一种靶向PD-L1的多肽、制备方法，组装形成纳米球及应用

本发明涉及生物材料和医药，具体涉及一种多肽及其应用，尤其涉及一种靶向pd-l1多肽、制备方法，组装形成纳米球及应用。

背景技术：

1、恶性肿瘤严重危害人类健康，尽管在手术、化疗和放疗等常规策略方面取得了进展，但其治疗仍面临着严峻的挑战。传统的治疗方法除了直接杀伤肿瘤细胞以外，也会对人体的正常组织造成不可逆的损伤，使得肿瘤患者在治疗过程中承受巨大的心理和生理痛苦，引发呕吐、脱发等不良反应，而且传统的治疗手段往往不能有效阻止肿瘤的复发，治疗效果不佳。因此，医学工作者希望寻求一种新的治疗方法来弥补传统治疗方法的不足。近年来，基础免疫学和肿瘤生物学的迅速发展，肿瘤免疫诊疗已获得了极大的突破。与传统的化疗、放疗以及手术疗法不同，肿瘤免疫疗法通过激活人体自身的免疫系统来杀死肿瘤细胞，具有持久性、特异性和安全性等诸多优点，被誉为癌症治疗的第三次革命，也被认为是攻克肿瘤的新希望。

2、肿瘤免疫疗法主要包括免疫检查点治疗、过继性免疫细胞疗法以及肿瘤疫苗等多种方法。过继性免疫细胞疗法存在花费昂贵、条件要求较高等局限性；肿瘤疫苗的免疫原性较低，常常需要配合合适的免疫佐剂联合使用，因此这两种方法仍有很大的进步空间。相比之下，免疫检查点阻断疗法由于在疗效方面的优势和定点靶向的较低副作用而成为人们关注的热点。免疫检查点是一类免疫抑制性的分子，可以降低免疫反应的强度，避免过度免疫，防止对正常组织造成损伤和破坏。然而癌症发展过程中也巧妙的利用了这一机制，在肿瘤细胞表面表达免疫检查点分子，从而造成免疫逃逸。免疫检查点阻断疗法通过免疫检查点抑制剂阻断免疫检查点与免疫细胞的通路，从而达到激活免疫系统的目的。目前已经发现了多个免疫检查点，如细胞毒性t细胞相关蛋白-4(ctla-4)、程序性死亡受体(pd-1)及其配体1(pd-l1)、t细胞免疫球蛋白和itim结构域蛋白(tigit)等。该疗法发展至今已有多种抑制剂药物上市或进入临床阶段并取得了令人满意的效果。如针对ctla-4检查点的ipilimumab和tremelimumab，以及作为pd-1抑制剂的pembrolizumab和nivolumab等。

3、目前免疫检查点抑制剂绝大多数以抗体为主，抗体具有抑制效率高，能够显著延长肿瘤患者生存期等优点，但其固有的免疫原性，分子量大、穿透能力弱、副作用大、制备复杂、价格昂贵等缺陷限制了其应用发展。

4、pd-l1参与了肿瘤的发生、发展过程，并协助肿瘤细胞逃避机体免疫系统的杀伤，与常规的靶蛋白不同，由于pd-l1特殊的结合位点，一直是免疫检查点抑制剂开发的难点。同抗体一样，多肽也是一种由20种氨基酸排列组合而成的化合物。但其分子量小、易于修饰合成、可设计调控、渗透性和穿透能力更好，且生物相容性高。因此，在基于分子识别的免疫抑制剂研发中具有非常重要的作用。此外，不同的氨基酸具有独特的理化性质，如带电性、亲疏水性以及手性等。这些不同性质的氨基酸分子之间通过脱水缩合形成多肽过程中按照排列顺序以及残基个数的不同，可产生蕴含丰富结构信息和识别信息的多肽链，这是其他分子所无法匹及的，多肽凭借其优势在肿瘤免疫、诊断等方面彰显出很强大优越性。小分子靶向多肽在体内动态环境中存在与靶点单价结合、不稳定、易被酶降解的困境，而多肽经过设计可通过自组装形成超分子纳米结构，如纳米管，纳米纤维和纳米球等。这些纳米组装体的形成一方面大大增加了其抗酶解性能，另一方面可作为载体高效运载抗肿瘤药物及成像试剂到达肿瘤位点实现多种方法联合诊疗。

5、基于多肽组装体的形态转变，多肽纳米载体也可以增加其在体内的循环时间，有效增强与靶向受体的亲和力。此外，多肽纳米结构的主动靶向能力促进了治疗剂在肿瘤部位的累积。多肽及其组装体已用于不同种类的癌症免疫治疗，迄今为止，已经开发了相当数量的多肽作为检查点阻断剂和癌症疫苗佐剂。许多临床研究发现基于多肽免疫阻断疗法具有显著调节免疫反应和抑制肿瘤生长的能力，证明了肽基生物材料作为疫苗佐剂增强抗原免疫应答或作为免疫治疗药物传递平台的潜力巨大。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是针对现有技术存在的不足提供了一种靶向pd-l1的多肽，特别是一种能分别与黑色素瘤、结直肠癌等肿瘤标志物pd-l1蛋白结合的多肽和由该肽衍生的且能与pd-l1蛋白结合的产品在制备抗癌药物或显像制剂中的用途。该多肽和荧光基团连接，靶向pd-l1肿瘤标志物，实现了体内无创成像；此外，该多肽与klvff短肽缀合能够自组装成纳米球，包载化疗药物或者免疫佐剂，制备成pd-l1多肽纳米化疗药物载药纳米系统。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种靶向pd-l1的多肽，该多肽能与pd-l1蛋白相结合，所述多肽包括氨基酸序列如下：

4、x1x2x3x4x5x6x7x8x9x10x11

5、其中x1、x2、x8、x11为疏水性氨基酸，x3、x4、x5、x6、x7、x9、x10为亲水性氨基酸。

6、进一步的，所述x1为苏氨酸、丝氨酸、色氨酸的一种；x2为丙氨酸、甲硫氨酸的一种；x3为精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺的一种；x4为谷氨酸、组氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的一种；x5为酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸的一种；x6为精氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺的一种；x7为脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸的一种；x8为丙氨酸、甲硫氨酸的一种；x9为组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺的一种；x10为谷氨酸、组氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的一种；x11为半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸的一种。

7、本发明所述的氨基酸残基可以是l-型，也可以是d-型，或者是l-、d-型的混合。

8、本发明中，采用氨基修饰的tentagel树脂作为固相载体，利用fmoc合成策略进行混合均分合成库容量为106的“一珠一物”肽库。利用微流控芯片的方法进行高通量肽库筛选，阳性肽珠经质谱鉴定，获得了一系列能特异性结合pd-l1的活性多肽。

9、作为优选技术方案，本发明所述的氨基酸序列如下所示：tareyrpahec。

10、一种多肽的制备方法，包括以下步骤：

11、以树脂作为固相载体，通过混合裂分的方法逐个将每个位置上的氨基酸偶联到载体上，通过裂解液将多肽在树脂上切除，分离纯化，即可得到所需多肽。

12、进一步的，所述多肽与klvff短肽缀合能够自组装成纳米球，包载化疗药物或者免疫佐剂，制备成pd-l1多肽纳米化疗药物载药纳米系统，作为肿瘤治疗药物或成像试剂载体的用途。

13、进一步的，所述肿瘤为pd-l1表达阳性的肿瘤。

14、进一步的，所述肿瘤为黑色素瘤、结直肠肿瘤、肝肿瘤、胃肿瘤、食道肿瘤、乳腺肿瘤、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤、非小细胞肺肿瘤和胆管肿瘤中的一种。

15、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

16、(1)本发明的多肽能对pd-l1表达阳性的细胞起靶向作用，选择性强，且本发明涉及的肽可以采用化学合成的方法制备得到，纯度高，特异性强，无免疫原性，安全可靠。弥补了现有技术中抗体药物制备繁琐、稳定性差等缺点。

17、(2)本发明的多肽具有靶向pd-l1表达阳性的细胞的特性，在实际应用中，还可以将该多肽与klvff短肽缀合，自组装成纳米球，包载化疗药物或者免疫佐剂，制备成pd-l1多肽纳米化疗药物载药纳米系统，作为肿瘤治疗药物或成像试剂载体的用途。

18、(3)pd-l1多肽介导的靶向纳米载体相比抗体用于免疫诊疗具有独特优势。多肽作为内源小分子，可通过特定的序列设计或者通过共价偶联特定序列形成规整有序的纳米结构。多肽功能化的纳米载体在肿瘤分子诊断和靶向治疗中具有重要应用价值，为黑色素瘤、结直肠癌等多种肿瘤的早期诊断、靶向治疗等提供了重要的实践基础，具有广阔的应用前景。