人卵巢癌干细胞培养、非治疗目的抑制人卵巢癌干细胞迁徙能力的方法及其应用

1.本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及细胞培养、处理技术。


背景技术：

2.癌干细胞作为一类具有自我更新能力和分化潜能的特殊癌细胞，一直被认为是导致肿瘤增殖生长、转移及复发的关键原因。因此，对癌干细胞进行针对性治疗成为目前研究肿瘤治疗的一个重点方向。人们祈求从根源来改变癌干细胞的生物特性，如抑制自我更新、降低迁徙性等，以此达到治疗肿瘤的目的。因此，获得癌干细胞能为研究癌干细胞、抗肿瘤药物筛选等方面工作提供基础。
3.越来越多的治疗策略被应用于抑制癌干细胞迁徙研究。如通过使用一些靶向药物，使其能够特异性的追踪癌干细胞，药物作用某些特定的蛋白，导致细胞内肌动蛋白形成增加等，从而发挥抑制癌干细胞迁徙的目的。癌干细胞迁徙能力受到抑制后，若能结合其他的有效措施对癌干细胞进行处理，是可以期望有效抑制癌干细胞自我更新的，这对肿瘤治疗研究具有极大的帮助。因此提供迁徙能力受抑制的癌干细胞作为研究抑制癌干细胞自我更新的有效治疗措施的基础，为抗肿瘤药物筛选及肿瘤治疗等方面工作提供帮助是具有巨大应用前景的。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供人卵巢癌干细胞培养方法获得人卵巢癌干细胞、非治疗目的抑制人卵巢癌干细胞迁徙能力的方法获得迁徙能力被抑制的人卵巢癌干细胞，以解决现有技术中缺乏肿瘤治疗研究、抗肿瘤药物筛选基础的问题。
5.为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
6.一种人卵巢癌干细胞培养基，所述培养基是含有20ng/ml的egf、10ng/ml的begf、10μg/ml的胰岛素、20μmol/l的rock抑制剂的无血清dmem/f12培养基。
7.本发明还提供一种人卵巢癌干细胞培养分选方法，步骤包括：
8.(1)将人卵巢癌细胞a2780置于含有20ng/ml的egf、10ng/ml的begf、10μg/ml的胰岛素、20μmol/l的rock抑制剂的无血清dmem/f12培养基，在37℃、5％co2细胞培养箱中进行培养；
9.(2)分选出人卵巢癌干细胞。
10.进一步地，所述步骤(2)的过程包括：当细胞处于对数生长期时，进行胰酶消化处理，并加入卵巢癌干细胞标记物aldh1+抗体，在冰上进行细胞与抗体的孵育，再离心去除上清液，通过流式细胞仪对所有细胞进行分选，获得含有aldh1
+
的人卵巢癌干细胞。
11.本发明还提供一种上述方法得到的人卵巢癌干细胞在研究抗肿瘤治疗中的应用。
12.本发明还提供一种上述方法得到的人卵巢癌干细胞在筛选抗肿瘤药物中的应用。
13.本发明还提供一种非治疗目的的抑制人卵巢癌干细胞迁徙能力的方法，步骤包
括：
14.(1)将含有aldh1
+
的人卵巢癌干细胞种植于含有20ng/ml的egf、10ng/ml的begf、10μg/ml的胰岛素、20μmol/l的rock抑制剂的无血清dmem/f12培养基，在37℃、5％co2细胞培养箱中进行培养；
15.(2)待细胞处于对数生长期时，将孔板置于超声辐照装置上，孔板与超声探头之间用无菌水填充；
16.(3)在频率为1mhz,占空比为20％，辐照时间为1min的参数下，将细胞分别在声强为0.6～1.4w/cm2的条件下，进行辐照处理，得到迁徙能力受抑制的人卵巢癌干细胞。
17.更优地，所述声强是0.6w/cm2或1.0w/cm2或1.4w/cm2。
18.本发明还提供一种上述的方法得到的迁徙能力受抑制的人卵巢癌干细胞在研究抗肿瘤治疗中的应用。
19.本发明还提供一种上述的方法得到的迁徙能力受抑制的人卵巢癌干细胞在筛选抗肿瘤药物中的应用。
20.本发明还提供一种上述的方法得到的迁徙能力受抑制的人卵巢癌干细胞在筛选针对癌干细胞迁徙能力受抑制后的抗肿瘤药物中的应用。
21.本发明的优点包括：能培养出癌干细胞，为癌症治疗研究、筛选抗肿瘤药物提供基础；利用低强度超声影响癌干细胞的生物学特性，成功得到迁徙能力受到抑制的癌干细胞，为癌症治疗研究、筛选抗肿瘤药物提供基础。
附图说明
22.此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本技术的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
23.图1a为人卵巢癌细胞a2780，呈足状或不规则状，以及从a2780细胞分选出来的人卵巢癌干细胞ocscs，呈圆形或椭圆形；
24.图1b为a2780细胞在无血清培养的条件下，从足状至圆形的过程；
25.图2为对照组(未经超声处理)及处理组(经不同超声强度处理)transwell下室内的卵巢癌干细胞集落数实验图；
26.图3为图2中对照组及处理组对应的细胞计数柱状图，其中横坐标为不同超声强度参数，纵坐标为细胞迁徙数量；
27.图4为对照组及处理组中卵巢癌干细胞的细胞形态实验图；
28.图5为对照组及处理组的卵巢癌干细胞中肌动蛋白情况实验图；
29.图6为处理组卵巢癌干细胞膜硬度情况的实验图，其中横坐标为不同超声强度参数，纵坐标为杨氏模量。
具体实施方式
30.下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
31.未作特殊说明情况下，本说明书中的实验操作是本技术领域实验室常规操作，所涉及试剂、实验用品、实验装置均为市售可得。
32.实施例1
33.本实施例说明卵巢癌干细胞培养及流式分选方法，步骤包括：
34.(1)将人卵巢癌细胞a2780置于含有20ng/ml的egf、10ng/ml的begf、10μg/ml的胰岛素、20μmol/l的rock抑制剂的无血清dmem/f12培养基，在37℃、5％co2细胞培养箱中进行培养，如图1b所示，从第1天到第13天可以观察到细胞形态从足状变化至圆形的过程；
35.(2)当细胞处于对数生长期时，进行胰酶消化处理，并加入卵巢癌干细胞标记物aldh1
+
抗体(01700,stem cell)，在冰上进行细胞与抗体的孵育，再离心去除上清液，通过流式细胞仪对所有细胞进行分选，获得含有aldh1
+
的卵巢癌干细胞，如图1a所示，人卵巢癌细胞a2780，呈足状或不规则状，从a2780细胞分选出来的人卵巢癌干细胞ocscs，呈圆形或椭圆形，所获得的细胞在无血清的条件下进行培养。
36.实施例2
37.本实施例说明超声辐照系统对卵巢癌干细胞处理方案，步骤包括：
38.(1)将含有aldh1
+
的卵巢癌干细胞种植于低吸附的6孔板中，加入含有20ng/ml的egf、10ng/ml的begf、10μg/ml的胰岛素、20μmol/l的rock抑制剂的无血清dmem/f12培养基，在37℃、5％co2细胞培养箱中进行培养，待细胞出现成球现象后，再以5x104cells/孔种植于低吸附的24孔板中，加入含有20ng/ml的egf、10ng/ml的begf、10μg/ml的胰岛素、20μmol/l的rock抑制剂的无血清dmem/f12培养基，在37℃、5％co2细胞培养箱中继续培养；
39.(2)待细胞处于对数生长期时，将孔板置于超声辐照装置上，孔板与超声探头之间用无菌水填充；
40.(3)在频率为1mhz,占空比为20％，辐照时间为1min的参数下，将各实验组细胞分别在声强为0.6w/cm2、1.0w/cm2、1.4w/cm2的条件下，进行辐照处理。
41.实施例3
42.本实施例说明低强度超声对癌干细胞进行辐照刺激后，检测细胞迁徙能力的方法。具体步骤包括：
43.(1)将卵巢癌干细胞以1x105cells/孔种植于低吸附的6孔板中，待细胞处于对数生长期时，利用超声辐照装置对细胞进行超声辐照，超声辐照方法参照实施例2的步骤(2)-(3)；
44.(2)从每个实验组吸取经辐照处理的100μl细胞悬液至transwell上室，上室置于transwell下室内，下室加入不含血清的dmem/f12培养基，置于37℃，5％co2细胞培养箱中进行培养12h；
45.(3)用镊子取出transwell上室，去除下室内的培养基溶液，并加入2.5％戊二醛对下室内的细胞进行固定处理，固定时间约为30min；
46.(4)去除下室内的戊二醛溶液，加入浓度为0.1％的结晶紫进行细胞染色处理，染色时间为30min，染色结束后，用pbs清洗2次，去除多余的结晶紫染色剂；
47.(5)通过荧光显微镜观察下室细胞数量情况，如图2所示，在观察视野中，随着超声强度的逐渐增加，视野内染色细胞的数量逐渐减少，即上室内的细胞迁徙到下室内的数量逐步减少。定量数据图3也显示，当超声强度为1.4w/cm2时，癌干细胞迁徙数目为2400个/cell，较未经超声辐照处理组而言，细胞迁徙数目减少了26％。
48.实施例4
49.本实施例说明低强度超声对癌干细胞进行辐照刺激后，检测细胞膜表面形态变化方法。包括的具体步骤如下：
50.(1)利用低强度超声对种植于低吸附24孔板的癌干细胞进行超声辐照处理，辐照时间分别为1min，超声辐照参数、实验分组参照实施例2；
51.(2)用2.5％戊二醛将细胞进行固定处理，固定时间为3h；
52.(3)细胞结束固定后，分别利用系列浓度梯度酒精进行脱水，浓度分别为30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％，每种浓度酒精处理细胞两次，每次15min；
53.(4)对细胞样品进行冻干处理，并将细胞样品涂抹至金属网上，镀金后晾干；
54.(5)通过扫描电镜观察细胞膜变化情况，如图4所示，未经超声辐照处理细胞呈圆型，细胞表面光滑，未见明显改变。经超声辐照处理组，细胞出现不同程度改变，并随着超声声强的增加，细胞表面形态改变越明显，表面出现许多突起，细胞膜显示不均匀。
55.实例例5
56.本实施例说明参考实施例2采用不同低强度超声对癌干细胞进行辐照刺激后，检测细胞内肌动蛋白含量变化的方法。包括的具体步骤如下：
57.(1)收集低强度超声处理后的细胞，室温下，用2.5％多聚甲醛进行固定30min,并用pbs清洗3次，每次5min；
58.(2)细胞结束固定后，室温下，加入浓度为0.1％tritonx-100进行破膜处10min，并利用pbs清洗3次，每次5min；
59.(3)向上一步得到的各样品中分别加入1ml 5％的bsa进行封闭，时间为1h,并用pbs清洗3次，每次5min；
60.(4)向上一步得到的各样品中分别加入200μl fitc标记的鬼笔环肽工作液，避光条件下与细胞共孵育30min,孵育结束后，pbs清洗3次，每次5min；
61.(5)向上一步得到的各样品中分别加入100μl dapi溶液，室温条件下与细胞共孵育1min，通过共聚焦显微镜观察细胞内肌动蛋白变化情况，如图5所示，随着超声强度的增加，绿色荧光强度逐渐增加，说明肌动蛋白形成的数量增加。肌动蛋白含量增加，可导致细胞膜硬度增加，从而降低细胞迁徙能力。
62.实施例6
63.本实施例说明参考实施例2采用不同低强度超声对癌干细胞进行辐照刺激后，检测细胞膜硬度变化的方法。具体步骤包括：
64.(1)收集超声处理的细胞，利用原子力显微镜探针轻轻触碰细胞表面，并使细胞发生形变；
65.(2)力-距离数据将被nanoscope_analysis软件进行记录，并描绘出力-距离关系的拟合曲线；
66.(3)通过原子力显微镜测定细胞膜硬度的变化，如图6所示，超声刺激影响了细胞膜硬度，并且随着声强的不断增加，细胞逐步变硬，当超声强度为1.4w/cm2，杨氏模量为2.86kpa，说明超声刺激影响细胞膜硬度进而抑制癌干细胞迁徙能力。
67.以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方
式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。