GmGRF5-1及其编码蛋白在提高大豆种子蛋白质含量中的应用

gmgrf5-1及其编码蛋白在提高大豆种子蛋白质含量中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程领域，特别是涉及大豆光合作用相关基因、及其编码的蛋白在大豆品质改良中的应用。


背景技术：

2.利用转基因技术可以打破物种界限，对基因进行定向改造、重组和转移，在解决常规育种技术难以克服的产量、品质、多抗等性状协调改良方面发挥了重要作用。利用转基因技术对控制大豆品质形成关键基因进行定向操作，可大大加速优质大豆品种的选育进程，培育出适合不同消费需求的多样化大豆品种，对提高大豆的营养价值、保证大豆食品的安全性、增进居民健康有重要意义。
3.大豆作为最强的植物蛋白质供应体，为人类和牲畜提供了主要的蛋白质来源。利用转基因技术将可提高蛋白含量的基因转入商业化品种中，为全世界的牲畜和人类提供的蛋白质将显著增加，因为只要大豆中的蛋白质含量增加一个百分点，也将意味着多产生数百万吨蛋白质。
4.大豆种子中的蛋白按照生物学功能可分为贮藏蛋白、结构蛋白和防御相关蛋白三大类，其中以贮藏蛋白为主，它是人类食用最重要的植物性蛋白之一。贮藏蛋白主要由大豆球蛋白和与大豆伴球蛋白构成。迄今为止有七个编码大豆球蛋白的同源基因被克隆、测序，这七个基因分别为gy1、gy2、gy3、gy4、gy5、gy6、gy7(陈锦玲，2020)。其他有关调控大豆种子蛋白含量功能的基因的报道较少见。
5.生长调节因子(growth-regulating factor，grf)对植物的生长发育具有重要的调控作用。目前对grf的功能研究主要集中在拟南芥、水稻和玉米等植物中，前期对gmgrf5-1在调控大豆光合作用及产量方面的应用进行了专利申报，并获得授权。


技术实现要素：

6.本发明对gmgrf5-1进行进一步的深入研究。本发明发现 gmgrf5-1基因的过表达还可以提高大豆种子蛋白质的含量，因此本发明请求保护gmgrf5-1基因在大豆品质改良中的应用。
7.第一方面，本发明提供，大豆光合作用相关蛋白gmgrf5-1在提高种子蛋白质含量中的应用。
8.在本发明提供的应用中，所述大豆光合作用相关蛋白gmgrf5-1 的氨基酸序列如seq id no.1所示。
9.在本发明提供的应用中，所述大豆光合作用相关蛋白gmgrf5-1 基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
10.大豆光合作用属于营养生长阶段，营养生长和生殖生长的划分通常以花芽分化为界限，之前称为营养生长，之后属于生殖生长。但营养生长和生殖生长之间并无严格界限，有相当一段时间，营养生长和生殖生长是同时进行的，并且各方对营养物质存在明显的竞
争。
11.植物种子内油脂和蛋白质合成的生理过程十分复杂。尤其是蛋白质中含有多种氨基酸，多数氨基酸各有其合成通路，且涉及众多基因和酶的参与。油脂的组成和积累受脂肪酸合成途径中多种酶活性的影响，这些基因的表达还受到转录前、转录和转录后水平的调控，有许多相关基因参与此过程。因此，光合作用相关蛋白gmgrf5-1会对植物生殖生长后期种子蛋白质的合成或积累起到怎样的作用，是不可预料的。
12.第二方面，本发明请求保护含有seq id no.2所示基因的生物材料在提高种子蛋白质含量中的应用。
13.在本发明提供的，生物材料在提高种子蛋白质含量中的应用，所述生物材料为表达盒、载体、宿主细胞或宿主菌。
14.第三方面，本发明请求保护氨基酸序列如seq id no.1所示的大豆gmgrf5-1蛋白或核苷酸序列如seq id no.2所示的基因或含有 seq id no.2所示基因的生物材料在制备转基因植物中的应用，所述转基因植物为相对于野生型植物种子蛋白质含量升高的转基因植物。
15.第四方面，本发明提供一种制备种子高蛋白质含量的转基因植物的方法，在植物基因组中引入或过表达氨基酸序列如seq id no.1 所示的大豆gmgrf5-1蛋白的基因。
16.在本发明所提供的方法中，在植物基因组中引入或过表达核苷酸序列如seq id no.2所示的基因。
17.在本发明所提供的方法中，在植物基因组中引入或过表达核苷酸序列如seq id no.2所示的基因时，所用启动子分别为35s启动子、 gmgrf5-1基因自身启动子或cab3叶肉细胞特异启动子。
18.在本发明所提供的方法中，所述转基因植物为转基因大豆。
19.本发明的有益效果在于，本发明首次发现大豆光合作用相关基因 gmgrf5-1及其编码蛋白在提高大豆种子蛋白质含量中的应用。
20.本发明通过在植物中过表达gmgrf5-1基因提高种子蛋白质含量，种子中蛋白质含量可提升1.36％-1.89％。
21.因此，gmgrf5-1基因及其编码的蛋白用于植物的品质改良。
附图说明
22.图1为本发明大豆光合作用相关基因gmgrf5-1编码蛋白的氨基酸序列与拟南芥grf5基因编码蛋白的氨基酸序列的比较。
23.图2为本发明实施例2中的载体pgwcm结构示意图。
24.图3是本发明实施例2中中间载体fu76的结构示意图。
25.图4为本发明实施例3的植物表达载体psoy2的结构示意图。
26.图5为本发明实施例4中近红外光谱仪测定的大豆种子中蛋白质含量；其中tl代表：天隆1号；ws82代表威廉姆斯82。
27.图6为实施例5中大豆种子油脂含量结果图；其中tl代表：天隆1号；ws82代表：威廉姆斯82。
具体实施方式
28.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
29.若未特别指明，本发实施例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
30.实施例1大豆光合作用相关基因gmgrf5-1的克隆
31.分别利用正向引物5
’‑
atgatgagtgcaagtgcaagaa-3’(seqid no.3)和反向引物5
’‑
tcattcatcggtttggattctg-3’(seq id no.4)从大豆天隆1号(glycine max l.tianlong 1)中克隆并测序获得gmgrf5-1基因，其cds序列如seq id no.2所示；由其编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no.1所示。
32.pcr反应程序为:95℃5min预变性，94℃30s，55℃35s，72℃ 1min30s，25个循环，72℃10min延伸。
33.大豆光合作用相关基因gmgrf5-1的蛋白序列与拟南芥grf5 蛋白的氨基酸序列之间的相似性为42％。氨基酸序列比较见图1。
34.实施例2大豆光合作用相关基因gmgrf5-1的克隆载体
35.从实施例1中扩增获得的pcr产物直接按照ta克隆方法克隆到如图2所示的pgwcm载体上。先将pgwcm载体用ahd i内切酶水解后用凝胶回收试剂盒回收酶切产物以获得t载体。然后pcr产物和t载体于16℃进行连接，将连接产物转化大肠杆菌dh5α，并在其中扩增，筛选阳性克隆并测序。35s启动子/gmgrf5-1基因的启动子 /cab3启动子也通过酶切连接的方法连接至如图3所示的中间载体 fu76上。
36.实施例3大豆光合作用相关基因gmgrf5-1的植物表达载体
37.将从实施例2中得到的大豆光合作用相关基因gmgrf5-1的克隆载体、连接35s启动子/gmgrf5-1启动子/cab3启动子的中间载体与如图4所示的植物表达载体psoy2等比例混合后通过lr反应(质粒各50ng，lr酶1μl，补h2o至终体积5μl，混匀后25℃反应6小时以上)，将gmgrf5-1及三种启动子分别构建在psoy2上，用于在植物中过表达大豆光合作用相关基因gmgrf5-1，研究其功能。植物的转化方法采用农杆菌介导法进行。植物中的筛选标记为bar。
38.实施例4大豆光合作用相关基因gmgrf5-1提高种子蛋白质的含量
39.参照王侃等人(paz,m.,wang,k.soybean transformation andregeneration using half-seed explants.us patent#7,473,822(issuedjanuary 6,2009))的大豆转化方法获得35s过表达转基因大豆1个株系，自身启动子过表达转基因大豆gmgrf5-1-og共2个转基因株系， cab3过表达转基因大豆gmgrf5-1-oc共2个转基因株系。经近红外光谱仪测定的结果如图5显示大豆光合作用相关基因gmgrf5-1 转化大豆会导致大豆种子中蛋白质含量显著提高。
40.实施例5大豆光合作用相关基因gmgrf5-1与种子油脂含量的相关性
41.本实施例探究上述过表达转基因材料种子中油脂含量的变化。
42.本实施例针对实施例4得到的3种过表达转基因大豆 35s:gmgrf5-1:gfp、gmgrf5-1-og及gmgrf5-1-oc转基因株系，进行油脂含量的测定。
43.从测定结果中发现：如图6所示，三种转基因材料中，油脂含量均显著下降。
44.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。