一种荞麦低聚木糖、黄酮提取及保健荞麦香醋制备方法

1.本发明属于微生物领域，具体涉及一种荞麦低聚木糖、黄酮提取及保健荞麦香醋的制备。


背景技术：

2.荞麦又名三角麦、乌麦，是我国最古老的栽培作物之一，其年产量继俄罗斯之后位居世界第二[蒲升惠,高颖,赵志峰,林华松,刑天,何学勤.苦荞中活性物质及其保健功效研究进展[j].食品工业科技,2019,40(08):331-336]。荞麦中不仅含有丰富的淀粉、脂肪、必需氨基酸以及矿物质等营养物质，而且还含有多种黄酮、多酚、维生素以及 d-手性肌醇等治疗功效的生物活性成分，具有降血糖、血脂以及软化血管等保健功效 [陈慧,李建婷,秦丹.苦荞的保健功效及开发利用研究进展[j].农产品加工,2016(15):63-66.]。
[0003]
荞麦籽粒中的黄酮类物质主要包括芦丁、荭草苷、牧荆碱、槲皮素、异牧荆碱和异红草苷等，由于荞麦黄酮能够有效降解机体内的超氧阴离子自由基、羟基自由基，具有很好的降血糖、降血脂，增强人体免疫力、疗胃疾、除湿解毒、治肾炎、蚀体内恶肉的功效[孟晶晶,张志威,周文喜,倪娜,赵汝,李华,王华.超声辅助提取荞麦总黄酮工艺优化及其体外抗氧化活性[j].食品研究与开发,2022,43(04):82-88.]，在临床上对糖尿病、高血压、高血脂、冠心病、中风、胃病患者都有较好的辅助治疗作用[赵秀玲.荞麦的功效因子与保健功能的研究进展[j].食品工程,2011(03):16-18.]。因此，通过合适的工艺研发将黄酮类成分作为荞麦醋饮保健因子之一，可以使该产品具有降血糖、血脂、抗氧化、增强人体免疫力等多种生理功能，同时对糖尿病、高血压、冠心血、中风等病症有治疗作用的保健功效。
[0004]
低聚木糖是半纤维素的降解产物，是目前发现双歧杆菌增殖效果最好、效用量最小的低聚糖，被称为超强双歧因子或益生元，具有独特的生理保健功能，在促进人体肠道有益菌增殖的同时可抑制有害菌的生长，有助于调节肠道微生态平衡，可增强营养吸收和提高免疫力，被广泛的应用于医药保健品、食品等领域[马婷婷,杜倩,干昭波, 邵先豹,王彬彬.木聚糖酶在制备低聚木糖中的应用进展[j].精细与专用化学品,2021,29(02):6-11；任春霖,董红丽,王风芹,宋安东.低聚木糖生产技术及其对动物益生作用研究进展[j].食品与发酵工业,2021,47(09):293-298；顾峰源,姚自选,潘艳,刘练, 常思源.低聚木糖制备的研究进展[j].山东化工,2020,49(21):59-60；潘晴,孙丕智,徐文彪, 李翔宇,时君友.玉米秸秆制备低聚木糖的研究进展[j].林产工业,2020,57(10):8-12+22；谢芳,张海波,幸清凤,黎力之,关玮琨,郭冬生,刘小高.低聚木糖对动物肠道屏障的影响及其在动物生产中应用的研究进展[j].中国畜牧杂志,2020,56(10):7-12.]。但目前市场上生产销售的低聚木糖都是采用玉米芯等原材料经“碱溶醇沉法”加工制备而得，而在开发低聚木糖相应产品时通过外源复配添加引入低聚木糖成分，这种产品开发加工方式成本高、操作繁琐、过程复杂，而且还会引入外源材料的其他杂质成分，严重影响了产品原有的风味和品质[谢芳,张海波,幸清凤,黎力之,关玮琨,郭冬生,刘小高.低聚木糖对动物肠道屏障的影响及其在动物生产中应用的研究进展[j].中国畜牧杂志,2020,56(10):7-12.]。荞麦醋在生产及存放
过程中会出现不同程度的浑浊、沉淀及附壁现象等问题而影响食醋品质，浑浊的主要原因是淀粉利用率不高、存在多酚、蛋白质及铁离子等成分，而传统的自然澄清方法沉淀速度慢，效果也不理想，不能适应酿造行业的发展需求。此外，目前市场上以荞麦为主要原料开发的荞麦香醋虽然挖掘利用了荞麦中丰富的氨基酸、淀粉、矿物质以及烟酸等有效营养成分，是一种上乘的调味品，但是荞麦中具有治疗和保健功效的生物活性成分仍未被开发和利用[朴春红,荞麦芽发酵保健食品的研究与开发.吉林省,吉林农业大学,2015-06-18；赵秀玲.荞麦的功效因子与保健功能的研究进展[j].食品工程,2011(03):16-18]。因此，利用荞麦秸秆中丰富的半纤维素及荞麦籽粒黄酮成分，通过绿色酶解制备工艺和不同提取方法从荞麦中制备提取高附加值荞麦低聚木糖和黄酮，并应用于荞麦为主要原料开发的药食同源保健荞麦香醋产品具有很高的经济价值和市场前景。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的之一是提供一株长枝木霉抗葡萄糖阻遏高产纤维素酶菌株，其意义在于筛选得到的抗葡萄糖阻遏高产纤维素酶菌株在保证高产酶性能的同时有效降低了底物葡萄糖的阻遏，主要解决了实际生产中高产纤维素酶菌株受葡萄糖阻遏而抑制产酶的关键问题。
[0006]
本发明所提供的长枝木霉抗葡萄糖阻遏高产纤维素酶菌株命名为lc-m4.21，已于2021年8月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 cgmcc；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，其保藏编号为：cgmcc no:23206。
[0007]
本发明所提供的长枝木霉抗葡萄糖阻遏高产纤维素酶菌株通过包括如下步骤的方法制备得到：
[0008]
1)对长枝木霉lc-m4(trichoderma longibrachiatum)[参见dong my,wang sy, xu fq et al.efficient utilization ofwaste paper as an inductive feedstock for simultaneous production ofcellulase and xylanase by t.longibrachiatum.journal ofcleaner production, 2021,308:127287；dong my,wang sy,xu fq et al.pretreatment ofsweet sorghum straw and its enzymatic digestion:insight into the structural changes and visualization of hydrolysis process.biotechnology for biofuels.2019,12:276]菌株孢子悬液进行重离子束辐照诱变；
[0009]
2)长枝木霉抗葡萄糖阻遏高产纤维素酶优良菌株筛选：
[0010]
将重离子束辐照诱变后的长枝木霉lc-m4菌株孢子悬液采用双层初筛平板通过水解圈法进行抗阻遏高产酶突变菌株的初筛，将平板初筛获得的高hc值菌株进行摇瓶复筛，得到抗葡萄糖阻遏纤维素酶高产突变菌株lc-m4.21。
[0011]
上述方法步骤1)中，所述长枝木霉lc-m4菌株孢子悬液中，孢子浓度可为 1
×
10
4-1
×
108个/ml，具体可为1
×
106个/ml；
[0012]
所述重离子束辐照剂量为120-200gy，具体可为150-180gy，更具体可为160 gy；
[0013]
辐照离子种类为碳离子，能量为60-100mev/u，具体可为80mev/u，剂量率为 10-40gy/min，具体可为20gy/min；
0.002g，cocl
2 0.001-0.003g，ph自然值；
[0030]
以上培养基均在115-121℃条件下高压灭菌15-30min。
[0031]
上述长枝木霉抗葡萄糖阻遏高产纤维素酶菌株或含木聚糖酶和纤维素酶的发酵液在直接酶解秸秆制备秸秆低聚木糖中的应用也属于本发明的保护范围。
[0032]
所述秸秆具体可为荞麦秸秆。
[0033]
本发明的再一目的是提供一种采用长枝木霉抗葡萄糖阻遏高产纤维素酶菌株或含木聚糖酶和纤维素酶的发酵液直接酶解秸秆制备秸秆低聚木糖的方法，其创新点在于，避免了强酸、强碱及工业乙醇等化学试剂的使用，在提升产品品质的同时降低了加工生产成本、减少了环境污染，同时还实现了绿色食品原料的绿色加工生产。
[0034]
本发明所提供的制备秸秆低聚木糖的方法，包括如下步骤：
[0035]
以秸秆为原料，采用长枝木霉抗葡萄糖阻遏高产纤维素酶菌株lc-m4.21或者采用上述方法制备的含木聚糖酶和纤维素酶的发酵液进行酶解，得到含秸秆低聚木糖的酶解液；
[0036]
上述方法中，在酶解前先粉碎后过20目筛并用60目筛截留，选用20-60目筛之间截留粒度的秸秆为原料；
[0037]
所述秸秆具体可为荞麦秸秆；
[0038]
木聚糖酶的添加量为260-1600iu/g秸秆，具体可为520-1600iu/g秸秆、520-1000 iu/g秸秆、1000-1600iu/g秸秆；更具体可为1000iu/g秸秆；
[0039]
所述酶解中采用的料液比为1：6-1：12(w:v)，具体可为1：10(w:v)(此处的料液比是指荞麦秸秆的质量与液体的总体积(其中液体为蒸馏水与长枝木霉抗葡萄糖阻遏高产纤维素酶菌株发酵液上清液的混合物)。
[0040]
所述酶解的时间可为12h-48h，具体可为30-40h、34-38h、35-37h；更具体可为36h；
[0041]
当用于荞麦香醋制备时，木聚糖酶的添加量为260iu/g，酶解36h，制得的酶解液中低聚木糖含量为5.68mg/ml。
[0042]
本发明的再一目的是提供一种荞麦籽粒中黄酮类化合物的提取方法，对其提取工艺进行优化，本发明所提供的荞麦籽粒黄酮化合物的提取方法，为如下(1)、(2)、 (3)：
[0043]
(1)以荞麦籽粒为原料，利用一定浓度的乙醇溶液进行提取，得到荞麦籽粒黄酮提取液；
[0044]
上述方法中，首先将荞麦籽粒粉碎，然后用60目筛进行过滤，过滤后的荞麦粉作为黄酮提取原料；
[0045]
其中黄酮提取料液比为1：5-1：30(w/v)；提取时间为0.5-3h；提取用乙醇浓度为50％-80％；
[0046]
所述黄酮提取浓度为5-8.50mg/ml；
[0047]
荞麦黄酮的最优提取工艺为：料液比1：20、60％乙醇提取2h的条件下，得到的黄酮含量最高浓度为8.50mg/ml。
[0048]
(2)以荞麦籽粒为原料，用低聚木糖水解液(即上述方法制得的含秸秆低聚木糖的酶解液)进行黄酮提取，得到荞麦低聚木糖、黄酮提取液；
[0049]
其中，所述低聚木糖水解液的低聚木糖浓度为5.6-9.6g/l；
[0050]
黄酮提取料液比为1：5-1：30(w/v)；提取时间为0.5-3h；
[0051]
所述黄酮提取浓度为0.04-0.1mg/ml；
[0052]
荞麦黄酮的最优提取工艺为：料液比1：20、提取3h的条件下，得到的黄酮含量最高浓度为0.1mg/ml；
[0053]
(3)以荞麦籽粒为原料，采用酶法提取工艺，用含5％乙醇的低聚木糖水解液(即上述方法制得的含秸秆低聚木糖的酶解液)对荞麦籽粒中黄酮类化合物进行提取；
[0054]
其中所用酶为长枝木霉lc-m4菌株发酵生产的粗酶液，即，上述方法制得的含木聚糖酶和纤维素酶的发酵液，其中纤维素酶的添加量为：2-8iu/ml；
[0055]
提取条件为：提取温度：50℃；转速：150rpm；料液比：1：20；提取时间：1-3h；
[0056]
荞麦黄酮的最优提取工艺为：纤维素酶添加量为2iu/g底物、提取1h，所得黄酮提取率最高为3.27mg/g籽粒，较低聚木糖水解液荞麦黄酮提取最高为0.10mg/g(提取2h)高了30多倍，同时减少了提取时间。
[0057]
本发明的再一目的是提供一种荞麦低聚木糖保健香醋及荞麦低聚木糖、黄酮保健香醋的制备方法，采用荞麦秸秆低聚木糖水解液进行荞麦籽粒黄酮提取，荞麦低聚木糖黄酮提取液淋醋，在淋醋过程中引入了具有保健功效的低聚木糖、黄酮成分，代替了其他醋制备中先用自来水淋醋、再外源引入添加保健功效成分的繁琐操作工艺。此外，本发明中建立的核孔膜过滤澄清技术可推广应用至酱油等同类产品的加工生产中。
[0058]
本发明所提供的荞麦低聚木糖保健香醋的制备方法，为：
[0059]
采用上述方法制得的荞麦低聚木糖水解液对成熟醋醅进行淋醋，对淋出的低聚木糖保健荞麦香醋采用核孔膜材料进行过滤澄清处理，即得荞麦低聚木糖保健香醋。
[0060]
本发明所提供的荞麦低聚木糖、黄酮保健香醋的制备方法，为如下(1)或(2)：
[0061]
(1)采用上述方法制得的荞麦低聚木糖、黄酮提取液对成熟醋醅进行淋醋，对淋出的低聚木糖、黄酮保健荞麦香醋采用核孔膜材料进行过滤澄清处理，即得；
[0062]
(2)采用上述方法制得的含秸秆低聚木糖的酶解液即荞麦秸秆低聚木糖水解液对成熟醋醅进行淋醋，对淋出的低聚木糖保健荞麦香醋添加荞麦籽粒黄酮提取液，所得的低聚木糖、黄酮保健荞麦香醋采用核孔膜材料进行过滤澄清处理，即得；
[0063]
所述(2)中，荞麦籽粒黄酮提取液按照0.5-1％(体积比)添加。
[0064]
淋醋工艺中料液比为1：1-1：1.7(w/v)(两个端点值不可取)，具体可为1：1.4
ꢀ‑
1：1.6(w/v)；
[0065]
淋醋时间可为18h-30h，具体可为24h；
[0066]
淋醋温度可为4℃-40℃；
[0067]
所述核孔膜材料的孔径可为2μm-3μm，更具体可为3μm。
[0068]
此处所用的核孔膜材料为商业购置的，生产厂家为武威科近新发技术有限责任公司，商品名为核孔膜(孔径规格为2μm-3μm)。
[0069]
由上述方法制备得到的荞麦低聚木糖保健香醋或荞麦低聚木糖、黄酮保健香醋也属于本发明的保护范围。
[0070]
本发明具有以下优点：
[0071]
(1)建立了长枝木霉重离子辐照诱变后抗葡萄糖阻遏高产纤维素酶菌株双层平板筛选方法，筛选获得一株抗阻遏高产菌株lc-m4.21。传统产酶菌株改良都以高产酶为唯一目标进行筛选，但是高产酶菌株在发酵生产中极易受到底物中葡萄糖阻遏而抑制产酶，该
方法的意义在于筛选能够真正用于工业发酵的产酶生产菌株，通过此方法筛选获得的菌株在保证高产酶性能的同时有效降低了底物葡萄糖阻遏，主要解决了实际生产中高产酶菌株因受葡萄糖阻遏而抑制产酶的关键科学问题；
[0072]
(2)长枝木霉抗阻遏高产菌株发酵液中木聚糖酶和纤维素酶活同时可分别达到 350
±
0.39iu/ml和5.6
±
0.05iu/ml，满足未处理秸秆直接酶解制备低聚木糖的用酶需求，采用长枝木霉抗阻遏高产菌株发酵酶液通过绿色酶解工艺制备荞麦秸秆低聚木糖，获得荞麦来源低聚木糖进行保健荞麦香醋制备；
[0073]
(3)通过优化木聚糖酶添加量和酶解时间建立了满足低聚木糖保健需求添加量的荞麦秸秆直接酶解制备荞麦低聚木糖的绿色工艺方法，在木聚糖酶添加量为260 iu/g的条件下酶解36h，其秸秆酶解液中低聚木糖含量可达到5.68mg/ml。工业领域低聚木糖制备方法为传统的“碱溶醇沉法”提取木聚糖成分再利用木聚糖酶进行低聚木糖的酶解制备，所以本研究中荞麦秸秆低聚木糖直接酶解法绿色制备工艺创新点在于：避免了强酸、强碱及工业乙醇等化学试剂的使用，在提升产品品质的同时降低了加工生产成本、减少了环境污染，同时还实现了绿色食品原料的绿色加工生产；
[0074]
(4)采用荞麦秸秆低聚木糖和黄酮提取液进行淋醋，在淋醋过程中引入了具有保健功效的低聚木糖和黄酮生物活性成分，代替了其他保健醋制备中先用自来水淋醋、再外源引入添加保健功效成分的繁琐操作工艺，并优化了荞麦秸秆低聚木糖水解液淋醋的料液比、温度和时间参数，本研究中采用荞麦秸秆低聚木糖水解液在1：1.5 (w/v)料液比、室温条件下(4-30℃)淋醋24h，获得的保健荞麦原醋其总酸含量≥ 3.72％，建立了利用荞麦秸秆低聚木糖水解液淋醋工艺；
[0075]
(5)本研究首次建立了一种低聚木糖保健荞麦原醋核孔膜过滤澄清技术。研究中选用3μm孔径的核孔膜材料经过滤处理后荞麦香醋原液透明清亮，无任何肉眼可见的颗粒和悬浮物沉淀，且静止30天后仍透明清亮，无沉淀产生。而未经过滤处理的保健荞麦原醋中含有大量悬浮的谷物颗粒和一些其他发酵杂质，在静止24h后有肉眼可见的絮状沉淀产生。本研究中建立的核孔膜过滤澄清技术可推广应用至酱油等同类产品的加工生产中。
[0076]
保藏说明
[0077]
分类命名：长枝木霉lc-m4.21；
[0078]
保藏机构：中国普通微生物菌种保藏管理中心；
[0079]
保藏机构简称：cgmcc；
[0080]
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；
[0081]
保藏日期：2021年8月11日；
[0082]
保藏中心登记入册编号：cgmcc no:23206
附图说明
[0083]
图1为实施例1中长枝木霉抗阻遏高产纤维素酶突变菌株摇瓶复筛结果图。
[0084]
图2为实施例2中长枝木霉高产菌株lc-m4.21发酵产酶结果图。
[0085]
图3为实施例3中酶解液中低聚木糖含量高效液相色谱法检测结果图，其中a: 木二糖、木三糖、木四糖标准曲线；b:木二糖、木三糖、木四糖液相色谱图。
[0086]
图4为实施例4中芦丁标准曲线，横坐标：芦丁浓度(μg/ml)；纵坐标：吸光度(od
值)。
[0087]
图5为实施例7中低聚木糖荞麦香醋核孔膜过滤效果比较图。
具体实施方式
[0088]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0089]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0090]
实施例1、长枝木霉抗葡萄糖阻遏高产纤维素酶优良菌株双层平板筛选方法建立及菌株筛选
[0091]
(1)长枝木霉lc-m4菌株[dong my,wang sy,xu fq et al.efficient utilization of waste paper as an inductive feedstock for simultaneous production of cellulase and xylanase by t.longiflorum.journal of cleaner production,2021,308:127287.,dong my, wang sy,xu fq et al.pretreatment of sweet sorghum straw and its enzymatic digestion: insight into the structural changes and visualization of hydrolysis process.biotechnology for biofuels.2019,12:276.]孢子悬液重离子束辐照诱变：
[0092]
利用生理盐水将新鲜培养的长枝木霉lc-m4斜面上孢子洗下，通过4层无菌纱布过滤除去菌丝，得到的孢子滤液在装有玻璃珠的三角瓶中200rpm震荡10min，最后利用血球计数板将孢子浓度调整为1
×
106个/ml。将制备的孢子悬液吸取2ml装入 35mm辐照皿中，并用封口膜进行封口处理，重离子束辐照剂量为160gy，设三个平行，共3个样品。孢子悬液的辐照实验在近物所重离子加速器生物浅层tr4辐照终端完成，辐照离子种类为碳离子，能量80mev/u，剂量率为20gy/min。辐照处理后的孢子悬液样品立即进行甘油低温保存，以进行后续的突变株筛选。
[0093]
(2)长枝木霉抗葡萄糖阻遏高产纤维素酶优良菌株筛选
[0094]
①
双层平板筛选培养基：(下层14ml+上层14ml)/平板
[0095]
下层：加浓mandel’s营养盐培养基(g/l)：k2hpo
4 3.0g，(nh4)2so
4 2.0g， mgso4·
7h2o 0.5g，尿素0.5g，cacl
2 0.5g，feso4·
7h2o 0.005g，mnso4·
h2o 0.0016 g，znso4·
7h2o 0.0014g，cocl
2 0.002g，琼脂17g，ph自然。
[0096]
上层：加浓mandel’s营养盐培养基，微晶纤维素(mcc)10.0g/l，葡萄糖5.0g/l, 脱氧胆酸钠0.3g/l，琼脂17g/l，ph自然。(以上培养基中所用的化学试剂均为国产分析纯)
[0097]
②
双层平板法初筛：重离子束辐照诱变后的孢子悬液采用上述双层筛选平板通过水解圈法进行抗阻遏高产酶突变菌株的初筛。稀释至1
×
10
2-1
×
103个/ml孢子液吸取 100μl涂布于双层初筛平板，在30℃恒温培养箱中培养3d，培养结束后将生长有菌落的平板用革兰氏碘液染色，因为碘液可以与mcc反应生成蓝紫色化合物，但是不与葡萄糖反应，所以在菌落周围由于mcc被酶解而形成大小不一的水解圈。染色后用游标卡尺对透明圈和菌落直径进行测量，然后根据二者之比计算hc值，将hc值≥2.0的突变菌株保存于斜面继续摇瓶发
酵产酶筛选。
[0098]
③
液体摇瓶发酵产酶复筛：将平板初筛获得的高hc值菌株进行摇瓶复筛。吸取 2ml 1
×
106个/ml孢子悬液接种于摇瓶发酵种子培养基，在30℃、200rpm条件下培养24h，培养后将种子液以5％(v/v)的比例接种于摇瓶发酵产酶培养基，在30℃、 200rpm条件下培养8d，发酵后通过测定滤纸酶活进行高产酶突变菌株的复筛。
[0099]
摇瓶发酵种子培养基(g/l)：葡萄糖10g，蛋白胨5g，吐温-802ml，(nh4)2so
4 1.4g，cacl
2 0.3g，尿素0.3g，mgso4·
7h2o 0.3g，feso4·
7h2o 0.005g，mnso4·
h2o0.0016g，znso4·
7h2o 0.0014g，cocl
2 0.002g，ph自然。
[0100]
摇瓶发酵产酶培养基(g/l)：微晶纤维素20g，麸皮10g，玉米浆17g，k2hpo
4 2.0g，(nh4)2so
4 1.4g，mgso4·
7h2o 0.3g，尿素0.3g，cacl
2 0.3g，吐温-80 2ml， feso4·
7h2o 0.005g，mnso4·
h2o 0.0016g，znso4·
7h2o 0.0014g，cocl
2 0.002g，ph 自然值。(以上培养基中所用的化学试剂均为国产分析纯)
[0101]
(3)抗阻遏高产纤维素酶菌株筛选结果
[0102]
①
双层平板法初筛结果：通过双层平板法初筛，总共筛选获得31株hc值≥2.0 的长枝木霉抗阻遏高产候选菌株，其初筛统计结果如表1所示。
[0103]
表1.双层平板法初筛统计结果(hc值≥2.0)
[0104]
[0105][0106]
②
初筛菌株摇瓶发酵产酶复筛结果：将
①
中双层平板初筛获得的hc值≥2.0的 31株抗阻遏高产候选菌株进行液体摇瓶发酵产酶复筛，通过测定发酵液中滤纸酶活完成优良抗阻遏高产纤维素酶突变菌株的筛选，摇瓶复筛结果如图1所示。最终筛选出一株滤纸酶活较出发菌株lc-m4显著提高的优良抗葡萄糖阻遏纤维素酶高产突变菌株，命名为lc-m4.21。同时将长枝木霉lc-m4.21菌株在中国保藏管理委员会普通微生物(cgmcc)进行专利保藏，其保藏编号为：cgmcc no:23206，保藏日期为2021年8月11日。
[0107]
实施例2、长枝木霉抗阻遏高产菌株lc-m4.21液体发酵生产木聚糖酶和纤维素酶
[0108]
种子培养基配方：葡萄糖10g，蛋白胨5g，吐温-80 2ml，(nh4)2so
4 1.4g，cacl
2 0.3g，尿素0.3g，mgso4·
7h2o 0.3g，feso4·
7h2o 0.005g，mnso4·
h2o 0.0016g， znso4·
7h2o 0.0014g，cocl
2 0.002g，ph自然。
[0109]
发酵产酶培养基配方：微晶纤维素20g，麸皮10g，玉米浆17g，k2hpo
4 2.0g， (nh4)2so
4 1.4g，mgso4·
7h2o 0.3g，尿素0.3g，cacl
2 0.3g，吐温-802ml，feso4· 7h2o 0.005g，mnso4·
h2o 0.0016g，znso4·
7h2o 0.0014g，cocl
2 0.002g，ph自然值。以上培养基均在121℃条件下高压灭菌30min。(以上培养基中所用的化学试剂均为国产分析纯)
[0110]
用生理盐水将新鲜培养的长枝木霉高产菌株lc-m4.21斜面上的孢子洗下并调整浓度为1
×
106个/ml，吸取2ml接种于50ml(250ml三角瓶)种子培养基，在30℃、 200rpm条件下培养24h，培养后将种子液以5％(v/v)的比例接种于50ml(250ml 三角瓶)发酵产酶培养基，在30℃、200rpm条件下发酵8d，发酵结束后取上清液测定滤纸酶活(fpa)、内切酶活(cmc)和木聚糖酶活性。酶活力单位定义(iu/ml)：在测定条件下每分钟生成每微摩尔葡萄糖或木糖所需的酶量。
[0111]
长枝木霉高产菌株lc-m4.21发酵产酶结果如图2所示，发酵液中木聚糖酶活可达到350
±
0.39iu/ml，同时滤纸酶活和内切酶活也分别达到了5.6
±
0.05iu/ml和 10.84
±
0.82iu/ml，说明该长枝木霉高产菌株可同时表达分泌大量的木聚糖酶和纤维素酶，可用于荞麦秸秆低聚木糖的绿色工艺法直接酶解制备。
[0112]
实施例3、绿色工艺法直接酶解制备荞麦秸秆低聚木糖(该部分实验中用到的荞麦秸秆样品由甘肃万佳现代农牧业发展服务有限公司提供)。
[0113]
荞麦秸秆原料在105℃烘箱中烘干至恒重，采用粉碎机粉碎后过20目筛并用60 目筛截留，选用20-60目筛之间截留粒度的荞麦秸秆进行荞麦低聚木糖的酶解制备。准确称取1.0g荞麦秸秆样品于50ml离心管中，在50℃、200rpm条件下采用由长枝木霉抗葡萄糖阻遏高产菌株发酵生产的不同木聚糖酶负载量直接进行酶解制备，低聚木糖酶解制备中采用的料液比为1：10(w:v)，木聚糖酶负载量梯度为260、520、1000、 1600iu/g秸秆，在酶解12h、24h、36h、48h时分别取酶解上清液采用hplc进行低聚木糖含量的检测，并根据低聚木糖含量优化出最佳酶用量和酶解时间。
[0114]
低聚木糖含量的检测：酶解完成后的反应液在8000rpm条件下离心5min,取上清并检测酶解液中木二糖、木三糖、木四糖的含量。低聚木糖含量的检测采用hplc (ultimate 3000，termo，usa)进行检测。检测器采用示差折光检测器 (refractoma
×
520)，色谱柱为shodex sugar ks-802凝胶柱(内径8mm，柱长 300mm，粒度6μm)。检测条件为：
[0115]
流动相：水；
[0116]
流速：0.6ml/min；
[0117]
柱温：80℃；
[0118]
检测器温度：45℃；
[0119]
进样量：20μl；
[0120]
保留时间：20min。
[0121]
图3为低聚木糖含量高效液相色谱法检测，其中a:木二糖、木三糖、木四糖标准曲线；b:木二糖、木三糖、木四糖液相色谱图。
[0122]
低聚木糖成分中木二糖、木三糖和木四糖标准曲线如图3所示，其中木二糖标准曲线为y＝4.5009x-0.0127(r2＝0.9999),木三糖标准曲线为y＝5.1045x-0.0227 (r2＝0.9999),木四糖标准曲线为y＝4.4081x-0.0055(r2＝0.9999)。在低聚木糖的高效液相色谱检测中，其出峰顺序依次为木四糖(11.483min)、木三糖(12.147min)、木四糖(13.123min)，该结果表明用以上建立的低聚木糖高效液相检测条件和检测方法准确可靠，可用于荞麦低聚木糖含量的定量分析、检测及相关低聚木糖产品的质量控制。
[0123]
表2.荞麦低聚木糖绿色制备工艺优化结果
[0124][0125]
从表2荞麦低聚木糖绿色制备工艺优化结果中可以看出，在添加由长枝木霉抗葡萄糖阻遏高产菌株发酵生产的不同木聚糖酶直接进行荞麦秸秆低聚木糖酶解制备时，随着酶用量的增加其低聚木糖产量也逐渐上升，而在酶添加量为1000iu/g秸秆时其产量最高，但是酶量继续增加至1600iu/g时其低聚木糖得率反而降低，表明过量的木聚糖酶液可能降解了水解液中已将生成的部分低聚木糖成分，说明在以荞麦秸秆为原料制备低聚木糖时木聚糖酶用量不易过大，该结果表明不同酶添加量对荞麦低聚木糖的制备得率影响极显著。从不同酶解时间的优化结果中可以看出，在前36h的酶解中，低聚木糖的得率随酶解时间的增加而上升，而在36h之后随着酶解时间的增加其低聚木糖得率逐渐降低，推测其原因可能是木聚糖酶液降解了水解液中已经生成的部分低聚木糖成分。
[0126]
此外，根据中华人民共和国卫生部公告2008年第12号公告中指出低聚木糖作为食品原料其每天的摄入量≤1.2g/天，但是研究结果表明低聚木糖的每日有效最小摄取剂量为0.7～1.4g时具有很好的保健功效[崔燕,刘立存.低聚木糖特性及其应用[j].食品安全导刊,2017(19):60-61；尹利端，王立志，董丛超，低聚木糖在保健食品中的应用[j]. 农业
工程技术(农产品加工业),2008(06):29-31.；滕超，查沛娜，曲玲玉，肖林，焦章君，李秀婷，功能性寡糖研究及其在食品中的应用进展[j].食品安全质量检测学报,2014,5(01):123-130]。因此，综合荞麦低聚木糖绿色制备工艺优化中酶用量和酶解时间对制备得率影响及相关保健食品有效剂量要求，可以得出荞麦秸秆低聚木糖绿色工艺的最佳制备工艺技术参数为：在酶量为260iu/g的条件下酶解36h，其秸秆酶解液中低聚木糖含量为5.68mg/ml，该酶解液中低聚木糖浓度满足后续保健荞麦香醋的制备要求。
[0127]
实施例4、荞麦黄酮提取制备(该部分实验中用到的荞麦籽粒样品由甘肃万佳现代农牧业发展服务有限公司提供)。
[0128]
首先将荞麦籽粒粉碎，然后用60目筛进行过滤，过滤后的荞麦粉作为黄酮提取原料；准确称取1.0g荞麦样品于150ml三角瓶中，在30℃、150rpm条件下采用不同浓度的乙醇溶液进行黄酮的提取，黄酮提取中采用的料液比为1：5、1：10、1：20、 1：30(w:v)，乙醇浓度分别为50％、60％、70％、80％，在提取0.5h、1h、2h、3h 时分别取提取液采用芦丁法进行黄酮含量的检测，并根据黄酮含量优化出最佳提取工艺。
[0129]
芦丁标准曲线的制作：精密吸取芦丁对照品(0.2mg/ml70％乙醇)溶液1ml、 2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml，置于25ml量瓶中，再加1ml 5％nano2溶液，摇匀，放置6min，加入1ml 10％的al(no3)3溶液，摇匀，放置6min，再加入10ml 4％naoh溶液，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，静置15min，随行试剂做空白，于510nm波长处测定吸光度，得吸光度y与芦丁浓度x(μg/ml)绘制标准曲线(芦丁在8～48μg/ml范围内具有良好的线性关系)。
[0130]
提取液样品中黄酮含量测定：取0.5ml荞麦提取液按照同样方法测定样品总黄酮。荞麦黄酮得率(以芦丁计)，
[0131]
按照公式下式计算：
[0132]
y1(mg/g)＝(c*v*v0)/mv1
[0133]
式中：c为测试液黄酮浓度，mg/mlv为测试液总体积，ml；v0为提取液总体积，ml；m为样品质量，g；v1为提取液取样体积，ml。
[0134]
芦丁标准曲线为y＝0.2324x-0.0093,r2相关系数为0.9963，表明芦丁标准品浓度和吸光值线性拟合关系良好，此标准曲线(如图4所示)可用于样品中黄酮类化合物的定量计算。
[0135]
表3.荞麦籽粒中黄酮提取工艺优化
[0136][0137]
黄酮提取工艺优化结果如上表所示，在选择优化的料液比、提取时间和乙醇浓度三个因素中，对黄酮提取率影响最大的分别是提取时间》乙醇浓度》料液比。通过工艺优化，得出荞麦籽粒中黄酮的最佳提取工艺为料液比1：20、60％乙醇提取2h，得到 8.50mg/ml的黄酮含量。
[0138]
实施例5、利用低聚木糖水解液进行荞麦黄酮提取制备(该部分实验中用到的荞麦籽粒样品由甘肃万佳现代农牧业发展服务有限公司提供)。
[0139]
首先将荞麦籽粒粉碎，然后用60目筛进行过滤，过滤后的荞麦粉作为黄酮提取原料；准确称取1.0g荞麦样品于150ml三角瓶中，在30℃、150rpm条件下采用低聚木糖水解液,实施例3制得)进行黄酮的提取，黄酮提取中采用的料液比为1：5、1： 10、1：20、1：30(w:v)，在提取0.5h、1h、2h、3h时分别取提取液采用芦丁法进行黄酮含量的检测，并根据黄酮含量优化出最佳提取工艺。
[0140]
芦丁标准曲线的制作：精密吸取芦丁对照品(0.2mg/ml70％乙醇)溶液1ml、 2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml，置于25ml量瓶中，再加1ml 5％nano2溶液，摇匀，放置6min，加入1ml 10％的al(no3)3溶液，摇匀，放置6min，再加入10ml 4％naoh溶液，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，静置15min，随行试剂做空白，于510nm波长处测定吸光度，得吸光度y与芦丁浓度x(μg/ml)绘制标准曲线(芦丁在8～48μg/ml范围内具有良好的线性关系)。
[0141]
提取液样品中黄酮含量测定：取0.5ml荞麦提取液按照同样方法测定样品总黄酮。荞麦黄酮得率(以芦丁计)，
[0142]
按照公式下式计算：
[0143]
y1(mg/g)＝(c*v*v0)/mv1
[0144]
式中：c为测试液黄酮浓度，mg/mlv为测试液总体积，ml；v0为提取液总体积，ml；m为样品质量，g；v1为提取液取样体积，ml。
[0145]
芦丁标准曲线为y＝0.2324x-0.0093,r2相关系数为0.9963，表明芦丁标准品浓度和吸光值线性拟合关系良好，此标准曲线可用于样品中黄酮类化合物的定量计算。
[0146]
表4.荞麦籽粒中低聚木糖水解液黄酮提取工艺优化结果
[0147][0148]
荞麦黄酮的低聚木糖水解液提取优化结果如上表所示，当料液比从1：5增加至 1：30时，其黄酮提取率从0.101mg/ml降为0.056mg/ml。通过工艺优化，得出荞麦黄酮的低聚木糖水解液最佳提取工艺为：在料液比1：20提取3h时，得到0.10mg/ml 的黄酮含量。
[0149]
实施例6、酶法提取荞麦黄酮
[0150]
1.荞麦黄酮酶法提取工艺优化
[0151]
以粉碎的荞麦籽粒为原料，采用酶法提取工艺对荞麦籽粒中黄酮类化合物的提取工艺进行优化。在不同纤维素酶添加量下的提取条件为：提取温度：50℃；转速： 150rpm；料液比：1：20(含5％乙醇的低聚木糖水解液)；提取时间：1h,2h,3h。纤维素酶为长枝木霉lc-m4菌株发酵生产的粗酶液(实施例2制得)，纤维素酶添加量为： 2、4、6、8iu/ml。
[0152]
2.实验结果
[0153]
表5荞麦黄酮酶法提取
[0154][0155]
用酶法提取工艺进行荞麦黄酮提取时，在纤维素酶添加量为2iu/g底物、提取1h 的条件下其黄酮提取率最高，为3.27mg/g籽粒，较低聚木糖水解液荞麦黄酮提取最高为0.10mg/g(提取2h)高了30多倍，同时减少了提取时间。
[0156]
实施例7、荞麦低聚木糖保健香醋及荞麦低聚木糖、黄酮保健香醋制备及核孔膜过
滤工艺
[0157]
传统的淋醋工艺就是采用自来水直接对成熟醋醅进行淋醋，而本发明中采用荞麦低聚木糖提取液和荞麦低聚木糖、黄酮提取液进行淋醋，所以首先对荞麦保健香醋淋醋工艺进行优化，以提高淋醋效率和产品品质。
[0158]
本发明中利用荞麦秸秆低聚木糖提取液(实施例3最佳条件下制备)和荞麦低聚木糖、黄酮提取液(实施例6最佳条件下制备)直接进行成熟醋醅淋醋，对淋醋工艺中料液比和时间参数进行优化。淋醋工艺中料液比参数优化梯度为1：1、1：1.3、1： 1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.9、1：2和1：2.5(w/v)，淋醋时间优化梯度为 12h，18h，24h，30h，通过测定不同淋醋工艺条件下获得原醋的ph及总酸指标进行优化参数评价。
[0159]
表6淋醋料液比参数对原醋总酸含量和ph值的影响
[0160][0161]
不同淋醋工艺参数对原醋ph和总酸评价指标的影响如表6所示。从料液比优化结果中可以看出，当料液比为1：1时其总酸最高(5.08％)，随着用液量的增加其总酸逐渐降低，而且其ph值也随之升高，但是当料液比大于1：1.7时总酸含量为3.43％，其总酸值低于国标(gb/t 18187-2000酿造食醋)中规定得到总酸≥3.5％的要求，所以当料液比大于1：1.7时淋得的原醋不达标，同时料液比小于1：1时添加的液体无法将醋醅完全浸没，影响其原醋品质和风味，因此，利用荞麦秸秆低聚木糖水解液直接进行淋醋时的最佳料液比为1：1.4-1：1.6(w/v)。
[0162]
表7.淋醋时间参数对原醋总酸含量和ph值的影响
[0163][0164]
不同淋醋时间参数对原醋总酸含量和ph值的影响见表7。对于时间参数优化，淋醋时间为12h时，其总酸含量为3.21％，其总酸值也低于国标(gb/t 18187-2000 酿造食醋)中规定得到总酸≥3.5％的要求，所以淋醋时间小于12h时获得的原醋不达标，当淋醋时间在18-30h之间时，其总酸含量均在4％以上，而且在24h的淋醋时间下其总酸含量最高(4.26％)，所以其最佳淋醋时间为24h。
[0165]
表8.淋醋温度参数对原醋总酸含量和ph值的影响
[0166][0167]
不同淋醋温度参数对原醋总酸含量和ph值的影响见表8。对于温度参数优化，当淋醋温度在4℃至40℃区间内，其总酸含量均在3.5％以上，而ph在3.71以下，说明在4℃至40℃温度范围内均可进行荞麦秸秆低聚木糖水解液淋醋，开展低聚木糖荞麦保健香醋的生产制备。
[0168]
在最优淋醋工艺条件下淋出的低聚木糖保健荞麦香醋采用不同孔径核孔膜材料(此处所用的核孔膜材料为商业购置的，生产厂家为武威科近新发技术有限责任公司，商品名为核孔膜(孔径规格为2μm-3μm))进行过滤澄清处理，其过滤效果如图 5所示。未经过过滤处理的低聚木糖荞麦香醋原液中含有大量悬浮的谷物颗粒和一些其他发酵杂质，在静止一段时间后有肉眼可见的絮状沉淀产生(杨芙莲,翟小艳.荞麦醋的澄清研究[j].中国调味品,2015,40(07):96-99+103.)，但是经过核孔膜过滤处理的荞麦香醋原液透明清亮，无任何肉眼可见的颗粒和悬浮物沉淀，且静止30天后仍透明清亮，无沉淀产生。在本发明中选用的2μm和3μm两种孔径的核孔膜材料其过滤效果相当，但是2μm孔径的核孔膜材料由于孔径
较小，使得其过滤通量和效率较低。因此，在本发明中选用3μm孔径的核孔膜材料进行低聚木糖保健荞麦香醋产品的过滤处理。
[0169]
最后将核孔膜过滤、评价合格的低聚木糖保健荞麦香醋原液经过巴氏灭菌(加热至85-90℃维持30min)、罐装、封盖喷码、贴标等程序制备成125ml包装规格的荞麦香醋，即可获得具有保健功效的低聚木糖荞麦香醋产品(其中低聚木糖含量应保证 0.7-1.2g/125ml)。
[0170]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。