1.本发明属于生物
技术领域：
：，涉及一种从玻璃化冷冻囊胚中衍生荷斯坦牛胚胎干细胞的方法。
背景技术：
：：2.胚胎干细胞是从哺乳动物囊胚内细胞团中分离出来的多能性细胞，具有无限增殖、自我更新和分化成所有主要细胞系的能力。利用胚胎干细胞可以开展胚胎发生、组织分化、药物筛选、疾病模型建立、移植治疗、动物品种改良及转基因动物工程等科学研究，因此，胚胎干细胞在农业、生物及医学等领域具有巨大的应用潜力，是生命科学研究的热点和前沿领域。3.最先分离建系的动物胚胎干细胞是小鼠胚胎干细胞，由剑桥大学m.j.evans、m.h.kaufman和加利福尼亚大学gail.r.martin于1981年分别在nature和pnas上刊发其研究成果。随后，猕猴、人、大鼠的胚胎干细胞相继分离建系成功。2018年，bogliottiys从新鲜牛胚胎中分离建系牛的胚胎干细胞，成功建立了类似于episc的牛胚胎干细胞培养体系。这表明，利用牛胚胎干细胞结合全基因组选择构建体外育种模型成为可能，因此具有巨大的商业开发价值。尽管在体外能分离并衍生牛胚胎干细胞，但牛胚胎干细胞的建系效率仍然维持在30％左右，建系效率低；因此，解决胚胎干细胞建系效率低是实现奶牛体外育种的关键环节。4.目前现有的研究是从新鲜牛胚胎中进行胚胎干细胞分离。新鲜胚胎发育具有持续性和时效性，不同发育阶段的牛胚胎分离建系胚胎干细胞的效率和其多能性特征并不相同。因此，胚胎干细胞的建系效率和多能性特点与供体胚胎所处的阶段紧密相关。而基于体外育种用途的胚胎干细胞建系需要大量的胚胎个体，若利用新鲜囊胚开展体外育种的胚胎干细胞建系则需要在胚胎发育的特定时效内尽快的分离建系胚胎干细胞。当大量鲜胚用于胚胎干细胞建系时，不仅需要大量的人力和物力，还造成建系时效性紧迫，工作量极大等问题，必然会影响到胚胎干细胞的建系效率。利用冻胚开展奶牛胚胎干细胞建系可以尽快的将囊胚阶段的奶牛胚胎冷冻保存，批量化分离建系胚胎干细胞，可以大大解决鲜胚胚胎干细胞建系的诸多问题。但目前仍没有利用冷冻胚胎开展奶牛胚胎干细胞建系的技术研究。技术实现要素：5.本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种从玻璃化冷冻囊胚中衍生荷斯坦牛胚胎干细胞的方法。6.本发明的目的可通过以下技术方案实现：7.一种从玻璃化冷冻囊胚中衍生荷斯坦牛胚胎干细胞的方法，在以下复苏的荷斯坦牛玻璃化冷冻囊胚进行衍生的三个阶段分别使用特定的细胞培养液进行培养；第ⅰ阶段：分离囊胚内细胞团至贴附阶段，使用ⅰ型细胞培养液：改良mtesr培养基+8-10％fbs+10-15umy27632；第ⅱ阶段：内细胞团贴附至细胞传代阶段，使用ⅱ型细胞培养液：改良mtesr培养基+8-10％fbs；第ⅲ阶段：传代24h后细胞培养阶段。针对每个阶段制定特定的细胞培养液，使用ⅲ型细胞培养液：改良mtesr培养基+3-8％ksr；所述的改良mtesr培养基是以在mtesr1培养基的基础上添加终浓度为0.979mmgaba、0.984umpipecolicacid、0.98mmlicl、20ng/mlactivina、20ng/mlhumanfgf2、0.1mmβ-巯基乙醇和2.5μmiwr1配制而成。8.作为本发明的一种优选，所述的第ⅰ阶段步骤为：利用酸性台式液处理复苏扩展的冷冻囊胚，脱掉透明带，用ⅰ型细胞培养液将剩余囊胚细胞清洗干净，将囊胚细胞置于铺好饲养层的细胞培养板中，添加ⅰ型细胞培养液于37℃、5％co2培养箱中培养6天。9.作为本发明的进一步优选，所述的ⅰ型细胞培养液为改良mtesr培养基+10％fbs+10umy27632。10.作为本发明的一种优选，所述的第ⅱ阶段步骤为：待细胞贴附后，将细胞培养液更换为ⅱ型细胞培养液，继续培养3-5天使细胞团形成outgrowth，对outgrowth用tryple消化2-3min，加入dpbs终止消化，并用移液器轻轻吹打成小细胞团，离心去除上清，加入第ⅰ阶段培养液，吹打均匀后接种于mef饲养层上，放入37℃、5％co2培养箱中培养24h。11.作为本发明的进一步优选，所述的ⅱ型细胞培养液：改良mtesr培养基+10％fbs。12.作为本发明的一种优选，所述的第ⅲ阶段步骤为：将上一步传代24小时的细胞培养液更换为第ⅲ阶段培养液，细胞每天换液，继续培养3-5天，待细胞密度达70％时，用tryple消化，1:6传代。13.作为本发明的进一步优选，所述的ⅲ型细胞培养液：改良mtesr培养基+5％ksr。14.作为本发明的更进一步优选，包含步骤：15.第ⅰ阶段：利用酸性台式液处理复苏扩展的冷冻囊胚，脱掉透明带，用ⅰ型细胞培养液将剩余囊胚细胞清洗干净，将囊胚细胞置于铺好饲养层的24孔细胞培养板中，添加500ulⅰ型细胞培养液于37℃、5％co2培养箱中培养6天；24h后观察细胞贴附情况，对于48h内未贴附细胞团，利用30g无菌针头按压细胞团，辅助其贴附，第3天添加250ulⅰ型细胞培养液而不换液，以防止细胞贴附不牢被吸走；16.第ⅱ阶段：待细胞贴附后，将细胞培养液更换为ⅱ型细胞培养液，继续培养3-5天使细胞团形成outgrowth，对outgrowth用tryple消化2-3min，加入dpbs终止消化，并用移液器轻轻吹打成小细胞团，离心去除上清，加入第ⅰ阶段培养液，吹打均匀后接种于mef饲养层上，放入37℃、5％co2培养箱中培养24h；17.第ⅲ阶段：将上一步传代24小时的细胞培养液更换为第ⅲ阶段培养液，细胞每天换液，继续培养3-5天，待细胞密度达70％时，用tryple消化，1:6传代。18.作为本发明的一种优选，将体外培养的荷斯坦牛胚胎由桑椹胚发育至囊胚阶段时进行玻璃化冷冻，开展胚胎干细胞建系时，根据数量所需批次复苏冷冻囊胚，将复苏囊胚置于38℃、6％co2培养箱中培养，复苏扩展的冷冻囊胚用于第ⅰ阶段处理。19.有益效果：20.奶牛胚胎干细胞建系是奶牛体外育种模型建立的关键环节，其建系效率的高低及多能性维持的稳定性决定了体外育种模型的选育效率及成本。现有研究从新鲜胚胎中分离衍生奶牛胚胎干细胞，当供体胚胎数量大时，时效紧迫、建系效率低(30％)，无法满足体外育种的需要。本发明采用冷冻囊胚与胚胎干细胞衍生阶段特定培养液相结合，建立一种稳定的奶牛胚胎干细胞衍生体系，其囊胚粘附生成outgrowth的概率≥80％，胚胎干细胞建系效率≥50％。利用本发明，解决了利用鲜胚衍生奶牛胚胎干细胞时效紧迫的问题，提高了奶牛胚胎干细胞建系效率及稳定性，有助于高效建立体外育种模型，加快育种进程，降低育种成本，对奶牛新品种(系)培育具有重要的实践价值。附图说明21.图1：玻璃化冷冻囊胚复苏10h后的扩展囊胚。22.图2：脱透明带后的囊胚附着形成outgrowth；23.图3：传代后衍生的牛胚胎干细胞24.图4：牛胚胎干细胞碱性磷酸酶染色25.图5：免疫荧光染色检测多能因子表达具体实施方式26.下述实施例中提到的实验方法，如无特别说明均为常规方法。主要试剂mtesr(stemcell，05896)、y-27632(stemcell，72304)试剂购自江苏睿捷生物公司；gaba(a5835)、licl(746460)、pipecolicacid(p2519)试剂购自sigma生物公司；tryple(gibco，12563011)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；activina购自北京义翘神州科技股份有限公司；胚胎玻璃化解冻液购自济南远奇科技有限公司(origio，12295002f)。27.(一)细胞培养液配制28.1.改良mtesr培养基配制29.在mtesr1(货号05896)的基础上添加0.979mmgaba、0.984umpipecolicacid、0.98mmlicl、20ng/mlactivina、20ng/mlhumanfgf2、0.1mmβ-巯基乙醇和2.5μmiwr1，配制成改良mtesr培养基。30.2.ⅰ型细胞培养液：改良mtesr培养基+10％fbs+10umy27632；31.3.ⅱ型细胞培养液：改良mtesr培养基+10％fbs；32.4.ⅲ型细胞培养液：改良mtesr培养基+5％ksr。33.实施例134.(一)冷冻囊胚复苏35.玻璃化冷冻囊胚的解冻复苏采用四步法，胚胎玻璃化解冻液包含：1、2、3、4液。36.1.准备解冻液(试剂提前预热1液：37℃，2～4液：室温)和巴氏吸管；37.2.热台从显微镜上卸下，放在显微镜一侧，并打开热台；38.3.在两个大皿上分别做200微升小滴(液1单独做在一个皿上，做好后放在热台上，液2、3、4做在另一个皿上，放在室温下)；39.4.液1做的小滴，使用时从热台上拿到显微镜下使用，用完后再放到热台上保温；40.5.快速将冷冻载杆浸入液1中，计时1min，将胚胎从液1转入液2底部，计时3min；41.6.将胚胎从液2转入液3底部，计时5min；42.7.将胚胎从液3转入液4底部，换不同位置润洗胚胎；43.8.吸胚胎转移至胚胎培养液，置于38℃、6％co2培养箱中培养8h；玻璃化冷冻囊胚复苏10h后的扩展囊胚如图1所示。44.(二)胚胎干细胞建系及传代45.第ⅰ阶段：待囊胚扩展后(如图1所示)，利用酸性台式液处理扩展囊胚5分钟，脱掉透明带。用ⅰ型细胞培养液将剩余囊胚细胞清洗干净，将囊胚细胞置于铺好饲养层的24孔细胞培养板中，添加500ulⅰ型细胞培养液于37℃、5％co2培养箱中培养6天；24h后观察细胞贴附情况，对于48h内未贴附细胞团，利用30g无菌针头按压细胞团，辅助其贴附。第3天添加250ulⅰ型细胞培养液而不换液，以防止细胞贴附不牢被吸走。46.第ⅱ阶段：待细胞贴附后，将细胞培养液更换为ⅱ型细胞培养液，继续培养5天使细胞团形成outgrowth(如图2所示)。对outgrowth用tryple消化3min，加入dpbs终止消化，并用移液器轻轻吹打成小细胞团，1000g离心5min，去除上清，加入第ⅰ阶段培养液，吹打均匀后接种于mef饲养层上，放入37℃、5％co2培养箱中培养；47.第ⅲ阶段：细胞传代24小时后，将细胞培养液更换为第ⅲ阶段培养液，细胞每天换液，继续培养4天。待细胞密度达70％时(如图3所示)，用tryple消化，1:10传代。48.(三)多能性验证49.1.碱性磷酸酶检测50.弃掉细胞培养液，加入dpbs清洗细胞。加入4％多聚甲醛，室温固定15min；弃掉多聚甲醛，用dpbs清洗两次，每孔加入500μl的bcip/nbt染色工作液染液，室温避光染色15min-2h，弃掉染色液；加入dpbs清洗，蒸馏水终止染色，倒置显微镜下观察拍照。结果见图4。51.2.免疫荧光染色检测52.用500uldpbs缓慢清洗细胞3次，每次5min。加入200ul的4％多聚甲醛固定细胞，室温放置15～30min；用dpbs洗细胞3次，每次5min；0.5％tritonx-100通透20min，pbs洗3次，每次5min；封闭液封闭细胞1h；添加一抗(按照一抗稀释比例进行稀释)，4℃避光过夜；然后，用pbs清洗3次，每次5min；添加二抗(按照二抗稀释比例进行稀释)，室温避光孵育1h；pbs清洗细胞3次，每次5min；dpbs清洗细胞1次，每次5min；加200ul的hoechst33342避光染色5min，pbs清洗细胞，在荧光显微镜下观察拍照。结果见图5。53.(四)建系效率统计54.利用本发明方法复苏冻胚囊胚9枚，其附着生成outgrowth为8枚，囊胚附着生成outgrowth的概率为88％，利用outgrowth分离建系6株，胚胎干细胞建系效率为66.7％，显著大于已报道的鲜胚建系效率(表1所示)。55.表1不同复苏方法对牛胚胎干细胞建系效率的比较[0056]outgrowth生成率bescs建系效率本发明方法88％66.7％ctfr[1]-52％[0057]参考文献[0058][1]bogliotti,y.s.,wu,j.,vilarino,m.,okamura,d.,soto,d.a.,zhong,c.,sakurai,m.,sampaio,r.v.,suzuki,k.,izpisuabelmonte,j.c.,andross,p.j.(2018)efficientderivationofstableprimedpluripotentembryonicstemcellsfrombovineblastocysts.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica115,2090-2095。当前第1页12当前第1页12