剂活性成分；将所述菌剂活性成分与水按照102:40000的 质量比混合后搅拌均匀，静置45min，得到所述菌剂稀释液。
51.所述复配杀菌剂的制备方法包括以下步骤：
52.将上述步骤s3中的枯草芽孢杆菌k11微生物菌剂与三唑类杀菌剂按照48:2的质量 比混合均匀，得到活性成分a；将木质素磺酸钠与十二烷基硫酸钠按照1:1的质量比混 合，得到辅剂b；将所述辅剂b与所述活性成分a按照2:100的质量比混合得到所述 复配杀菌剂；所述三唑类杀菌剂为25％苯甲丙环唑乳油，步骤p2中两次施用的复配杀 菌剂中25％苯甲丙环唑乳油的用量合计为7.8ml/亩。
53.使用所述复配杀菌剂时，将所述复配杀菌剂与水按照1:1500的质量比混合均匀得 到复配杀菌剂的稀释液，将所述复配杀菌剂的稀释液喷施于烟叶叶面上。
54.实施例2
55.本实施例中将枯草芽孢杆菌k11制备成微生物菌剂，用于防治烟草炭疽病的方法 包括以下步骤：
56.p1、在烟苗移栽时，将大黄金的烟苗种植于烟田的边缘，在烟田其他区域种植主栽 品种烟苗；其中，大黄金与主栽品种的株数比为1:50；对烟田进行常规管理；
57.p2、烟苗移栽30d后，每天观察大黄金烟株炭疽病的发病情况；当发现大黄金出现 炭疽病症状时，对主栽品种烟叶叶面喷施菌剂稀释液，用量为50kg/亩(其中枯草芽孢 杆菌k11微生物菌剂150g/亩，木质素磺酸钠1g/亩，十二烷基硫酸钠1g/亩)；当主栽 品种出现炭疽病时，按照120ml/亩的复配杀菌剂用量对主栽品种烟叶叶面喷施复配杀 菌剂的稀释液，间隔15d后，再次按照120ml/亩的复配杀菌剂用量对主栽品种烟叶叶 面喷施复配杀菌剂的稀释液；
58.所述菌剂稀释液的制备方法包括以下步骤：
59.s1、将枯草芽孢杆菌k11的菌株在lb固体平板培养基上活化；
60.s2、从步骤s1的lb固体平板培养基上挑取单菌落接种到lb液体培养基中，在 30
±
2℃下、以150r/min速度振荡培养20小时，得种子液；
61.s3、以2v/v％的接种量将所述种子液接种到发酵培养基中，置于30
±
2℃、转速为 150r/min的摇床中振荡培养35小时，得发酵液；用无菌水调节发酵液中菌液浓度至1
ꢀ×
108～1
×
109cfu/ml，获得枯草芽孢杆菌k11微生物菌剂。
62.s4、将木质素磺酸钠、十二烷基硫酸钠、枯草芽孢杆菌k11微生物菌剂按照质量 比1:1:150混合均匀，得到菌剂活性成分；将所述菌剂活性成分与水按照152:50000的 质量比混合后搅拌均匀，静置60min，得到所述菌剂稀释液。
63.所述复配杀菌剂的制备方法包括以下步骤：
64.将上述步骤s3中的枯草芽孢杆菌k11微生物菌剂与三唑类杀菌剂按照48:2的质量 比混合均匀，得到活性成分a；将木质素磺酸钠与十二烷基硫酸钠按照1:1的质量比混 合，得到辅剂b；将所述辅剂b与所述活性成分a按照2:120的质量比混合得到所述 复配杀菌剂；所述三唑类杀菌剂为25％苯甲丙环唑乳油，步骤p2中两次施用的复配杀 菌剂中25％苯甲丙环唑乳油的用量合计为9.4ml/亩。
65.使用所述复配杀菌剂时，将所述复配杀菌剂与水按照1:2000的质量比混合均匀得 到复配杀菌剂的稀释液，将所述复配杀菌剂的稀释液喷施于烟叶叶面上。
66.实施例3
67.本实施例中将枯草芽孢杆菌k11制备成微生物菌剂，用于防治烟草炭疽病的方法 包括以下步骤：
68.p1、在烟苗移栽时，将大黄金的烟苗种植于烟田的边缘，在烟田其他区域种植主栽 品种烟苗；其中，大黄金与主栽品种的株数比为1:45；对烟田进行常规管理；
69.p2、烟苗移栽30d后，每天观察大黄金烟株炭疽病的发病情况；当发现大黄金出现 炭疽病症状时，对主栽品种烟叶叶面喷施菌剂稀释液，用量为45kg/亩(其中枯草芽孢 杆菌k11微生物菌剂118g/亩，木质素磺酸钠1g/亩，十二烷基硫酸钠1g/亩)；当主栽 品种出现炭疽病时，第一次按照100ml/亩的复配杀菌剂用量对主栽品种烟叶叶面喷施 复配杀菌剂的稀释液，间隔12d后，第二次按照100ml/亩的复配杀菌剂用量对主栽品 种烟叶叶面喷施复配杀菌剂的稀释液；
70.所述菌剂稀释液的制备方法包括以下步骤：
71.s1、将枯草芽孢杆菌k11的菌株在lb固体平板培养基上活化；
72.s2、从步骤s1的lb固体平板培养基上挑取单菌落接种到lb液体培养基中，在 30
±
2℃下、以150r/min速度振荡培养20小时，得种子液；
73.s3、以3v/v％的接种量将所述种子液接种到发酵培养基中，置于30
±
2℃、转速为 150r/min的摇床中振荡培养36小时，得发酵液；用无菌水调节发酵液中菌液浓度至1
ꢀ×
108～1
×
109cfu/ml，获得枯草芽孢杆菌k11微生物菌剂。
74.s4、将木质素磺酸钠、十二烷基硫酸钠、枯草芽孢杆菌k11微生物菌剂按照质量 比1:1:120混合均匀，得到菌剂活性成分；将所述菌剂活性成分与水按照120:45000的 质量比混合后搅拌均匀，静置50min，得到所述菌剂稀释液。
75.所述复配杀菌剂的制备方法包括以下步骤：
76.将上述步骤s3中的枯草芽孢杆菌k11微生物菌剂与三唑类杀菌剂按照45:5的质量 比混合均匀，得到活性成分a；将木质素磺酸钠与十二烷基硫酸钠按照1:1的质量比混 合，得到辅剂b；将所述辅剂b与所述活性成分a按照2:100的质量比混合得到所述 复配杀菌剂；所述三唑类杀菌剂为12.5％烯唑醇可湿性粉剂，步骤p2中两次施用的复 配杀菌剂中12.5％烯唑醇可湿性粉剂的用量合计为19.6g/亩。
77.第一次使用所述复配杀菌剂时，将所述复配杀菌剂与水按照1:1500的质量比混合 均匀得到复配杀菌剂的稀释液；第二次使用所述复配杀菌剂时，将所述复配杀菌剂与水 按照1:2000的质量比混合均匀得到复配杀菌剂的稀释液。
78.实施例4
79.本实施例中将枯草芽孢杆菌k11制备成微生物菌剂，用于防治烟草炭疽病的方法 与实施例1基本相同，不同之处在于：
80.步骤s3中以2.5v/v％的接种量将所述种子液接种到发酵培养基中，置于30
±
2℃、 转速为150r/min的摇床中振荡培养30小时，得发酵液；
81.步骤p2中当主栽品种出现炭疽病时，第一次按照110ml/亩的复配杀菌剂用量对主 栽品种烟叶叶面喷施复配杀菌剂的稀释液，间隔13d后，第二次按照110ml/亩的复配 杀菌
剂用量对主栽品种烟叶叶面喷施复配杀菌剂的稀释液；
82.所述复配杀菌剂的制备方法包括以下步骤：
83.将上述步骤s3中的枯草芽孢杆菌k11微生物菌剂与三唑类杀菌剂按照46:4的质量 比混合均匀，得到活性成分a；将木质素磺酸钠与十二烷基硫酸钠按照1:1的质量比混 合，得到辅剂b；将所述辅剂b与所述活性成分a按照2:110的质量比混合得到所述复 配杀菌剂；所述三唑类杀菌剂为12.5％烯唑醇可湿性粉剂，步骤p2中两次喷施的复配 杀菌剂中12.5％烯唑醇可湿性粉剂的用量合计为17.3g/亩。
84.使用所述复配杀菌剂时，将所述复配杀菌剂与水按照1:1800的质量比混合均匀得 到复配杀菌剂的稀释液。
85.需要说明的是，上述实施例1～4的步骤p2中，两次施用复配杀菌剂的稀释液的用 量也可以不相同；例如，第一次按照100ml/亩的复配杀菌剂用量对主栽品种烟叶叶面 喷施复配杀菌剂的稀释液，间隔10～15d后，第二次按照120ml/亩的复配杀菌剂用量对 主栽品种烟叶叶面喷施复配杀菌剂的稀释液。
86.枯草芽孢杆菌k11防治炭疽病效果验证
87.空白对照：不播种和移栽指示烟株大黄金，在实施例1中喷施枯草芽孢杆菌k11 菌剂稀释液和复配杀菌剂的稀释液时，以相同用量的清水喷施主栽品种。
88.阳性对照1：依据生产经验，于主栽烟草品种移栽45d时，进行烟草炭疽病的预防 (100～150g/亩井冈霉素，兑水40～50kg/亩)；于主栽烟草品种出现炭疽病时，喷施杀菌 剂(25％苯甲丙环唑乳油，用量为10ml/亩)；间隔10d后，再次喷施杀菌剂(25％苯 甲丙环唑乳油，用量为10ml/亩)；两次施用25％苯甲丙环唑乳油的用量合计为20ml/ 亩。
89.阳性对照2：依据生产经验，于主栽烟草品种移栽45d时，进行烟草炭疽病的预防 (100～150g/亩井冈霉素，兑水40～50kg/亩)；于主栽烟草品种出现炭疽病时，喷施杀菌 剂(12.5％烯唑醇可湿性粉剂，用量为25g/亩)；间隔10d后，再次喷施杀菌剂(12.5％ 烯唑醇可湿性粉剂，用量为25g/亩)；两次施用12.5％烯唑醇可湿性粉剂的用量合计为 50g/亩。
90.按照空白对照、阳性对照1、阳性对照2、实施例1～4的方案对烟草炭疽病进行防 控，每个方案处理100株烟草，且每个方案重复处理3次。分别于烟草移栽后75d和 100d对主栽烟草品种炭疽病发生情况进行调查，并计算病情指数和防治效果。具体试 验结果如下表1所示。
91.防治效果(％)＝(空白对照病情指数－实施例/阳性对照病情指数)
÷
空白对照病 情指数
×
100％
92.表1烟草炭疽病发生情况
[0093][0094]
表1中a、b、c表示多重比较显著性(p《0.05)差异分析标记，从上表1可以看出， 烟草移栽后75d，实施例1～4中烟草炭疽病病情指数为0.81～1.00，均显著低于对比例 阳性对照和空白对照；相对于空白对照，实施例1～4的防效为83.02～86.25％，明显高 于阳性对照1(66.04％)和阳性对照2(56.03％)的防效；实施例1～4的防效较阳性对 照1的防效提高50.00～59.50％，较阳性对照2的防效提高61.39～68.73％。烟草移栽后 100d，实施例1～4中烟草炭疽病病情指数为1.37～2.07，均显著低于阳性对照和空白对 照；相对于空白对照，实施例1～4的防效为82.96～88.72％，明显高于阳性对照1(57.94％) 和阳性对照2(57.04％)的防效；实施例1～4的防效较阳性对照1的防效提高59.49～73.19％，较阳性对照2的防效提高60.34～73.75％。在实施例1～4中，实施例2 对烟草炭疽病的防效最高。
[0095]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。对于任 何熟悉本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。任何依据本发明申请保 护范围及说明书内容所作的简单的等效变化和修饰，均应包含在本发明的保护范围之内。