一种MccY重组整合工程菌及其构建方法与应用

一种mccy重组整合工程菌及其构建方法与应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，特别涉及一种mccy重组整合工程菌及其构建方法与应用。


背景技术：

2.近年来，抗生素的过度使用引发了很多问题，抗生素的耐药和多重耐药现象愈发受到关注。而在提出的替代方法中，天然抗菌剂有着极大的潜力，是下一代药物的有效材料。
3.小菌素(microcin，mcc)是低分子量、核糖体产生的、高度稳定的细菌抑制分子，是一种抗菌肽，参与肠道中肠杆菌科之间的竞争，具有热稳定性、耐酸性、以及对蛋白酶具有一定的抗性等显著优点。现已鉴定出大约15种小菌素，共分为两类，ⅰ类小菌素小于5kda，由质粒编码，ⅱ类小菌素约5～10kda，可分为质粒编码和染色体编码。不同的小菌素具有不同的抗菌机制，通过阻断靶细胞的重要功能从而达到抗菌的作用。与抗生素不同，它们通常在纳摩尔浓度下就具有活性。
4.目前对于小菌素的应用尚不普遍，研究较多的小菌素，如小mccj25等，抗菌谱较窄。最新发现的mccy拓宽了小菌素的抗菌谱，包括几种代表性的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌菌株，有着极大的替抗潜力。但是，目前mccy的研究尚停留在质粒表达的层面，如何实现微生态制剂，如何安全地利用并高效、持续地放大生产mccy还需要进一步探索。


技术实现要素：

5.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种mccy重组整合工程菌的构建方法。
6.本发明的另一目的在于提供所述方法构建得到的mccy重组整合工程菌。
7.本发明的再一目的在于提供所述mccy重组整合工程菌的应用。
8.本发明的目的通过下述技术方案实现：
9.一种mccy重组整合工程菌的构建方法，包括如下步骤：
10.(1)将sgrna片段与t载体连接，得到phsgrna质粒；其中，sgrna片段的核苷酸序列如seq id no.2所示；
11.(2)将pcas9质粒转化大肠杆菌，并制成感受态细胞；然后将优化后的mccy的修复片段和步骤(1)中得到的phsgrna质粒转入感受态细胞中，经培养、连续传代筛选消除双质粒(phsgrna质粒、pcas9质粒)的菌株，得到所述的mccy重组整合工程菌；其中，优化后的mccy的修复片段的核苷酸序列如seq id no.1所示。
12.步骤(2)中所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌mg1655。
13.步骤(2)中所述的感受态细胞通过本领域的常规方法制备得到，优选为通过如下方法制备得到：将pcas9质粒通过热激的方式转化大肠杆菌感受态细胞，然后加入培养基进行培养，培养后进行鉴定；再将鉴定正确的菌株接入培养基中，放大培养，取菌体，于冰上用
体积分数15％的甘油洗菌3～5次，制得感受态细胞。
14.步骤(2)中所述的培养基为lb培养基。
15.步骤(2)中所述的连续传代筛选消除双质粒通过如下方法实现：将转化后获得的重组菌株连续传代，挑取单菌落分别在含有30μg/ml氯霉素和100μg/ml氨苄青霉素的抗性平板、以及无抗生素的平板中进行穿刺筛选，找到对氯霉素和氨苄青霉素敏感的菌株，然后通过pcr 检测确认质粒丢失状态，筛选得到无质粒、无抗性基因的mccy重组整合工程菌。
16.所述的pcr检测所需的引物序列如下：
17.pcas9丢失检测引物：
18.上游引物：5
’‑
gagctggtgatatgggatag-3’；
19.下游引物：5
’‑
cattcatccgcttattatcac-3’；
20.phsgrna丢失检测引物：
21.上游引物：5
’‑
gagtgagctgataccgctcg-3’；
22.下游引物：5
’‑
cttcgctattacgccagctg-3’。
23.所述的平板为lb固体平板。
24.所述的mccy重组整合工程菌的构建方法，还包括进一步将步骤(2)中得到的mccy 重组整合工程菌利用引物进行pcr鉴定的步骤。
25.所述的pcr鉴定所需的引物序列如下所示：
26.hsds text-f：5
’‑
gccgaagagacggaagttgc-3’；
27.hsds text-r：5
’‑
ctcgcaggttacggtaagac-3’。
28.一种mccy重组整合工程菌，通过上述任一项所述的方法构建得到。
29.所述的mccy重组整合工程菌在制备小菌素mccy中的应用。
30.所述的mccy重组整合工程菌在制备小菌素mccy中的应用，为将上述mccy重组整合工程菌接种到培养基中进行培养，离心，取上清，得到小菌素mccy。
31.所述的培养的转速为150～300rpm/min；优选为200rpm/min。
32.所述的培养的温度优选为37
±
2℃。
33.所述的培养的时间为4小时以上；优选为4～24小时。
34.所述的mccy重组整合工程菌和/或通过所述的mccy重组整合工程菌表达的小菌素 mccy在制备抗菌剂方面的应用。
35.所述的菌为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中的至少一种；优选为鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、宋内志贺氏菌和痢疾志贺氏菌中的至少一种；更优选为对鼠伤寒沙门氏菌。
36.所述的大肠杆菌为大肠杆菌mg1655和大肠杆菌bl21中的至少一种。
37.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
38.1、本发明以大肠杆菌mg1655为基础菌株，利用crispr-cas9基因编辑技术，在基因组hsds处进行mccy的重组整合，具体步骤为：(1)参考ncbi基因库中mccy全基因序列，将mcya表达方向与mcybcd基因表达方向调整一致，并在前面插入启动子基因，整合进 pet28a(+)载体上，构建出有表达活性的mccy质粒；然后以此质粒为模板，通过pcr扩增构建出mccy修复片段；(2)通过pcr扩增得到sgrna片段，将sgrna片段与t载体无缝连接，构建出质粒phsgrna；(3)将pcas9质粒转入大肠杆菌，并制成感受态，将mccy修复片段和phsgrna质粒同时转入制备好的感受态，鉴定，得到含有质粒的mccy重组整合工程菌；(4)优化mcya，重复上
所示，mcya在seq id no.3第50bp～211bp，mcybcd在seq id no.3第227bp～4163bp，然后委托通用生物(安徽)股份有限公司将mccy序列整合进pet28a(+)载体上。构建出具有 mccy表达活性的质粒pet28a-mccy。
55.1.2扩增修复片段
56.以步骤1.1构建的质粒pet28a-mccy为模板，用表1中引物mccy扩增出带有mccy全基因的片段一；再以大肠杆菌mg1655的基因组为模板，用表1中上臂引物(上臂f、r)扩增出片段二，下臂引物(下臂f、r)扩增出片段三；然后以片段一、片段二、片段三为模板，以上臂f和下臂r为引物，扩增出mccy的修复片段。表2和表3分别为pcr反应体系和反应程序。
57.表1
[0058][0059]
表2pcr反应体系(25μl)
[0060]
成分用量(μl)2
×
master mix酶12.5h2o9.5上游引物1下游引物1模板1
[0061]
表3pcr反应程序
[0062][0063]
1.3构建phsgrna质粒
[0064]
以表4为引物(表4中的引物f/r有重复序列，即为引物也为模板)，表5为反应体系，表6 为pcr反应程序，扩增出sgrna片段。以表7为连接反应体系，将sgrna片段与t载体连接
(t 载体购自宝日医生物技术有限公司)，得到带有sgrna的质粒phsgrna。将质粒热激转化进 dh5α菌株中，抽质粒得到高浓度phsgrna质粒。其中，sgrna片段的序列(seq id no.4) 如下所示：
[0065]5’‑
ccctgatggctagctcagtcctagggattatgctagcatcttaactgaattacgtaagttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc-3’。
[0066]
表4
[0067]
引物名称序列sgrna-f5
’‑
ccctgatggctagctcagtcctagggattatgctagcatcttaactgaattacgtaagttttagagctagaaatagcaagtta-3’sgrna-r5
’‑
gcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctc-3’[0068]
表5sgrna的pcr反应体系(25μl)
[0069]
成分用量(μl)2
×
taq酶12.5h2o10.5上游引物1下游引物1
[0070]
表6sgrna的pcr反应程序
[0071][0072]
表7连接体系
[0073][0074]
1.4mccy重组整合工程菌的构建及鉴定
[0075]
通过热激转化将pcas9质粒(购自addgene)导入大肠杆菌mg1655感受态中：将5μl的pcas9 质粒加入mg1655感受态中混匀，冰浴30分钟，42℃水浴90秒，冰浴2分钟，加入1ml lb培养基放入200rpm/min的37℃摇床复苏两小时，涂板，鉴定。
[0076]
制备感受态：将鉴定正确的菌株接入100ml培养基中，37℃、200rpm/min摇床培养至 od600为0.8左右。取菌体，在冰上用15％(v/v)甘油洗菌3～5次，分装成10管，每管100μl，置于冰上备用。
[0077]
转化：分别加入5μl步骤1.2、1.3中构建出的mccy修复片段和phsgrna质粒到上述制备的感受态中，轻轻吹打混匀，将全部液体转移至电转杯中，电转。电转参数：电压1800v，电容25μf，电阻200ω，电转完立刻加入1ml lb培养基，混匀，转移至1.5ml离心管内，置于 200rpm/min的37℃摇床复苏2小时。涂板。置于37℃培养箱培养24小时。
[0078]
鉴定菌株：用表8引物进行pcr检测，扩增出大肠杆菌mg1655空菌株的大小为2500bp左右，mccy重组整合工程菌大小为7000bp左右，结果如图1所示：阳性转化板上随机挑取18个单菌落pcr，有1个为重组菌株，大小在7000bp左右。
[0079]
表8检测引物
[0080]
引物名称序列hsds text-f5
’‑
gccgaagagacggaagttgc-3’hsds text-r5
’‑
ctcgcaggttacggtaagac-3’[0081]
1.5检测鉴定正确的mccy重组整合工程菌活性
[0082]
1.5.1将鉴定正确的mccy重组整合工程菌接种于25ml lb培养基中，置于200rpm/min 的37℃摇床摇24小时，取1ml菌液，离心，去菌体保留上清，并用0.22μm过滤器过滤除菌，按2倍倍比稀释至32倍。
[0083]
1.5.2接种一环鼠伤寒沙门氏菌(菌种编号atcc 14028)到25ml lb液体培养基中， 200rpm/min的37℃摇床培养至od600为3左右。
[0084]
1.5.3融化琼脂的质量分数为1.5％的硬琼脂lb培养基，倒平板，约10ml/皿，开盖静置 15min至凝固。融化琼脂的质量分数为0.5％的软琼脂lb培养基，待软琼脂培养基冷却至45℃左右，往瓶中加入体积分数1％的鼠伤寒沙门氏菌菌液(1.5.2制备)，混匀后立刻倒入已倒好的硬琼脂上层，每皿约15ml，铺平，开盖静置15min至凝固。待凝固后，将平皿划分为6 等分的区域，分别在每等分表面点6μl上述1.5.1中倍比稀释后的上清，晾10min后倒置放入37℃恒温培养箱培养过夜，观察抑菌效果。
[0085]
1.5.4结果如图2所示，按照顺时针分别为1、2、4、8、16、32倍稀释上清的抑菌情况，到4倍稀释仍有微弱抑菌效果。
[0086]
1.6优化mccy基因序列
[0087]
优化mccy中mcya基因密码子，其序列如seq id no.5所示，然后委托通用生物(安徽)股份有限公司将优化后的序列整合进pet28a(+)载体上，构建得到质粒pet28a-mccy
ˊ
。
[0088]
以上述优化后的质粒pet28a-mccy
ˊ
为模板，重复步骤1.2～1.4，优化后的获得的扩增修复片段如seq id no.1所示；其中，构建phsgrna质粒时，以表9引物为模板，更改了sgrna 启动子，减少假阳性，更改后的sgrna片段的序列(seq id no.2)如下所示：
[0089]5’‑
ccttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagcatcttaactgaattacgtaagttttagagctagaaatagcaagttaaaataag gctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc-3’。
[0090]
表9
[0091]
引物名称序列sgrna-f5
’‑
ccttgacagctagctcagtcctaggtataatgctagcatcttaactgaattacgtaagttttagagctagaaatagcaagtta-3’sgrna-r5
’‑
gcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctc-3’[0092]
结果如图3所示，阳性转化板上随机挑取9个单菌落pcr，有7颗疑似为重组菌，大小在7000bp左右，但因为本底的影响，2500bp左右也有条带，无法确认。将这七颗单菌落转接，
再次pcr，结果如图4所示，7颗单菌落均为重组菌。
[0093]
重复步骤1.5，检测鉴定正确的7颗重组菌的抑菌活性，挑出抑菌活性最高的菌株。活性最高的重组菌株抑菌情况如图5所示，按照逆时针分别为1、2、4、8、16、32倍稀释上清的抑菌情况，可见稀释到16倍仍有微弱抑制。
[0094]
1.7消除双质粒
[0095]
1.7.1把步骤1.6鉴定出的活性最高的重组菌株在无抗生素的lb培养基中连续传代，挑取单菌落分别在含有抗生素(30μg/ml氯霉素、100μg/ml氨苄青霉素)和无抗生素的平板(lb 固体平板)中穿刺筛选，最终找到对氯霉素和氨苄青霉素敏感的菌株，通过pcr确认质粒丢失状态。pcas9丢失检测引物：上游引物5
’‑
gagctggtgatatgggatag-3’，下游引物5
’‑ꢀ
cattcatccgcttattatcac-3’。phsgrna丢失检测引物：上游引物5
’‑ꢀ
gagtgagctgataccgctcg-3’，下游引物5
’‑
cttcgctattacgccagctg-3’。最终得到无质粒、无抗性基因的mccy重组整合工程菌。
[0096]
1.7.2表达mccy
[0097]
将鉴定出的活性最高的mccy重组整合工程菌接种于100ml lb培养基中，不需要加抗生素和诱导剂，置于200rpm/min的37℃摇床摇24小时，分别在第4、8、12、16、20、24 小时各取2ml菌液，离心，去菌体保留上清，并用0.22μm过滤器过滤除菌，-20℃保存。
[0098]
1.7.3高压液相色谱法分析
[0099]
取1ml表达了24小时的mccy重组整合工程菌的上清，用超高压液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱联用仪(美国agilent公司，型号：uplc1290-6540bq-tof)检测上清中的mccy 的浓度。流动相a：100％乙腈，起始浓度5％(v/v)；流动相b：100％水加0.2％(v/v)甲酸，起始浓度95％(v/v)；柱温25℃；检测波长214nm；流速0.5ml/min；按照表10进行梯度洗脱。
[0100]
表10
[0101]
时间(min)a(％)b(％)205050309010351090
[0102]
结果如图6所示，质谱分析出现目标物质相一致的特征离子峰742.82，mccy成功在工程菌中表达并分泌，蛋白浓度为3.6mg/l。
[0103]
1.7.4检测不同表达时间的mccy重组整合工程菌的抗菌活性
[0104]
接种一环鼠伤寒沙门氏菌(菌种编号atcc 14028)到25ml lb液体培养基中，200rpm/min 的37℃摇床培养至od600为3左右。
[0105]
融化琼脂的质量分数为1.5％的硬琼脂lb培养基，倒平板，约10ml/皿，开盖静置15min 至凝固。融化琼脂的质量分数为0.5％的软琼脂lb培养基，待软琼脂培养基冷却至45℃左右，往瓶中加入体积分数1％的鼠伤寒沙门氏菌菌液，混匀后立刻倒入已倒好的硬琼脂上层，每皿约15ml，铺平，开盖静置15min至凝固。待凝固后，将平皿划分为6等分的区域，按照顺时针方向分别在每等分表面点6μl mccy重组整合工程菌所表达的第4、8、12、16、20、 24h上清(1.7.2制得)，晾10min后倒置放入37℃恒温培养箱培养过夜，观察抑菌效果。
[0106]
结果如图7所示，表达了4小时到24小时的上清均有抑菌圈，且随着时间的增加，抑
菌效果越明显。
[0107]
1.7.5定殖抑菌
[0108]
融化琼脂的质量分数为1.5％的硬琼脂lb培养基，在生物安全柜中倒平板，约10ml/皿，开盖静置15min至凝固，刮取一环1.7.1中筛选得到的mccy重组整合工程菌融于1ml无菌水中，混匀，吸取10μl戳进平皿中间的琼脂并缓缓打出，晾10min，放进37℃培养箱培养 24h后，取出，正置于生物安全柜中，开盖，紫外照射1h，杀死细菌，盖盖备用。
[0109]
融化琼脂的质量分数为0.5％的软琼脂lb培养基，待软琼脂培养基冷却至45℃左右，往瓶中按体积分数1％加入不同的指示菌，包括鼠伤寒沙门氏菌(菌种编号atcc 14028)、大肠杆菌mg1655(菌种编号atcc700926)、大肠杆菌bl21(购自neb)、宋内志贺氏菌(菌种编号atcc 25931)、痢疾志贺氏菌(菌种编号cmcc(b)51252)、福氏志贺氏菌(菌种编号 atcc 12022)、枯草芽孢杆菌(菌种编号atcc 6633)、金黄色葡萄球菌(菌种编号atcc29213)，混匀后立刻倒入上述紫外照射1h后的菌板上层，每皿约15ml，铺平，开盖静置15mins 至凝固，放进37℃培养箱培养24h。
[0110]
结果如图8所示，mccy重组整合工程菌定殖培养24h后，分泌出了大量mccy，能够抑制鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌mg1655、大肠杆菌bl21、宋内志贺氏菌、痢疾志贺氏菌的生长，形成了大小不一的抑菌圈。但对福氏志贺氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果不明显。
[0111]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。